Name: Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Scopri la sintesi di mRNA capato e non capato di luciferasi Gaussia per studi di trasfezione cellulare utilizzando cellule HeLa. Questo metodo ottimizza la produzione di RNA di alta qualità per l'espressione proteica.

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Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower

Le RNasi sono comunemente presenti sulla pelle, sui capelli, nella polvere, sulle superfici di laboratorio, nelle soluzioni, ecc. Indossare guanti e pulire accuratamente la superficie del bancone, le pipette, ecc. prima dell'uso per evitare contaminazioni da RNasi. Si raccomanda vivamente l'uso di puntali per pipetta, tubi, vetreria e reagenti privi di nucleasi.
1. Trascrizione in vitro utilizzando il kit T7 High-yield RNA Synthesis
Il modello di DNA per la reazione di trascrizione è un plasmide linearizzato contenente il gene della luciferasi di Gaussia e un promotore T7 a monte della sequenza codificante (Figura 1B).
<ol>
	<li>Scongelare i componenti del kit T7 High Yield RNA Synthesis e mantenerli sul ghiaccio.</li>
	<li>Per l'RNA non cappato, preparare la reazione a temperatura ambiente nel seguente ordine:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Volume (μl)</td>
			<td>Finale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqua priva di nucleasi*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampone di reazione 10X</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA stampo*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix di T7 RNA polimerasi</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Totale</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Aggiungere 1 μg di DNA e portare il volume totale della reazione a 20 μl con acqua priva di nucleasi. La quantità di acqua da aggiungere varierà in base alla concentrazione del DNA stampo.
<ol start="3">
	<li>Per l'RNA con cap: impostare la reazione a temperatura ambiente nel seguente ordine:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Volume (μl)</td>
			<td>Finale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acqua priva di nucleasi*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampone di reazione 10X</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (20 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analoghi di cap 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA) (40 mM)</td>
			<td>4</td>
			<td>8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA stampo*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix di T7 RNA polimerasi</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Totale</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Aggiungere 1 μg di DNA e portare il volume totale della reazione a 20 μl con acqua priva di nucleasi. La quantità di acqua da aggiungere varierà in base alla concentrazione del DNA stampo.
<ol start="4">
	<li>Mescolare accuratamente mediante vortex e incubare le reazioni a 37 °C per 2 ore in un incubatore ad aria secca.</li>
	<li>Utilizzando i passaggi 1.3-1.4, sintetizzare trascritti capped della luciferasi di Cypridina (CLuc) da un plasmide linearizzato contenente il gene CLuc. Questo mRNA verrà co-trasfettato con l'mRNA GLuc capped e uncapped per la normalizzazione dell'espressione di GLuc.</li>
</ol>
2. Rimozione del DNA stampo
Le reazioni di trascrizione vengono trattate con DNasi I per rimuovere il templato di DNA prima di procedere con la purificazione.
<ol>
	<li>Aggiungere 70 μl di acqua priva di nucleasi alle reazioni di trascrizione, seguiti da 10 μl di tampone di reazione per la DNasi I.</li>
	<li>Aggiungere 2 μl di DNasi I alle reazioni.</li>
	<li>Incubare a 37 °C per 15 minuti in un incubatore ad aria secca.</li>
</ol>
3. Purificazione su colonna di RNA con cap e senza cap
<ol>
	<li>Purificare l'RNA cap e non cap utilizzando il MEGAclearKit seguendo le istruzioni del produttore (può essere utilizzato qualsiasi kit di purificazione dell'RNA basato su colonnine centrifughe).</li>
	<li>Quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop.</li>
	<li>Valutare la qualità del campione di RNA seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando il kit Agilent RNA 6000 Nano e l'Agilent 2100 Bioanalyzer.</li>
</ol>
4. Aggiunta del cap all'RNA mediante il sistema di capping Vaccinia
