Name: Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Impara la crioconservazione dello sperma di topo per la biologia riproduttiva utilizzando il kit I•Cryo. Questo metodo facilita l'archiviazione di linee geneticamente modificate con elevati tassi di sviluppo embrionale.

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La ricerca qui presentata è stata sostenuta da Charles River. Gli autori sono molto grati ai modelli Genetically Engineered and Services Group e il personale embriologia per la cura degli animali e l&#39;iniezione dell&#39;ormone.

1. Topo crioconservazione degli spermatozoi <ol><li> Per ogni linea da crioconservati, i seguenti elementi prima di iniziare. <ol><li> 1 vasca di un 4-ben piatto con 240 l di kit CPA </li><li> 15 cannucce crioconservazione degli spermatozoi come segue <ol><li> Collegare il 0,25 ml cannucce al siringhe da 1 ml con il tappo di cotone più vicino alla siringa. In ogni paglia, carico di 8 cm (circa 160 microlitri) di media FIV, quindi 1 cm di aria. Etichettare il cannucce con il nome della linea da conservare. </li></ol></li></ol></li><li> LN 2 dovrebbe essere di 15 cm di profondità nella casella di schiuma. Chiudere il coperchio. </li><li> Euthanize 2 topi maschi da ogni riga di essere crioconservati. I topi dovrebbero essere tra 10 e 60 settimane di età. Rimuovere le due epididimi caudale insieme al dotto deferente di ogni topo. </li><li> Posizionare il epididimi nel precedentemente preparato CPA contenenti anche di un 4-ben piatto (passo 1.1). </li><li> Fare 5-7 tagli longitudinali in ogni epididimo e delicatamentespremere ogni dotto deferente per spingere lo sperma fuori. </li><li> Agitare la miscela e CPA epididimo a mano delicatamente a temperatura ambiente per 3-5 minuti. Questo permetterà spermatozoi a nuotare fuori. </li><li> Utilizzando la paglia precedentemente preparato, aspirare 5 mm (circa 10 microlitri) di sospensione di spermatozoi e quindi 1 cm di aria. </li><li> Ripetere questa operazione fino a un totale di 15 cannucce. Carico e di tenuta cannucce entro 10 minuti per la sopravvivenza degli spermatozoi migliori. </li><li> Si chiude entrambi i lati della paglia con attenzione. Posizionare il cannucce nel contenitore con la colonna congelamento dello sperma prima. </li><li> Fissare il 1 pipetta ml fornito come parte del kit per il canestro di estendere la maniglia. Posizionare il contenitore in LN 2 nella casella schiuma attraverso il foro nel coperchio. Lasciare che il canestro di galleggiare verticalmente nel LN 2 per 10 minuti. </li><li> Immergere il contenitore nel LN2. Lo sperma è ora crioconservati e può essere spostato lungo termine LN 2 di stoccaggio. </li><li> Il contenitore non deve essere utilizzato perla riga successiva fino a quando è riscaldato a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Topo superovulazione <ol><li> In generale, l&#39;uso di giovani topi di sesso femminile lo stesso sfondo i donatori di sperma. </li><li> I topi devono essere ~ 12 g (3-4 settimane di età). </li><li> Eseguire un&#39;iniezione intraperitoneale con 5-10 UI di gravidanza siero di cavalla gonadotropina (PMSG). </li><li> Attendere 46-48 ore. </li><li> Eseguire un&#39;iniezione intraperitoneale con 5-10 UI di gonadotropina corionica umana (hCG). </li><li> Ovociti vendemmia 14-16 ore dopo l&#39;iniezione di hCG come descritto di seguito. </li></ol> 3. Topo di recupero degli spermatozoi e fecondazione in vitro <ol><li> Prima di fecondazione in vitro, per ogni paglia di essere scongelati, i seguenti elementi ed equilibrare per almeno un&#39;ora a 37 ° C CO 2 incubatore. <ol><li> Spermatozoi piatto di incubazione: un piatto 35 millimetri Petri, con un calo 90 l di media sperma trattamento (STM) ricoperto di olio. </li><li> Taglio piatto: Per la raccolta degli ovociti da un massimo di 10 superovulated femmine, una 35 millimetri Petri piatto con 3 ml di terreno fecondazione in vitro. </li><li> FIV bene: per ogni gruppo di 5 femmine superovulated per la FIV, un pozzetto di un piatto ben 4 con 500 l di media FIV (se si utilizza superovulated 10 femmine, per esempio, avrete bisogno di 2 pozzi...) </li><li> Lavaggio delle stoviglie: una piatto 35 millimetri Petri con 3 ml di simplex di potassio