Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo
12 dicembre 2011
Qui mostriamo il nuovo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Stadio di due cellule sviluppo dell'embrione con decongelati sperma era migliorato costantemente in 5 ceppi di topi con l'utilizzo di questo kit. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topi geneticamente modificati sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e poi recuperato con successo da fecondazione in vitro.
L'obiettivo generale di questa procedura è criopreservare lo sperma di topo. Questo viene ottenuto raccogliendo innanzitutto lo sperma dagli EPI di topo utilizzando cannule per criopreservazione. Le cannule vengono quindi congelate in azoto liquido, dove vengono conservate fino al loro recupero, che avviene scongelandole in acqua calda.
Gli spermatozoi di topo recuperati vengono infine utilizzati per la fecondazione in vitro. Il principale vantaggio di questo kit rispetto ai metodi esistenti è che contiene tutti i materiali necessari per la criopreservazione e il recupero degli spermatozoi di topo. In generale, le persone nuove a questo metodo potrebbero avere difficoltà nel manipolare e caricare le cannule. Iniziare assemblando 15 cannule per la criopreservazione dello sperma per ogni linea di topi da criopreservare.
Prima, collegare ogni cannuccia da 0,25 millilitri a una siringa da un millilitro, con il tappo di cotone rivolto verso la siringa. Secondo, caricare otto centimetri di mezzo IVF in ciascuna cannuccia, seguiti da un centimetro di aria. Terzo, etichettare ciascuna delle 15 cannucce con il nome della linea da preservare per ogni linea da criopreservare.
Riempire una pozzetta di una piastra a quattro pozzette con 240 microlitri di agente crioprotettivo. Applicare una pipetta da un millilitro all'impugnatura del contenitore per il congelamento per allungarla. Infine, riempire la scatola isolante in schiuma fornita con il kit con 15 centimetri di azoto liquido e chiudere il coperchio per procedere all'eutanasia.
Due topi maschi adulti fertili. Per ogni linea da criopreservare, rimuovere chirurgicamente gli EPI caudali. Posizionare il topo in posizione dorsale e aprire la parete ventrale del corpo.
Estrarre delicatamente il grosso deferente e rimuovere ogni eccesso di grasso. Successivamente, individuare l'epididimo e rimuoverlo intatto insieme a un piccolo pezzo di deferente. Posizionare gli EPI in una pozzetta di una piastra da quattro pozzette preparata contenente CPA, sotto un microscopio stereoscopico.
Eseguire da cinque a sette tagli longitudinali in ciascun epididimo. Quindi, utilizzando una pinza, comprimere delicatamente ciascuna differenza rapida. Per far uscire gli spermatozoi, incubare la miscela di CPA ed epididimo a temperatura ambiente per tre a cinque minuti.
Agitare delicatamente la piastra a mano due o tre volte durante l'incubazione. Questo permetterà agli spermatozoi di uscire per aspirazione. Caricare ogni cannuccia preparata con cinque millimetri della sospensione di spermatozoi, seguiti da un centimetro di aria.
È fondamentale che tutti i capillari vengano caricati in modo uniforme durante il processo di congelamento. Dopo aver caricato tutti e 15 i capillari, sigillare accuratamente entrambe le estremità di ciascun capillare a caldo. Per garantire la sopravvivenza degli spermatozoi, completare l'operazione per tutti e 15 i capillari entro 10 minuti.
Una volta preparate tutte le cannule, inserirle nella colonna del canestro per il congelamento dello sperma. Inizialmente, posizionare il canestro all'interno della scatola di polistirolo e lasciarlo galleggiare verticalmente nell'azoto liquido. Il canestro deve rimanere in posizione verticale per 10 minuti, altrimenti la velocità di congelamento dello sperma verrà compromessa.
Quindi immergere il contenitore nell'azoto liquido. Gli spermatozoi vengono così criopreservati e sono pronti per essere conservati a lungo termine in azoto liquido. Circa 60 ore prima di un recupero programmato degli spermatozoi.
Seguire il protocollo scritto per l'iperovulazione delle femmine prima della FIV. Per ogni cannuccia da scongelare, preparare e pre-equilibrare tutti i mezzi per almeno un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Questi materiali includono una piastra di Petri da 35 millimetri con una goccia da 90 microlitri di mezzo per il trattamento degli spermatozoi ricoperta di olio.