<ol>
	<li>Prelevare 10 μg di mRNA di GLuc purificato senza cap. </li>
</ol>
Una reazione di cappuccio standard può cappare fino a 10 μg di RNA (100 nt o più lungo). Se è necessario cappare una quantità maggiore di RNA, la reazione può essere proporzionalmente aumentata.
<ol start="2">
	<li>Aumentare il volume fino a 15 μl utilizzando acqua priva di nucleasi.</li>
	<li>Riscaldare l'RNA a 65 °C per 10 minuti per rimuovere le strutture secondarie. Poi mettere sul ghiaccio per 5 minuti.</li>
	<li>Per preparare la reazione di capping, aggiungere 2 μl di 10X Capping Buffer, 1 μl di GTP (10 mM), 1 μl di S-adenosil metionina diluita al momento (2 mM) e 1 μl (10 unità) di enzima di capping vaccinico al campione di RNA denaturato di 15 μl.</li>
	<li>Mescolare accuratamente mediante leggero vortex e incubare la reazione a 37 °C per 30 minuti in un incubatore ad aria secca.</li>
</ol>
5. Purificazione su colonna dell'RNA cappato
<ol>
	<li>Purificare l'RNA cappato utilizzando il kit MEGAclear (può essere usato qualsiasi kit di purificazione dell'RNA basato su colonne a centrifugazione).</li>
	<li>Valutare la qualità del campione di RNA seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando il kit Agilent RNA 6000 Nano e l'Agilent 2100 Bioanalyzer.</li>
</ol>
6. Trasfezione di cellule HeLa utilizzando il kit di trasfezione TransIT mRNA
<ol>
	<li>Piastrellare cellule HeLa in una piastra a 48 pozzetti con 150 μl di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ad alto contenuto di glucosio, integrato con siero fetale bovino al 10% (0,7-2,3 × 105 cellule/pozzetto).</li>
	<li>Incubare per 16-24 ore a 37 °C in modo che le cellule raggiungano una confluenza del 60-90%.</li>
	<li>Diluire l'RNA di GLuc (cappuccio presente e assente) e di CLuc fino a una concentrazione di 100 ng/μl.</li>
</ol>
Ogni trasfezione viene eseguita in otto ripetizioni.
<ol start="4">
	<li>Preparare 8 provette Eppendorf tubi. Aggiungere a ciascun tubo 1 μl RNA di GLuc senza cap 1 μl RNA CLuc con cap (per la normalizzazione) e 25 μl di DMEM privo di siero. Mescolare bene.</li>
	<li>Preparare 8 provette eppendorf. Aggiungere a ciascuna provetta 1 μl RNA GLuc con cap (analoghi di cap), 1 μl RNA CLuc con cap (per la normalizzazione) e 25 μl di DMEM privo di siero. Mescolare bene.</li>
	<li>Preparare 8 provette eppendorf. Aggiungere a ciascuna provetta 1 μl RNA di GLuc con capVaccinia), 1 μl RNA CLuc con cap (per la normalizzazione) e 25 μl di DMEM privo di siero. Mescolare bene.</li>
	<li>Aggiungere 0.2 μl Aggiungere il reagente di potenziamento dell'mRNA al primo set di 8 provette e mescolare.</li>
	<li>Aggiungere 0.2 μl TransAggiungere il reagente per mRNA IT al primo set di 8 tubi e mescolare.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 2-5 minuti. (Non incubare per più di 5 minuti).</li>
	<li>Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia nei pozzetti contenenti colture cellulari di HeLa (fare riferimento Figura 3 per l'allestimento della piastra).</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 7 a 10 con il 2nd e 3rd gruppi di 8 provette</li>
	<li>Incubare tutta la notte (16 ore) a 37 °C in 5% CO₂2.</li>
</ol>
7. Saggio della luciferasi di Gaussia (GLuc)
Dosare il sopernatante di ogni pozzetto per l'attività di GLuc utilizzando il kit BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit come segue:
<ol>
	<li>Preparare una soluzione d'assay fresca aggiungendo 15 μl di BioLux GLuc Substrate a 1,5 ml di BioLux GLuc Assay Buffer (sono necessari 50 μl di soluzione d'assay per campione). Prepararne una quantità sufficiente per i campioni e per la preparazione dell'iniettore del luminometro (consultare le istruzioni del produttore).</li>
	<li>Mescolare accuratamente capovolgendo il tubo diverse volte (non vortexare).</li>
</ol>
La luminescenza viene misurata utilizzando il luminometro per micropiastre Centro LB 960 di Berthold Technologies.
<ol start="3">
	<li>Impostare il luminometro su un volume di iniezione di 50 μl e un'integrazione di 2-10 secondi.</li>
	<li>Aggiungere 10 μl del surnatante della coltura cellulare di ogni pozzetto in una piastra nera a 96 pozzetti.</li>
	<li>Priming dell'inalatore con la soluzione per il saggio ed esecuzione della misurazione della luminescenza.</li>