medio ottimizzato (KSOM) per lavare ogni pozzetto del 4-ben piatto FIV utilizzate </li><li> Cultura piatto: un piatto di 35 millimetri di Petri con 50 gocce l di media KSOM ricoperto di olio per coltura degli embrioni da ogni pozzetto del piatto FIV. </li></ol></li><li> Rimuovere una cannuccia da LN 2 e mettere in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 2-3 minuti. </li><li> Rimuovere la paglia dal bagnomaria e pulire per rimuovere l&#39;acqua in eccesso. Effettuare il primo taglio vicino alla colonna d&#39;aria al più vicino la spina cotone. Tagliare la paglia nel medio FIV ci saranno ancora una colonna d&#39;aria visibile prima della colonna sperma. </li><li> Poi tagliare la fine della paglia nel seconda colonna d&#39;aria, facendo attenzione a evitare di tagliare la colonna sperma. Tagliata in un angolo di 45 - questo renderà molto più facile per aspirare lo sperma. </li><li> Aspirare la sospensione dello sperma a partire dalla fine distale della paglia con una pipetta 200 l. </li><li> Posizionare la sospensione spermatozoi nel centro della goccia STM e incubare il piatto per 45-60 minuti a 37 ° C 5% CO 2 incubatore. </li><li> Durante l&#39;incubazione degli spermatozoi, sezionare gli ovidotti delle femmine superovulated nel piatto di taglio. Utilizzare un ago 30 g o pinze per strappare ogni ovidotto, rilasciando il cumulo-ovocita complessi (COC). Evitare grassi e sangue nel medio FIV come sporco dei media rende fasi di lavaggio in più. </li><li> Una volta che tutti gli ovidotti sono stati strappati, trasferire i contraccettivi orali combinati da 5 femmine per ogni pozzi fecondazione in vitro. Il numero di COC prodotta da superovulazione è molto sforzo dipendente. </li><li> Raccogliere 10-15 ml di sperma dalla periferia della goccia STM e fertilizzare uno FIV e circa 14-16 ore dopo hCG injezione. Ripetere per ogni fecondazione ben utilizzato. Concentrazione dello sperma finale sarà di circa 1 milione / ml. </li><li> Co-coltura spermatozoi e ovociti per 4-6 ore a 37 ° C 5% CO 2 incubatore. </li><li> Lavare gli embrioni con KSOM un minimo di 2 volte e la cultura in gocce KSOM per lo sviluppo a 37 ° C 5% CO 2 incubatore. </li><li> Tasso di fecondazione in vitro è stato calcolato come embrioni di cellule a doppio stadio di ovociti totale utilizzata dopo una notte della cultura. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Spermatozoi dal 5 Charles River ceppi di topi inbred è stato congelato. Rapporti di protezione sono calcolati dividendo gli spermatozoi congelati i valori di valutazione da valori freschi valutazione degli spermatozoi. Rapporti di protezione della motilità degli spermatozoi sono stati 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% per C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente. Rapporti di protezione per una rapida motilità progressiva sono stati 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% in C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente (Fig. 1). I tassi di fecondazione in vitro con gli spermatozoi congelati-scongelati sono stati il ​​55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% e 26,2% nel C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, rispettivamente (Fig. 2) . Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topo geneticamente modificato sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi. Queste linee sono stati successivamente recuperati con successo (come definito da cuccioli nati vivi) da FIV in 4 ceppi di sesso femminile (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 e 129Sv) (Fig. 3). <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> Figura 1. I rapporti Tutela della motilità spermatica e la motilità progressiva rapida nei topi <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> Figura 2. Fecondazione in vitro con lo sperma congelato, scongelato in topi 3713fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Fecondazione in vitro con spermatozoi congelati-scongelati in topi GM

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
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<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

Gli autori sono dipendenti del Charles River, il creatore di questo kit.