Un piatto di Petri da 35 millimetri con tre millilitri di mezzo IVF da utilizzare come piatto di taglio e, per ogni cinque femmine superovulate, preparare un piatto IVF, costituito da un pozzetto di una piastra a quattro pozzetti riempito con 500 microlitri di mezzo IVF. Per ogni piatto IVF, preparare un piatto di lavaggio, ovvero un piatto di Petri da 35 millimetri contenente tre millilitri di KSOM, e un piatto per la coltura degli embrioni, costituito da gocce da 50 microlitri di mezzo KSOM ricoperte con olio in un piatto di Petri da 35 millimetri. Dopo aver preparato tutti i materiali necessari, rimuovere rapidamente una cannuccia dallo stoccaggio e immergerla in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per due o tre minuti.
Asciugare la cannuccia. Quindi effettuare un taglio obliquo nella colonna d'aria al di sotto del tappo di cotone. All'altra estremità della cannuccia, eseguire un altro taglio obliquo sopra un'altra colonna d'aria.
Evitare di tagliare la colonna di spermatozoi. Aspirare ora la sospensione di spermatozoi dall'estremità della cannuccia, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, e depositarla al centro del mezzo di trattamento per gli spermatozoi. Quindi incubare la piastra per 45-60 minuti.
Durante l'incubazione degli spermatozoi, isolare le ucs delle femmine superovulate e trasferirle nella piastra per dissezione. Utilizzare un ago da 30 gauge o pinzette per lacerare ciascuna ovidotto, liberando i complessi cumulus-citi. Trasferire i CC da cinque femmine in ciascuna fecondazione in vitro (IVF).
Beh, con una quantità minima di mezzo. Evitare il trasferimento di grasso e sangue poiché i mezzi contaminati inibiscono l'efficienza della fecondazione. Dopo l'incubazione, raccogliere da 10 a 15 microlitri della sospensione spermatica dalla periferia della goccia STM e depositare la sospensione in un'unità IVF.
Ora coltivare le cellule in co-coltura per quattro-sei ore per la fecondazione. Dopo la fecondazione, trasferire gli embrioni attraverso almeno 2 lavaggi con SOM 2K nella capsula di lavaggio. Quindi procedere con la coltura.
Gli embrioni vengono mantenuti in KSOM fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo desiderato. Gli spermatozoi di cinque ceppi murini consanguinei Charles River sono stati congelati. I rapporti di protezione della motilità spermatica e della motilità progressiva rapida sono variati dall'81% al 47% tra i cinque ceppi analizzati.
I tassi di FIV con spermatozoi congelati e scongelati hanno mostrato valori variabili tra ceppi diversi, dal 26 all'88%, nel corso di un anno e mezzo. Un totale di 49 linee di topi OGM sono state conservate mediante criopreservazione dello sperma e successivamente recuperate mediante FIV in quattro ceppi femminili diversi. C 57 black six BC DBA one e 1 29 SV Una volta acquisita la tecnica di criopreservazione dello sperma, essa può essere eseguita in 30 minuti, se effettuata correttamente.
Per questa procedura, è importante far defluire verticalmente nel contenitore e nell'azoto liquido.
Panoramica
Questo studio presenta il kit I•Cryo per la criopreservazione efficace dello sperma di topo, dimostrando un miglioramento dello sviluppo embrionale in diverse linee di topi. Il kit facilita l'archiviazione di linee di topi geneticamente modificate mediante criopreservazione dello sperma e successivo recupero tramite fecondazione in vitro (IVF).
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia della Riproduzione
- Tecniche di Criopreservazione
- Fecondazione In Vitro (FIV)
Sfondo
- La criopreservazione dello sperma di topo è fondamentale per la ricerca genetica.
- I metodi esistenti possono mancare di efficienza e semplicità d'uso.
- Il kit I•Cryo ha lo scopo di semplificare il processo di criopreservazione.
- Il recupero con successo dello sperma è essenziale per i risultati della fecondazione in vitro.
Scopo dello studio
- Valutare l'efficacia del kit I•Cryo nella criopreservazione dello sperma di topo.
- Valutare l'impatto dello sperma criopreservato sullo sviluppo dell'embrione.
- Archiviare linee di topi geneticamente modificati per future ricerche.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di spermatozoi dall'epididimo del topo mediante cannule per criopreservazione.
- Congelamento degli spermatozoi in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
- Scongelamento degli spermatozoi per l'uso in procedure di fecondazione in vitro (FIV).
- Valutazione della motilità spermatica e dei tassi di successo della FIV in diverse linee.
Risultati principali
- Sviluppo embrionale migliorato osservato in 5 ceppi di topi utilizzando il kit I•Cryo.
- 49 linee di topi geneticamente modificati archiviate e recuperate con successo.
- I tassi di motilità degli spermatozoi sono variati dall'81% al 47% tra i diversi ceppi.
- I tassi di fecondazione in vitro (IVF) sono variati dal 26% all'88% con spermatozoi congelati-scongelati.