	<li>I valori ottenuti dai pozzetti non trasfettati verranno utilizzati come controlli negativi.</li>
</ol>
8. Saggio della luciferasi di Cypridina (CLuc)
Dosare il sopernatante di ogni pozzetto per l'attività di CLuc utilizzando il kit BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit come segue:
<ol>
	<li>Preparare il substrato ricostituito fresco (100x) seguendo le istruzioni fornite nel manuale del kit.</li>
	<li>Scongelare il BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer e mescolare accuratamente (proteggere dalla luce).</li>
	<li>Per preparare la soluzione per il saggio CLuc, aggiungere 15 μl di substrato ricostituito (100x) a 1,5 ml di BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer (sono necessari 50 μl di soluzione per saggio per campione). Preparare una quantità sufficiente per i campioni e per la preparazione dell'iniettore del luminometro (consultare le istruzioni del produttore).</li>
	<li>Mescolare accuratamente capovolgendo il tubo diverse volte (non vortexare).</li>
	<li>Mantenere la soluzione a temperatura ambiente per 30 minuti (proteggere dalla luce).</li>
</ol>
La luminescenza viene misurata utilizzando il luminometro per micropiastre Centro LB 960 di Berthold Technologies.
<ol start="6">
	<li>Impostare il luminometro su iniezione di 50 μl, ritardo di 1-2 secondi e integrazione di 2-10 secondi.</li>
	<li>Aggiungere 10 μl del surnatante della coltura cellulare da ogni pozzetto in una piastra nera a 96 pozzetti.</li>
	<li>Priming dell'inalatore con la soluzione del saggio CLuc e misurazione della luminescenza.</li>
	<li>I valori ottenuti dai pozzetti non trasfettati verranno utilizzati come controlli negativi.</li>
</ol>
9. Risultati rappresentativi
Il kit T7 High Yield RNA Synthesis può produrre fino a 180 μg di RNA non cappucciato e da 40 a 50 μg di RNA cappucciato per ogni reazione da 20 μl. Quando analizzato con l'Agilent 2100 Bioanalyzer, un RNA di buona qualità e integro deve mostrare un singolo picco netto che rappresenta il trascritto di RNA. Un picco largo o la presenza di picchi multipli indica una degradazione dell'RNA. È inoltre importante verificare la dimensione dell'RNA. Trascritti di RNA più lunghi del previsto possono essere dovuti a una digestione incompleta del DNA plasmidico del template. La degradazione dell'RNA e rese inferiori sono solitamente il risultato di contaminanti introdotti nella reazione dal DNA del template. Figura 2 mostra un esempio di elettroferogramma e immagine del gel ottenuti dopo l'analisi di RNA di alta qualità e integro sull'Bioanalyzer.
La trasfezione di cellule HeLa con RNA di GLuc sia cappucciato che non cappucciato è seguita da incubazione e saggio dei supernatanti delle colture cellulari per l'attività della luciferasi. La struttura del cap 5' è importante per proteggere l'RNA dalla degradazione da parte delle esonucleasi8 e per favorire l'inizio della traduzione dell'mRNA9. Pertanto, il cappuccio dell'RNA è un passaggio essenziale per esperimenti di trasfezione. Il metodo co-trascrizionale (analogo del cap) produce circa 40 μg di RNA con un cappuccio nell'80%. Il protocollo che utilizza l'enzima di cappuccio vaccinico cappuccia fino a 10 μg di RNA (100 nt o superiore) per reazione con un'efficienza quasi del 100%.
Figura 4 mostra la differenza nell'espressione della luciferasi tra colture trasfettate con campioni di RNA cappucciato e non cappucciato. È chiaramente visibile che le colture cellulari trasfettate con RNA cappucciato mostrano un'espressione della luciferasi molto più elevata rispetto a quelle trasfettate con RNA non cappucciato (che non mostrano alcuna attività della luciferasi). Inoltre, Figura 4 conferma che entrambe le tecniche di cappuccio, utilizzando un analogo del cap o l'enzima di cappuccio vaccinico, producono con successo trascritti di RNA cappucciati e funzionali, traducibili in proteine. Il valore p a due code ottenuto dal test t era 0,2583, il che indica che non vi è alcuna differenza statistica significativa tra i dati di luminescenza ottenuti con i due metodi di cappuccio.
<img alt="Diagramma della trascrizione T7; stampo di DNA, trascritto di RNA; processo della sequenza di nucleotidi." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 1.">
Figura 1A. Sintesi dell'RNA da parte della RNA polimerasi T7
 