Dal 1990, la base del protocollo di congelamento degli spermatozoi con il 18% raffinosio e il 3% di latte scremato è stato dimostrato affidabile in molti ceppi di topi e un gran numero di linee del mouse sono stati crioconservati 1,2,3,4,5,6,7. Le principali cause di danni alle cellule dello sperma durante il processo di congelamento e scongelamento sono stati associati con la formazione di ghiaccio 8,9 e le specie reattive dell&#39;ossigeno 10. La supplementazione con pulitori del radicale libero, come gli amminoacidi, e agenti riducenti, come monotioglicerolo, nel mezzo di congelamento è stato studiato e dimostrato di aumentare notevolmente tasso di fecondazione in vitro con lo sperma congelato, scongelato in ceppi inbred compreso il C57BL / 6 11,6. Nel presente protocollo, abbiamo sviluppato un nuovo I • Cryo kit per la crioconservazione degli spermatozoi del mouse attraverso l&#39;ottimizzazione di base disponibili in commercio CPA con antiossidanti e inibitori del ghiaccio e modificando il congelamento degli spermatozoi e la procedura di fecondazione in vitro. Rapporti di protezione della motilità degli spermatozoi(&gt; 60%) e la motilità progressiva rapida (&gt; 45%) sono state osservate per gli spermatozoi provenienti da cinque ceppi di topi inbred congelati con la Cryo • I kit. Il 2-cellula embrionale tasso fase di sviluppo con lo sperma congelato, scongelato in 5 ceppi di topi inbred è stato notevolmente migliorato rispetto a quello con base 11,6 CPA. Utilizzando il kit, l&#39;utente crea una sospensione concentrata di spermatozoi dello sperma di congelamento di 2 maschi per ogni linea. Solo da congelamento 15 cannucce il processo è veloce, facile e occupa meno spazio di memorizzazione per l&#39;archiviazione a breve oa lungo termine. La maggior parte delle volte, le linee del mouse può essere recuperato da scongelamento solo 1 o 2 cannucce.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornito con il kit</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornito con il kit</td></tr><tr><td>Mezzo IVF</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornito con il kit</td></tr><tr><td>Canule di plastica da 0,25 ml</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornito con il kit</td></tr><tr><td>Contenitore per congelamento degli spermatozoi</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornito con il kit</td></tr><tr><td>Canna e goblet</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornito con il kit</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Deve essere testato per embrioni</td></tr><tr><td>Mezzo KSOM</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Saldatore termico</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>Piastra multiwell a 4 pozzetti</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice a 37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di stoccaggio in LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Varie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno termoregolato a 37&amp;#x00B0;C</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 cc con ago da 26G 3/8</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>Forbici microchirurgiche</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 30 gauge &amp;frac12;</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

crioconservazione del mouse sperm and recovery utilizzando il kit · i cryo

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Migliaia di nuovi geneticamente modificati (GM) ceppi di topi sono stati creati dopo l&#39;avvento di tecnologie di transgenesi e di eliminazione diretta. Molti di questi animali preziosi esistono solo come gli animali vivi, senza alcun piano di backup in caso di emergenza. Crioconservazione degli embrioni in grado di fornire il backup, ma è costoso, può essere una procedura lunga e richiede generalmente un gran numero di animali per il successo. Dopo la scoperta che gli spermatozoi del mouse può essere crioconservati con successo con un agente di base crioprotettivi (CPA), composto da 18% raffinosio e il 3% di latte scremato, la crioconservazione degli spermatozoi è diventata una procedura accettabile e conveniente per l&#39;archiviazione, la distribuzione e il recupero di questi ceppi di valore . Qui mostriamo un nuovo sviluppo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Sperma di cinque ceppi di uso comune di topi inbred sono stati congelati con questo kit e poi recuperato. Rapporti di protezione più elevato della motilità degli spermatozoi (&gt;60%) e la motilità progressiva rapida (&gt; 45%) rispetto al controllo (di base CPA) sono stati osservati per lo sperma congelato con questo kit di 5 ceppi di topi inbred. Due stadi di sviluppo embrionale delle cellule dopo la fecondazione in vitro con lo sperma recuperato è stato migliorato costantemente in tutte e 5 ceppi di topi esaminati. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topo geneticamente modificato sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e successivamente recuperato da fecondazione in vitro.

