Valutare i cambiamenti teratogeni in un modello di Zebrafish di esposizione alcolica fetale

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare gli effetti dell'esposizione all'etanolo sullo sviluppo del pesce zebra. Questo viene ottenuto esponendo innanzitutto il pesce zebra a dosi di etanolo in acqua normale per embrioni durante le prime fasi dello sviluppo. Successivamente, l'etanolo viene rimosso e i pesci vengono lasciati sviluppare fino al tempo desiderato.

Successivamente, vengono analizzati sia i cambiamenti fisici macroscopici sia le alterazioni nell'espressione genica negli embrioni trattati rispetto a quelli di controllo. Infine, gli embrioni vengono manipolati mediante mRNA, morfolini o farmaci per determinare se i difetti dello sviluppo indotti dall'etanolo possono essere modificati. In definitiva, una combinazione di PCR quantitativa e ibridazione in situ mostra che gli effetti dell'etanolo sugli embrioni di pesce zebra in via di sviluppo sono associati a modifiche nell'espressione genica.

Una successiva manipolazione dei livelli di espressione genica potrebbe migliorare o prevenire i difetti dello sviluppo indotti dall'etanolo. Le tecniche che stiamo dimostrando oggi ampliano la nostra conoscenza sulla natura della sindrome feto-alcolica, oltre a conservare i processi dello sviluppo nei vertebrati. A dimostrare oggi sarà Steph Erhardt, un tecnico del mio laboratorio, per il trattamento degli embrioni con etanolo.

Allevare gli embrioni da incroci di tipo selvatico fino allo stadio a cupola a 28 gradi Celsius in acqua per embrioni. Suddividere gli embrioni di una covata nel numero desiderato di piastre, con da 10 a 50 embrioni per piastra. Aggiungere una soluzione di etanolo al 0,2-2,5% in volume/volume nell'acqua per pesci agli embrioni e reinserire in incubatrice per un periodo massimo di 24 ore dopo la durata desiderata di esposizione.

Sostituire l'etanolo contenente acqua con acqua fresca per embrioni per un periodo specifico di sviluppo al fine di raccogliere mRNA per la PCR quantitativa. Posizionare gli embrioni appaiati in provette einor. Rimuovere l'acqua dei pesci e aggiungere buffer di lisi con TCEP.

Utilizzando un polverizzatore motorizzato, dissociare fisicamente gli embrioni, quindi posizionarli nella centrifuga per una centrifugazione lenta. Trasferire il soluto in una colonna di pre-pulizia, quindi centrifugare la colonna per rimuovere i frammenti grandi dissociati.

Utilizzare un kit di isolamento dell'RNA per estrarre l'RNA. Successivamente sintetizzare il cDNA utilizzando metodi standard per analisi mediante QPCR o microarray per preparare gli embrioni per ibridazione in situ e immunomarcatura. Fissare gli embrioni da sei a ventiquattro ore dopo la fecondazione in paraformaldeide al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius, dopo tre lavaggi con PBS contenente 0,1% di tween.

Rimuovere la coriona utilizzando due pinzette affilate al microscopio. Successivamente, trasferire gli embrioni nel metanolo mediante una serie di cambi del liquido con concentrazione crescente di metanolo e concentrazione decrescente di PBT. Dopo aver trasferito gli embrioni nel metanolo al 100%, conservarli a meno 20 gradi Celsius per la colorazione della cartilagine.

Allevare gli embrioni fino a cinque o sei giorni dopo la fecondazione. Fissarli durante la notte in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius. Successivamente lavarli tre volte in PBT per determinare quali livelli di espressione genica sono cambiati a seguito dell'esposizione all'etanolo.

Eseguire la QPCR progettando innanzitutto dei primer per convalidare i primer. Testarli su tre campioni biologici. Questi campioni biologici di controllo possono essere di qualsiasi età, purché il gene di interesse sia espresso in quella particolare età.

Dopo aver verificato i primer, utilizzare il cDNA precedentemente preparato per eseguire la QPCR, eseguendo i campioni in triplicato e includendo un campione di controllo per un controllo del pesce zebra; utilizziamo i primer per gap dh. Normalizzare i risultati ai livelli di gap DH. Quindi calcolare il livello relativo di espressione genica utilizzando il metodo delle potenze.

Variazione del metodo del doppio delta delta CT che mostra la differenza sperimentale rispetto al tipo selvatico. Per costrutto di ibridazione in C. Scartare sonde ribo marcate per il gene di interesse.

Quindi, incubarli con embrioni di pari età in condizioni standard e rilevare il profilo di ibridazione mediante fosfatasi alcalina; acquisire le immagini dei campioni utilizzando un microscopio stereoscopico per valutare lo sviluppo morfogenetico, ad esempio potrebbe essere utile acquisire immagini di embrioni vitali per valutare la distanza interoculare e la lunghezza del corpo. In primo luogo, fissare gli embrioni in paraformaldeide. Successivamente, acquisire immagini per esaminare gli effetti del trattamento con alcol sulle strutture cartilaginee in via di sviluppo nella larva.