<img alt="Schema della mappa del plasmide pCMV-GLuc, 5764 bp; espressione genica, vettori di clonaggio, siti di restrizione." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2."> 
Figura 1B. Vettore pCMV-GLuc contenente il gene GLuc e il promotore T7.
 
<img alt="Risultati della cromatografia dell'RNA; analisi di RNA con e senza cap; grafico di elettroforesi." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2."> 
Figura 2. Elettroferogrammi del Bioanalyzer e immagine simile a gel di RNA con e senza cap. L'asse X rappresenta la dimensione dell'RNA in nucleotidi (nt) e l'asse Y rappresenta le unità di fluorescenza (FU). A) Elettroferogramma dell'mRNA di GLuc (senza cap) dopo la purificazione. B) Elettroferogramma dell'mRNA di GLuc (con cap, utilizzando l'enzima di capping Vaccinia). C) Elettroferogramma dell'mRNA di GLuc (con cap aggiunto co-trascrizionalmente utilizzando un analogo di cap). D) Immagine simile a gel generata dal Bioanalyzer. La corsia 'L' è la scala di RNA, la corsia 1 è l'mRNA di GLuc senza cap, la corsia 2 è l'mRNA di GLuc con cap ottenuto mediante analogo di cap e la corsia 3 è l'RNA di GLuc con cap ottenuto mediante enzima di capping Vaccinia.
 
<img alt="Diagramma della disposizione delle pozzette per l'esperimento di espressione genica; tipi di campione: GLuc e CLuc con e senza cap." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 3."> 
Figura 3. Esempio di configurazione della piastra per la trasfezione di cellule HeLa. Ogni pozzetta contiene cellule HeLa seminate con una confluenza del 60-90%. Alla singola pozzetta viene aggiunta la miscela di trasfezione, composta dall'RNA di GLuc appropriato (senza cap, con cap aggiunto tramite analogo del cap o con enzima di cappucciatura del virus della Vaccinia), RNA di CLuc con cap (per la normalizzazione), Reagente mRNA Boost e Reagente TransIT mRNA. Ogni trasfezione viene eseguita in 8 ripetizioni (pozzette dello stesso colore nella figura).
 
 
<img alt="Grafico a barre della luminescenza normalizzata; RNA di GLuc con cap e senza cap; risultati dell'analisi dell'RNA" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4."> 
Figura 4.Espressione di GLuc in cellule HeLa. L'mRNA di GLuc purificato con cap e senza cap è stato trasfettato in cellule HeLa e incubato tutta la notte (16 ore) a 37 °C. I supernatanti delle colture cellulari di ogni pozzetto sono stati sottoposti a saggio per l'attività di GLuc e CLuc e i valori di luminescenza sono stati registrati. I valori di luminescenza di GLuc sono stati normalizzati rispetto ai valori di luminescenza dell'RNA di CLuc con cap.
<img alt="Formula del rapporto di luminescenza GLuc, misurazione della luminescenza, equazione per valori normalizzati, RLU." src="/files/ftp_upload/3702/3702eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equazione 1">
* La luminescenza delle cellule non trasfettate è stata sottratta dai valori di GLuc e CLuc prima della normalizzazione.
 
Marchi registrati
BioLux è un marchio registrato di New England Biolabs, Inc.
TransIT è un marchio registrato di Mirus Bio LLC.
MEGAclear è un marchio registrato di Ambion.

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</ol>

Tutti gli autori sono dipendenti di New England Biolabs, Inc.