Qui mostriamo il nuovo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Stadio di due cellule sviluppo dell&#39;embrione con decongelati sperma era migliorato costantemente in 5 ceppi di topi con l&#39;utilizzo di questo kit. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topi geneticamente modificati sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e poi recuperato con successo da fecondazione in vitro.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

Migliaia di nuovi ceppi di topi geneticamente modificati (GM) sono stati creati since l'avvento della transgenesi e delle tecnologie di knockout. Molti di questi...

L'obiettivo generale di questa procedura è criopreservare lo sperma di topo. Questo viene ottenuto raccogliendo innanzitutto lo sperma dagli EPI di topo utilizzando cannule per criopreservazione. Le cannule vengono quindi congelate in azoto liquido, dove vengono conservate fino al loro recupero, che avviene scongelandole in acqua calda.Gli spermatozoi di topo recuperati vengono infine utilizzati per la fecondazione in vitro. Il principale vantaggio di questo kit rispetto ai metodi esistenti è che contiene tutti i materiali necessari per la criopreservazione e il recupero degli spermatozoi di topo. In generale, le persone nuove a questo metodo potrebbero avere difficoltà nel manipolare e caricare le cannule. Iniziare assemblando 15 cannule per la criopreservazione dello sperma per ogni linea di topi da criopreservare.Prima, collegare ogni cannuccia da 0,25 millilitri a una siringa da un millilitro, con il tappo di cotone rivolto verso la siringa. Secondo, caricare otto centimetri di mezzo IVF in ciascuna cannuccia, seguiti da un centimetro di aria. Terzo, etichettare ciascuna delle 15 cannucce con il nome della linea da preservare per ogni linea da criopreservare.Riempire una pozzetta di una piastra a quattro pozzette con 240 microlitri di agente crioprotettivo. Applicare una pipetta da un millilitro all'impugnatura del contenitore per il congelamento per allungarla. Infine, riempire la scatola isolante in schiuma fornita con il kit con 15 centimetri di azoto liquido e chiudere il coperchio per procedere all'eutanasia.Due topi maschi adulti fertili. Per ogni linea da criopreservare, rimuovere chirurgicamente gli EPI caudali. Posizionare il topo in posizione dorsale e aprire la parete ventrale del corpo.Estrarre delicatamente il grosso deferente e rimuovere ogni eccesso di grasso. Successivamente, individuare l'epididimo e rimuoverlo intatto insieme a un piccolo pezzo di deferente. Posizionare gli EPI in una pozzetta di una piastra da quattro pozzette preparata contenente CPA, sotto un microscopio stereoscopico.Eseguire da cinque a sette tagli longitudinali in ciascun epididimo. Quindi, utilizzando una pinza, comprimere delicatamente ciascuna differenza rapida. Per far uscire gli spermatozoi, incubare la miscela di CPA ed epididimo a temperatura ambiente per tre a cinque minuti.Agitare delicatamente la piastra a mano due o tre volte durante l'incubazione. Questo permetterà agli spermatozoi di uscire per aspirazione. Caricare ogni cannuccia preparata con cinque millimetri della sospensione di spermatozoi, seguiti da un centimetro di aria.È fondamentale che tutti i capillari vengano caricati in modo uniforme durante il processo di congelamento. Dopo aver caricato tutti e 15 i capillari, sigillare accuratamente entrambe le estremità di ciascun capillare a caldo. Per garantire la sopravvivenza degli spermatozoi, completare l'operazione per tutti e 15 i capillari entro 10 minuti.Una volta preparate tutte le cannule, inserirle nella colonna del canestro per il congelamento dello sperma. Inizialmente, posizionare il canestro all'interno della scatola di polistirolo e lasciarlo galleggiare verticalmente nell'azoto