Fissare i pesci zebra utilizzando lc e blu per diverse ore fino a tutta la notte per trattenere e chiarificare gli embrioni prima dell'acquisizione delle immagini. Analizzare la morte cellulare in embrioni vivi incubandoli in cinque milligrammi per millilitro di aine arancione in PBS per un'ora. Lavare gli embrioni tre volte in PBS, quindi montarli su vetrini, acquisire le immagini dei campioni utilizzando un microscopio confocale e utilizzare la serie Z per creare immagini composite.

Dopo aver identificato i geni la cui espressione è diminuita a causa dell'esposizione all'etanolo, iniettare da 25 a 200 picogrammi per nanolitro di mRNA capppato per un gene di interesse in embrioni allo stadio di una-due cellule. Lasciare che le uova si riprendano in un incubatore riscaldato a 28 gradi Celsius fino a quando non raggiungono lo stadio a cupola, quindi trattarle con etanolo come in precedenza. Per i geni la cui espressione è aumentata a seguito dell'esposizione all'etanolo, ridurne l'espressione iniettando quantità comprese tra picogrammi e nanogrammi di morpholino antisenso in embrioni allo stadio di una-due cellule.

Questo protocollo è simile a quello utilizzato per l'mRNA con cap. Se si inietta un mRNA, un morfolino di splicing, misurare l'efficienza mediante RT-PCR per confrontare le quantità di trascritti splicati e non splicati al fine di analizzare l'attività genica dipendente dalla dose; titolare il morfolino iniettato e lasciare sviluppare gli embrioni fino allo stadio desiderato prima di trattarli con etanolo. L'esposizione degli embrioni di pesce zebra all'etanolo provoca una serie di difetti genetici e dello sviluppo correlati ai fenotipi osservati in altri vertebrati.

Uno sviluppo anomalo dei tessuti assiali, compreso il notocordo, porta a un accorciamento e talvolta a un'interruzione del notocordo, il che contribuisce in parte alle successive anomalie nei somiti, come mostrato qui. Mentre i controlli non trattati presentano una forma a chevron ben definita, i somiti trattati con etanolo assumono l'aspetto a U osservato in seguito a una ridotta segnalazione di sonic hedgehog. Come si può notare qui.

Un'altra conseguenza dell'esposizione all'etanolo, probabilmente successiva al ritardo dello sviluppo iniziale e ai difetti di Noor, è la riduzione della lunghezza dell'embrione. Questo risultato ricorda la persistenza della statura bassa pre-puberale osservata nei bambini esposti all'etanolo durante lo sviluppo, suggerendo che il modello di pesce zebra sia rilevante per la comprensione di questo difetto congenito umano. È stato dimostrato in modelli animali che un'esposizione grave all'etanolo porta a fenotipi pronunciati del sindrome feto-alcolica, inclusi sinizia e opia.

Nel pesce zebra, la distanza intraoculare (IOD) diminuisce in modo dipendente dalla dose di etanolo, in linea con la natura del difetto congenito umano. L'opìa si osserva soltanto con dosi molto elevate, ma dosi più basse producono comunque una riduzione significativa dell'IOD, suggerendo che questo modello animale presenti un difetto simile nello sviluppo della linea mediana del volto. In questa figura, i livelli di espressione genica precoci di six3b e glee1 sono confrontati in embrioni non trattati e in embrioni trattati con etanolo.

Entrambi i geni hanno mostrato livelli ridotti di espressione nei campioni trattati con etanolo. Utilizzando l'ibridazione NC due ibrida, i modelli di espressione di sei tre B e gooID sono stati analizzati come osservato. In questo caso, entrambi i geni hanno mostrato una diminuzione dell'espressione spaziale negli embrioni trattati con etanolo rispetto ai controlli non trattati.

Poiché entrambi i geni sono espressi in tessuti destinati a diventare strutture mediane craniofacciali, la loro riduzione otto ore dopo la fecondazione è coerente con la riduzione della distanza interpupillare osservata in fasi successive dello sviluppo. Una volta identificati i geni influenzati dall'etanolo, esistono meccanismi attraverso cui la loro espressione può essere aumentata o diminuita. In questo esempio, è stato iniettato mRNA per sonic hedgehog, un ligando che aumenta i livelli di glee one, il quale ha ripristinato i difetti macroscopici causati dalla riduzione di glee one negli embrioni trattati con etanolo.

L'iniezione di sei tre B, tuttavia, non è stata in grado di ripristinare il fenotipo esposto all'etanolo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esplorare i difetti genetici e dello sviluppo provocati dall'etanolo in un embrione di pesce zebra in via di sviluppo. Le tecniche utilizzate qui possono essere applicate anche a chi desidera studiare la tossicità di altri composti solubili in acqua sugli embrioni di vertebrati in via di sviluppo.