La trascrizione in vitro è un metodo utile per ottenere elevate rese di RNA per diverse applicazioni. Il principale vantaggio dell'utilizzo del Kit T7 per la Sintesi di RNA ad Alta Resa è che la sua formulazione è stata ottimizzata per raggiungere alte rese di RNA. Inoltre, i reagenti forniti nel kit sono privi di nucleasi contaminanti, consentendo la sintesi di trascritti di RNA di alta qualità e integri. Il kit è progettato per garantire elevata stabilità e flessibilità, in modo da poter essere utilizzato per la sintesi di mRNA, RNA marcati con coloranti, sonde radiomarcate ad alta attività specifica e RNA cappucciati. Il manuale del kit include un elenco di protocolli specifici e dei materiali aggiuntivi necessari per ciascuna di queste applicazioni. Fornisce anche informazioni tecniche sull'uso di prodotti di PCR e oligonucleotidi di DNA sintetici come template per la trascrizione. È importante notare che il kit di trascrizione può utilizzare esclusivamente template di DNA contenenti un promotore T7.
Il metodo descritto in questo articolo illustra la cappatura post-trascrizionale dell'RNA mediante l'enzima di cappatura del virus vaccinico, nonché la cappatura co-trascrizionale utilizzando un analogo della struttura del cap dell'RNA. Abbiamo dimostrato che entrambi i metodi sintetizzano RNA cappato funzionalmente attivo dopo la trasfezione. La struttura del cap 5' migliora la stabilità dell'RNA e l'efficienza di traduzione, ed è quindi importante per esperimenti di microiniezione11 e trasfezione7. Il metodo di cappatura co-trascrizionale genera 40-50 μg di RNA cappato al ~80%. È importante notare che l'utilizzo dell'analogoo del cap 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA), che è bloccato sull'ossidrile 3' del m7G, garantisce l'inserimento del cap nell'orientamento corretto17. Per cappare quantità maggiori di RNA, è possibile aumentare la scala delle reazioni standard per entrambi i metodi di cappatura. Tuttavia, l'utilizzo del Sistema di Cappatura Vaccinico rappresenta un'opzione più vantaggiosa dal punto di vista economico, poiché la cappatura co-trascrizionale richiede l'analogoo del cap, un componente relativamente costoso. Il Sistema di Cappatura Vaccinico è inoltre un metodo migliore, in quanto presenta un'efficienza di cappatura quasi del 100%.
I metodi di cappuccio dell'RNA descritti sopra sintetizzano RNA con una struttura di cap 0 all'estremità 5'. La struttura di cap 1 prevede un'ulteriore metilazione nella posizione 2'-O dello zucchero ribosio del primo nucleotide all'estremità 5' dell'RNA. Si è riportato che la struttura di cap 1 migliora l'efficienza della traduzione dell'RNA18 e può essere introdotta utilizzando la 2'-O-metiltransferasi20, 21.
Il metodo descritto in questo articolo può essere utilizzato per trascrivere, aggiungere il cap e trasfettare qualsiasi mRNA desiderato. Le luciferasi GLuc e CLuc sono state utilizzate specificamente in questo protocollo grazie ai numerosi vantaggi offerti. Queste proteine vengono infatti secrete direttamente nel mezzo cellulare, evitando così la necessità di lisare le cellule. Inoltre, generano un'intensa emissione di bioluminescenza e i saggi di attività sono altamente sensibili e semplici da eseguire. È importante notare che l'espressione di GLuc nelle cellule può essere influenzata da diversi fattori non legati alla funzionalità dell'RNA stesso. Alcuni esempi includono errori di pipettaggio, numero variabile di cellule per pozzetto, efficienza di trasfezione, ecc. La normalizzazione dei dati viene effettuata per tenere conto di questi fattori. Nel nostro protocollo, co-trasfettiamo l'RNA di CLuc come controllo interno insieme all'RNA di GLuc. Quando il segnale di luminescenza di GLuc viene diviso per i valori del controllo CLuc, viene normalizzato rispetto agli errori e alla variabilità della trasfezione19.

<table><tbody><tr><td>Kit per la Sintesi di RNA ad Alto Rendimento T7</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-0-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;Struttura analogica del cap RNA </td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (priva di RNasi)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di Capping del Vaccinia</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spettrofotometro</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trans&lt;/em&gt;Kit per la trasfezione di mRNA IT </td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2250</td><td></td></tr><tr><td>HyClone* Mezzi Liquidi Classici: Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Mezzo, Glucosio Alto</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30285.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Aminoacidi non essenziali</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Centro LB 960 </td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLux&lt;em&gt; Gaussia&lt;/em&gt; Kit per saggio della luciferasi</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300S</td><td></td></tr><tr><td>BioLux &lt;em&gt;Cypridina&lt;/em&gt; Kit per saggio della luciferasi</td><td>New England Biolabs</td><td>E3309S</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore di RNasi, murino </td><td>New England Biolabs</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore di RNasi, Placenta Umana</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-GLuc Plasmide Control</td><td>New England Biolabs</td><td>N8081</td><td></td></tr></tbody></table>

trascrizione in vitro e tappatura mrna luciferase gaussia seguito da cellule hela transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