liquido. Il canestro deve rimanere in posizione verticale per 10 minuti, altrimenti la velocità di congelamento dello sperma verrà compromessa.Quindi immergere il contenitore nell'azoto liquido. Gli spermatozoi vengono così criopreservati e sono pronti per essere conservati a lungo termine in azoto liquido. Circa 60 ore prima di un recupero programmato degli spermatozoi.Seguire il protocollo scritto per l'iperovulazione delle femmine prima della FIV. Per ogni cannuccia da scongelare, preparare e pre-equilibrare tutti i mezzi per almeno un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Questi materiali includono una piastra di Petri da 35 millimetri con una goccia da 90 microlitri di mezzo per il trattamento degli spermatozoi ricoperta di olio.Un piatto di Petri da 35 millimetri con tre millilitri di mezzo IVF da utilizzare come piatto di taglio e, per ogni cinque femmine superovulate, preparare un piatto IVF, costituito da un pozzetto di una piastra a quattro pozzetti riempito con 500 microlitri di mezzo IVF. Per ogni piatto IVF, preparare un piatto di lavaggio, ovvero un piatto di Petri da 35 millimetri contenente tre millilitri di KSOM, e un piatto per la coltura degli embrioni, costituito da gocce da 50 microlitri di mezzo KSOM ricoperte con olio in un piatto di Petri da 35 millimetri. Dopo aver preparato tutti i materiali necessari, rimuovere rapidamente una cannuccia dallo stoccaggio e immergerla in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per due o tre minuti.Asciugare la cannuccia. Quindi effettuare un taglio obliquo nella colonna d'aria al di sotto del tappo di cotone. All'altra estremità della cannuccia, eseguire un altro taglio obliquo sopra un'altra colonna d'aria.Evitare di tagliare la colonna di spermatozoi. Aspirare ora la sospensione di spermatozoi dall'estremità della cannuccia, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, e depositarla al centro del mezzo di trattamento per gli spermatozoi. Quindi incubare la piastra per 45-60 minuti.Durante l'incubazione degli spermatozoi, isolare le ucs delle femmine superovulate e trasferirle nella piastra per dissezione. Utilizzare un ago da 30 gauge o pinzette per lacerare ciascuna ovidotto, liberando i complessi cumulus-citi. Trasferire i CC da cinque femmine in ciascuna fecondazione in vitro (IVF).Beh, con una quantità minima di mezzo. Evitare il trasferimento di grasso e sangue poiché i mezzi contaminati inibiscono l'efficienza della fecondazione. Dopo l'incubazione, raccogliere da 10 a 15 microlitri della sospensione spermatica dalla periferia della goccia STM e depositare la sospensione in un'unità IVF.Ora coltivare le cellule in co-coltura per quattro-sei ore per la fecondazione. Dopo la fecondazione, trasferire gli embrioni attraverso almeno 2 lavaggi con SOM 2K nella capsula di lavaggio. Quindi procedere con la coltura.Gli embrioni vengono mantenuti in KSOM fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo desiderato. Gli spermatozoi di cinque ceppi murini consanguinei Charles River sono stati congelati. I rapporti di protezione della motilità spermatica e della motilità progressiva rapida sono variati dall'81% al 47% tra i cinque ceppi analizzati.I tassi di FIV con spermatozoi congelati e scongelati hanno mostrato valori variabili tra ceppi diversi, dal 26 all'88%, nel corso di un anno e mezzo. Un totale di 49 linee di topi OGM sono state conservate mediante criopreservazione dello sperma e successivamente recuperate mediante FIV in quattro ceppi femminili diversi. C 57 black six BC DBA one e 1 29 SV Una volta acquisita la tecnica di criopreservazione dello sperma, essa può essere eseguita in 30 minuti, se effettuata correttamente.Per questa procedura, è importante far defluire verticalmente nel contenitore e nell'azoto liquido.