Conclusioni
- Il kit I•Cryo migliora in modo significativo l'efficienza della criopreservazione degli spermatozoi.
- Il recupero con successo di linee geneticamente modificate ne conferma l'utilità nella ricerca.
- Un'ulteriore ottimizzazione del metodo può ridurre il tempo di lavorazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La criopreservazione dello sperma di topo rappresenta una soluzione economica e scalabile per l'archiviazione di ceppi geneticamente modificati, riducendo la dipendenza da colonie di animali vivi e attenuando il rischio di perdita di linee. Il kit I•Cryo migliora la previsione del successo nella conservazione delle linee grazie a un aumento della mobilità spermatica post-scongelamento e allo sviluppo embrionale derivato da FIV in diversi ceppi inbred. Ciò consente una gestione strategica del portafoglio nella ricerca preclinica, permettendo lo stoccaggio a lungo termine e il recupero su richiesta di modelli di malattia di valore.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la validazione funzionale di modelli genetici assicurando il recupero dello sperma per lo screening fenotipico basato sulla FIV.
- Valore operativo: Riduce il carico di allevamento animale e i costi associati al mantenimento di colonie vive di modelli a bassa resa o induttibili.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce una fonte standardizzata di spermatozoi per saggi IVF costanti, supportando la valutazione riproducibile degli effetti dei composti sulla fecondazione e sullo sviluppo embrionale precoce.
- Valore operativo: Facilita la prontezza del saggio mediante spermatozoi criobancati, eliminando la variabilità derivante dalle differenze tra maschi o tra lotti nel prelievo di campioni freschi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene l'integrità genetica dei modelli di malattia nel tempo, consentendo studi longitudinali e continuità sperimentale tra generazioni.
- Valore operativo: Favorisce la collaborazione tra più sedi permettendo la distribuzione di sperma criopreservato anziché di animali vivi, riducendo la complessità del trasporto e i rischi per la biosicurezza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel flusso di lavoro di scoperta, dalla generazione iniziale del modello fino alla validazione preclinica, fungendo da ponte tra ingegneria genetica e fenotipizzazione funzionale mediante fecondazione in vitro.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo il recupero di sperma criopreservato per la fecondazione in vitro (FIV), permettendo di valutare gli effetti delle modifiche genetiche sulla fertilità e sull'embriogenesi precoce.
- Screening: Permette saggi standardizzati basati sulla FIV utilizzando sperma scongelato, migliorando la riproducibilità nella valutazione della funzionalità spermatica, della capacITazione e della capacità fecondante.
- Analisi: Produce parametri quantitativi come la motilità spermatica (% progressiva), la motilità progressiva rapida e i tassi di sviluppo embrionale, che guidano le decisioni di proseguimento o interruzione relative alla stabilità del modello.
- Ricerca traslazionale: Collega la modifica genetica agli esiti dello sviluppo consentendo la FIV con sperma criopreservato, supportando lo screening fenotipico associato a biomarcatori negli embrioni preimpianto.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di criobanca riutilizzabile per l'archiviazione e il recupero continuo di linee modificate geneticamente, riducendo gli sforzi ridondanti di rederivazione tra diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella conservazione del modello dimostrando un miglioramento della motilità e dello sviluppo embrionale rispetto ai metodi base di CPA.
- Valore operativo: Standardizza il flusso di lavoro di criopreservazione attraverso componenti basate su kit, riducendo la variabilità dell'operatore e il tempo di formazione.
- Valore strategico: Riduce i costi a lungo termine del mantenimento delle linee e il rischio di perdita irreversibile delle linee a causa di fallimenti nella riproduzione, deriva genetica o focolai di patogeni.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione basata sul rischio delle linee GM da archiviare in base al valore strategico, con la certezza della ripristinabilità futura.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze tecniche nella raccolta dello sperma, nella manipolazione delle cannule e nella saldatura termica per garantire l'integrità del campione.
- Richiede l'accesso a sistemi di stoccaggio in azoto liquido e a strumenti per il scongelamento controllato (bagno termostatato a 37°C) per ottenere prestazioni costanti dopo lo scongelamento.
- Necessita di mezzi di fecondazione in vitro standardizzati e di protocolli di superovulazione per risultati affidabili in termini di fecondazione e coltura embrionale.
- Le prestazioni possono variare in base al background genetico, richiedendo un'ottimizzazione specifica per ceppo dei passaggi di incubazione e lavaggio.
- È limitato dalla necessità di femmine fertili e di competenze specifiche in fecondazione in vitro per il recupero degli spermatozoi, restringendo l'applicazione diretta a saggi basati sull'accoppiamento naturale.