La trascrizione in vitro è la sintesi di trascritti di RNA da parte della RNA polimerasi a partire da un modello lineare di DNA contenente la sequenza del promotore corrispondente (T7, T3, SP6) e il gene da trascrivere (Figura 1A). Una tipica reazione di trascrizione comprende il DNA stampo, la RNA polimerasi, i tri-fosfati di ribonucleoside, un inibitore della RNasi e un buffer contenente ioni Mg2+.
Grandi quantità di RNA di alta qualità sono spesso necessarie per una varietà di applicazioni. L'uso della trascrizione in vitro è stato riportato in studi sulla struttura e funzione dell'RNA, come lo splicing1, esperimenti di RNAi in cellule di mammifero2, amplificazione di RNA antisenso mediante il "metodo Eberwine"3, analisi con microarray4 e studi sui vaccini a base di RNA5. La tecnica può inoltre essere utilizzata per produrre sonde marcate con radioisotopi o con coloranti6. Warren, et al. hanno recentemente descritto il riprogrammamento di cellule umane mediante trasfezione con RNA capped trascritto in vitro7. Il T7 High Yield RNA Synthesis Kit di New England Biolabs è stato progettato per sintetizzare fino a 180 μg di RNA per ogni reazione da 20 μl. Utilizzando questo kit, è stato possibile trascrivere con successo RNA fino a 10 kb di lunghezza. DNA plasmidico linearizzato, prodotti di PCR e oligonucleotidi di DNA sintetici possono essere utilizzati come stampi per la trascrizione, purché contengano la sequenza del promotore T7 in posizione upstream del gene da trascrivere.
L'aggiunta di una struttura di cap all'estremità 5' dell'RNA è un processo importante nei eucarioti. È essenziale per la stabilità dell'RNA8, la traduzione efficiente9, il trasporto nucleare10 e lo splicing11. Il processo prevede l'aggiunta di un cap di 7-metilguanosina all'estremità trifosfato 5' dell'RNA. La cappatura dell'RNA può essere eseguita post-trascrizionalmente mediante enzimi di cappatura o co-trascrizionalmente usando analoghi del cap. Nel metodo enzimatico, l'mRNA viene cappato utilizzando l'enzima di cappatura del virus della Vaccinia12,13. L'enzima aggiunge un cap di 7-metilguanosina all'estremità 5' dell'RNA utilizzando GTP e S-adenosil metionina come donatori (struttura cap 0). Entrambi i metodi producono RNA cappato funzionalmente attivo, adatto a trasfezione o altre applicazioni14 come la generazione di RNA genomico virale per sistemi di genetica inversa15 e studi cristallografici di proteine leganti il cap, come eIF4E16.
Nel metodo descritto di seguito, il T7 High Yield RNA Synthesis Kit di NEB viene utilizzato per sintetizzare trascritti di RNA capppati e non capppati della luciferasi di Gaussia (GLuc) e della luciferasi di Cypridina (CLuc). Una porzione dell'RNA di GLuc non cappato viene cappata utilizzando il Vaccinia Capping System (NEB). Viene utilizzato come modello un plasmide linearizzato contenente il gene di GLuc o CLuc e un promotore T7. L'RNA trascritto viene trasfettato in cellule HeLa e i surnatanti delle colture cellulari vengono sottoposti a saggio per l'attività della luciferasi. L'RNA di CLuc cappato viene utilizzato come controllo interno per normalizzare l'espressione di GLuc.

Questo metodo descrive la sintesi in vitro ad alto rendimento di RNA messaggero sia con cap che senza cap, a partire da un plasmide linearizzato contenente il gene della luciferasi da Gaussia (GLuc). L'RNA viene purificato e una frazione dell'RNA senza cap viene cappata enzimaticamente utilizzando l'enzima di cappatura del virus della Vaccinia. Nell'ultima fase, l'mRNA viene trasfettato in cellule HeLa e i supernatanti delle colture cellulari vengono sottoposti a saggio per l'attività della luciferasi.

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

La trascrizione in vitro è la sintesi di trascriti di RNA da parte della RNA polimerasi a partire da uno stampo di DNA lineare contenente la corrispondente sequenza del promotore...