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In questo video-articolo vi presentiamo un passo-passo dimostrazione su come raccogliere e crioconservare gli ovociti di criceto con elevate post-disgelo tassi di sopravvivenza. La stessa procedura può anche essere applicato con successo per congelare e scongelare embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo preimpianto.

Raccolta e Crioconservazione degli ovociti e di embrioni di topo criceto

Si tratta di un high-throughput protocollo di crioconservazione degli spermatozoi per zebrafish. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media del 25% la fertilità fertilizzazione in vitro successive ed è stabile per molti anni.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

Un glicole etilenico metodo basato vetrificazione per embrioni di topo è descritto. E 'vantaggioso per altri metodi nella sua semplicità e bassa tossicità embrionale, e quindi può essere ampiamente applicabile a molti ceppi di topi, compresi topi inbred e geni modificati.

Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

L'approccio specie comparata permette neuroscienziati comportamentali di esplorare diversi fattori neurobiologici associati a specifici comportamenti visti come caratteristiche di un modello animale specifico. Approfittando del naturale differenze di comportamento tra specie strettamente correlate, questa tecnica non richiede tecniche invasive per manipolare l'espressione del comportamento.

Utilizzando un approccio comparativo Specie per Indagare sulla Neurobiologia delle risposte paterno

In questo video, dimostriamo un metodo di crio-vetrificazione ultra-rapido per la conservazione di campioni biologici. Il metodo prevede l'uso di una combinazione di crioprotettori per proteggere il tessuto biologico dai danni da congelamento prevenendo la formazione intracellulare di cristalli di ghiaccio.

Crioconservazione basata sulla vetrificazione: una tecnica di raffreddamento ultrarapido per conservare campioni biologici a temperature molto basse per la conservazione a lungo termine

MicroSecure Vitrification è stato sviluppato come un sistema di vitrificazione chiuso asettico non commerciale, conforme alle buone pratiche di produzione e manipolazione dei tessuti della FDA. A causa del ritiro dall'industria delle paillettes per embrioni ostruite idrofobiche, la procedura di vitrificazione è stata modificata per includere un sigillo interno prima del tappo di cotone interno standard.

Modificato vetrificazione MicroSecure: Un altamente Procedura Crioconservazione sicuro ed efficace, semplice e per blastocisti umane

Lo scopo principale di questo studio era di adattare l'ago immerso procedura di vitrificazione (NIV) per crioconservare intero zebrafish testicoli. Inoltre, è stata testata la ripetibilità del metodo in cinque zebrafish diversi ceppi.

Crioconservazione degli spermatogoni di Zebrafish dall'intero testicoli ago immerso di raffreddamento ultra-rapido

Protocolli per la crioconservazione di maturazione e lo sperma di anguilla europea sono state migliorate negli ultimi anni. Questo articolo viene descritto il protocollo migliore disponibile con gonadotropina corionica umana (hCG) per indurre la maturazione e metanolo come crioprotettore.

Gestione e trattamento di maschio anguilla europea (Anguilla anguilla) per maturazione ormonale e crioconservazione degli spermatozoi

Qui presentiamo un metodo modificato per la crioconservazione di embrioni unicellulari, nonché un protocollo che afcoppia l'uso di embrioni congelato ed elettroporazione per la generazione efficiente di topi geneticamente modificati.

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

Questo protocollo descrive un percorso semi-automatizzato per migliorare l'efficienza e la capacità di elaborazione e crioconservazione dello sperma proveniente da specie di coralli minacciate, con l'obiettivo di garantire la diversità genetica e sostenere gli sforzi di ripristino della barriera corallina.

Un flusso di lavoro semi-automatizzato per la crioconservazione di sperma di corallo a supporto del biobanking e dell'acquacoltura

Impara la crioconservazione dello sperma di topo per la biologia riproduttiva utilizzando il kit I•Cryo. Questo metodo facilita l'archiviazione di linee geneticamente modificate con elevati tassi di sviluppo embrionale.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

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