L'obiettivo generale di questa procedura è trasfettare cellule HeLa con mRNA cappucciato e non cappucciato, trascritti della gal luciferasi, e sottoporre la coltura cellulare a saggio per l'attività della luciferasi. Questo viene ottenuto utilizzando innanzitutto il kit di sintesi RNA T seven ad alto rendimento per sintetizzare tramite trascrizione in vitro sia mRNA non cappucciato che cappucciato, trascritti della luciferasi Gaia. Vengono dimostrati due metodi di cappucciamento dell'mRNA.Un metodo utilizza un analogo del cap durante la trascrizione, mentre l'altro impiega l'enzima vaccinia di cappucciatura per la cappucciatura post-trascrizionale. Il passo successivo consiste nel trasfettare i trascritti di mRNA cappucciati e non cappucciati in cellule heli. Infine, l'attività della luciferasi derivante da mRNA cappucciato o non cappucciato viene confrontata nella coltura cellulare heli super denominata.Il vantaggio principale di questo metodo rispetto all'allestimento di una propria reazione di trascrizione è che il kit di sintesi RNA ad alto rendimento T seven è stato testato e ottimizzato per produrre trascritti di RNA a lunghezza intera con un rendimento elevato e, cosa più importante, di alta qualità. Questo aspetto è estremamente importante per una traduzione dell'RNA riuscita e per l'espressione di proteine funzionalmente attive. Pertanto, questo metodo fornisce informazioni dettagliate sulla trasfezione di RNA; gli RNA trascritti in vitro possono inoltre essere utilizzati per altre applicazioni, come microiniezione, analisi con microarray, blot basati su ibridazione e studi sulla struttura e funzione dell'RNA.Il modello di DNA per questa reazione esemplificativa è un plasmide linearizzato contenente il gene della luciferasi gaussiane o gluc. Con un promotore T7, verranno sintetizzati sia i prodotti capped che uncapped. Iniziare scongelando i componenti del kit di sintesi dell'RNA ad alto rendimento T7 e mantenerli sul ghiaccio.Per evitare contaminazioni da RNA, indossare guanti e pulire accuratamente la superficie del bancone, le pipette e gli altri materiali. Si raccomanda vivamente l'uso di puntali, tubi e vetreria privi di nucleasi per sintetizzare RNA non cappucciato. Impostare la reazione a temperatura ambiente, iniziando con il buffer 10 x e l'acqua, seguiti dai nucleotidi e dal template di DNA. Infine, aggiungere la miscela di polimerasi.L'ordine di aggiunta dei reagenti è importante per sintetizzare l'RNA cappucciato. Utilizzando un analogo di cap, preparare una miscela di reazione simile, ma aggiungere i nucleotidi analoghi di cap. Dopo aver aggiunto i nucleotidi standard, mescolare ora i componenti della reazione mediante vortexaggio delicato, quindi effettuare una breve centrifugazione e incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per due ore in un incubatore ad aria secca; come controllo interno, impostare una seconda reazione per sintetizzare trascritti con cap di c Luke da un plasmide linearizzato C Luke; l'espressione di C Luke viene utilizzata per normalizzare l'espressione di gluc.Dopo l'incubazione, rimuovere il template di DNA da ciascuna miscela di reazione. Aggiungere 70 microlitri di acqua priva di nucleasi, seguiti da 10 di DNAs, un buffer di reazione e quindi due microlitri di DNAs. Uno, lasciare che le DNAs reagiscano per 15 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore a secco.Ora purificare le reazioni utilizzando un qualsiasi kit di purificazione dell'RNA basato su colonnine centrifugabili e quantificare l'RNA mediante uno spettrofotometro NanoDrop TM. Infine, valutare la qualità dell'RNA utilizzando il kit Agilent RNA 6,000 nano e l'analizzatore biochimico Agilent 2100. Per una reazione di cappuccio standard, portare a 10 microgrammi di mRNA di gluc non cappucciato purificato in 15 microlitri di acqua priva di nucleasi.Questa procedura può essere opportunamente scalata. Riscaldare l'RNA a 65 gradi Celsius per 10 minuti per interrompere le strutture secondarie, quindi posizionarlo sul ghiaccio per cinque minuti. Per impostare la reazione di capping, aggiungere al tampone di capping GTP appena diluito metionina e enzima vaccinico di capping all'RNA denaturato. Vortexare delicatamente i componenti della reazione, effettuare una breve centrifugazione e incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti in un incubatore ad aria secca.Dopo l'incubazione, purificare e analizzare l'RNA come descritto alla fine della sezione precedente. Iniziare seminando cellule HeLa. In 28 pozzetti di una piastra a 48 pozzetti, ogni pozzetto deve contenere da 70 a 230.000 cellule e 150 microlitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con il 10% di siero.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 60-90%, il che dovrebbe richiedere tra 16 e 24 ore. Quando le cellule sono pronte, preparare le miscele di trasfezione. Diluire l'RNA a una concentrazione di 100 nanogrammi per microlitro.Quindi preparare 24 provette da microcentrifuga per tre reazioni diverse. Duplicare otto volte in otto provette. Aggiungere un microlitro di RNA gluc non cappucciato, un microlitro di RNA c luke cappucciato per la normalizzazione e 25 microlitri di siero libero.DMEM mescolare sempre accuratamente utilizzando una pipetta nei successivi otto tubi. Impostare la stessa reazione, ma invece di gluc RNA non cappato, aggiungere gluc RNA cappato preparato utilizzando l'analog del cap negli ultimi otto tubi. Invece del gluc RNA preparato utilizzando l'analog del cap, aggiungere ora gluc RNA cappato dalla reazione vaccinia nel primo insieme di otto tubi con la miscela di gluc RNA non cappato, aggiungendo 0,2 microlitri di reagente booster mRNA, seguiti dal mescolamento di ulteriori 0,2 microlitri.Il reagente mRNA Transit permette che le reazioni avvengano a temperatura ambiente per non più di cinque minuti. A partire dal secondo minuto della reazione, iniziare a trasferire ogni miscela, goccia a goccia, in una pozzetta contenente cellule in coltura. Ripetere questo passaggio con i successivi due set di provette contenenti cap, cap analogo gluc, RNA e RNA gluc cappucciato dalla reazione vaccinia.Lasciare quattro pozzetti come controlli negativi, incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Il saggio sopra menzionato viene eseguito utilizzando il kit Biox GIA Luciferase per il saggio Gluc. Preparare una soluzione di saggio fresca aggiungendo 15 microlitri di substrato biox gluc a 1,5 millilitri di tampone per saggio biox gluc.Non vortexare la miscela finale. Mescolare mediante inversioni del tubo per il saggio CLU. Preparare 100 x substrato appena ricostituito.Quindi preparare la soluzione per il saggio aggiungendo 15 microlitri del substrato ricostituito a 1,5 millilitri di buffer per saggio luciferasi Blu Ciena. Mescolare la soluzione per il saggio C Luke senza vortexare e incubarla a temperatura ambiente per 30 minuti al riparo dalla luce. Con le soluzioni per il saggio pronte.Misurare la luminescenza delle cellule utilizzando un luminometro per micropiastre. Impostare il luminometro in modo da iniettare 50 microlitri di soluzione del saggio per un periodo compreso tra due e dieci secondi. Successivamente, trasferire 10 microlitri di ciascun sopranatante di coltura cellulare in una pozzetta di una piastra nera da 96 pozzette.Primi il ​​iniettore con la soluzione saggio e procedi a misurare la luminescenza. Il kit per la sintesi di RNA ad alto rendimento T sette può produrre fino a 180 microgrammi di RNA non cappucciato e da 40 a 50 microgrammi di RNA cappucciato per ogni reazione di 20 microlitri, quando analizzato con l'analizzatore biochimico Agilent 2100. Integro di buona qualità.L'RNA dovrebbe mostrare un singolo picco nitido che rappresenta il trascritto di RNA. Un picco largo o più picchi indicano una degradazione dell'RNA. È inoltre importante verificare la dimensione dell'R-N-A-R-N-A.Trascritti di lunghezza superiore a quella prevista possono essere dovuti a una digestione incompleta del plasmide stampo; la degradazione di D-N-A-R-N-A e la resa inferiore sono solitamente il risultato di contaminanti introdotti nella reazione dallo stampo. La trasfezione del DNA &egrave; stata seguita da incubazione e saggio dell'attivit&agrave; della luciferasi. La struttura del cap a cinque primi &egrave; importante per proteggere l'RNA dalla degradazione da parte delle esonucleasi e per favorire l'inizio della traduzione.Pertanto, la cappatura dell'RNA è un passaggio essenziale per esperimenti di trasfezione. La differenza nel luminescenza misurata tra colture cellulari trasfettate con trascritti cappati e non cappati supporta chiaramente questa affermazione e mostra anche che entrambe le tecniche di cappatura, utilizzando un analogo della cap e l'enzima di cappatura del virus vaccinia, producono con successo trascritti di RNA cappati funzionali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare trascritti di RNA cappati di alta qualità da utilizzare in trasfezioni e in altre varie applicazioni.

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