Name: Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a criopreservação de espermatozoides de camundongo e recuperação usando o kit I·Cryo. Este método melhora o desenvolvimento embrionário em múltiplas linhagens e facilita o arquivamento de linhas geneticamente modificadas.

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A pesquisa aqui apresentada foi apoiada por Charles River. Os autores são muito gratos ao Modelos Geneticamente Modificadas e grupo de serviços e os funcionários Embriologia para cuidar dos animais e injeção de hormônio.

1. Criopreservação de esperma do mouse <ol><li> Para cada linha a ser criopreservados, prepare o seguinte antes de começar. <ol><li> Um bem de um prato 4-bem com 240 l de kit CPA </li><li> 15 de esperma palhas de criopreservação da seguinte forma <ol><li> Conecte a 0,25 ml palhas para a 1 ml seringas com o tampão de algodão mais próximo à seringa. Em cada palha, carga de 8 cm (aproximadamente 160 L) de meio de fertilização in vitro, em seguida, um centímetro de ar. Rotular os canudos com o nome da linha a ser preservado. </li></ol></li></ol></li><li> LN 2 deve ser de 15 cm de profundidade na caixa de espuma. Feche a tampa. </li><li> Euthanize dois camundongos machos de cada linha a ser criopreservados. Ratos deve estar entre 10 e 60 semanas de idade. Remova os dois epidídimos caudal juntamente com o canal deferente de cada rato. </li><li> Coloque o epidídimos no CPA previamente preparado contendo além de um prato 4-bem (passo 1.1). </li><li> 07/05 fazer cortes longitudinais em cada epidídimo e gentilmenteespremer cada vaso deferente para empurrar os espermatozóides para fora. </li><li> Agitar a mistura de CPA e epidídimo com a mão suavemente em temperatura ambiente por 3-5 minutos. Isto permitirá que os espermatozóides de nadar para fora. </li><li> Usando a palha preparada anteriormente, aspirado 5 mm (aproximadamente 10 ml) de suspensão de esperma e depois de 1 cm de ar. </li><li> Repita esse processo com até um total de 15 canudos. De carga e lacre canudos dentro de 10 minutos para a sobrevivência melhor esperma. </li><li> Sele ambos os lados da palha com cuidado. Coloque as palhetas na caixinha de congelamento com a coluna de esperma em primeiro lugar. </li><li> Anexar a pipeta de 1 ml fornecidos como parte do kit para a caixinha para estender a alça. Coloque o recipiente em LN 2 na caixa de espuma através do furo na tampa. Permitir que o recipiente para flutuar verticalmente na LN 2 para 10 minutos. </li><li> Mergulhe o canister no LN2. O esperma é agora criopreservados e pode ser movido para longo prazo LN 2 de armazenamento. </li><li> O recipiente não deve ser usado paraa próxima linha até que ele é aquecido à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Superovulação do mouse <ol><li> Geralmente, o uso camundongos fêmeas jovens da mesma origem que os doadores de esperma. </li><li> Ratos deve ser ~ 12 g (3-4 semanas de idade). </li><li> Realizar uma injeção intraperitoneal com UI de Pregnant mare 10/05 gonadotrofina sérica (PMSG). </li><li> Aguarde 46-48 horas. </li><li> Realizar uma injeção intraperitoneal com UI 10/05 da gonadotrofina coriônica humana (hCG). </li><li> Oócitos colheita h após a injeção de hCG 14-16, conforme descrito abaixo. </li></ol> 3. Recuperação do mouse esperma e fertilização in vitro <ol><li> Antes de fertilização in vitro, para cada palha para ser descongeladas, prepare o seguinte e estabilizar pelo menos uma hora em 37 ° C incubadora de CO 2. <ol><li> Prato de esperma de incubação: uma placa de Petri 35 milímetros, com uma queda de 90 mL de meio de esperma tratamento (STM) coberto com óleo. </li><li> Corte prato: Para a coleta de oócitos de um máximo de 10 superovulated fêmeas, uma 35 milímetros placa de Petri com 3 ml de meio de fertilização in vitro. </li><li> IVF bem: Para cada grupo de 5 fêmeas superovuladas para fertilização in vitro, um bem de um prato 4 bem com 500 mL de meio de fertilização in vitro (se você estiver usando 10 fêmeas superovuladas, por exemplo, você vai precisar de 2 poços...) </li><li> De lavar loiça: uma 35 milímetros placa de Petri com 3 ml de meio de potássio simplex otimizado (KSOM) para lavar cada poço da placa IVF-4 bem utilizado </li><li> Placa de cultura: um 35 milímetros placa de Petri com 50 mL de meio de gotas KSOM coberto com azeite, para cultura de embriões a partir de cada poço da placa IVF. </li></ol></li><li> Remover uma palha de LN 2 e coloque em banho-maria a 37 ° C por 2-3 minutos. </li><li> Remover a palha do banho de água e limpe a remover o excesso de água. Fazer o primeiro corte perto da coluna de ar mais próxima primeiro o tampão de algodão. Cortar a palha no meio de fertilização in vitro ainda haverá uma coluna de ar visíveis antes da coluna de esperma. </li><li> Em seguida, corte a ponta do canudo na sEGUNDA coluna de ar, tendo o cuidado de evitar o corte da coluna de esperma. Cortada num ângulo de 45 - isto irá tornar muito mais fácil para aspirar o espermatozóide. </li><li> Aspirar a suspensão de espermatozóides a partir da extremidade distal da palha com uma pipeta de 200 mL. </li><li> Lugar a suspensão de espermatozóides no centro da gota STM e incubar o prato por 45-60 minutos em 37 ° C de 5% CO 2 incubadora. </li><li> Durante a incubação de espermatozóides, dissecar os ovidutos das fêmeas superovuladas no prato de corte. Use uma agulha de 30 g ou uma pinça para arrancar cada oviduto, liberando os complexos cumulus-oócito (COCs). Evite gordura e sangue no meio de fertilização in vitro como sujos mídia faz para as etapas de lavagem extra. </li><li> Depois que todos os ovidutos foram rasgadas, transferir o COCs de 5 mulheres para cada poços de FIV. O número de COCs produzidos por superovulação é muito tensão dependente. </li><li> Coletar 10-15 mL de esperma a partir da periferia da queda STM e fertilizar uma fertilização in vitro bem aproximadamente 14-16 horas pós-inj hCGç ã o. Repita a fertilização para cada bem utilizados. Concentração espermática final será aproximadamente 1 milhão / ml. </li><li> Co-cultura de esperma e ovócitos para 4-6 horas a 37 ° C de 5% incubadora de CO 2. </li><li> Lavar os embriões com KSOM um mínimo de 2 vezes e cultura em gotas KSOM para o desenvolvimento de um 37 ° C de 5% incubadora de CO 2. </li><li> Taxa de fertilização in vitro foi calculada como dois embriões de células estágio de oócitos total utilizada após cultura durante a noite. </li></ol> 4. Resultados representante Esperma de cinco Charles cepas puras Rio rato foi congelado. Relações de proteção são calculadas dividindo-se os valores de avaliação do esperma congelado por valores nova avaliação do esperma. Razões de protecção da mobilidade do esperma foram 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% para C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, respectivamente. Relações de proteção para a motilidade progressiva rápida foram 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% em C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas<html> Crl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, respectivamente (Fig. 1). As taxas de fertilização in vitro com os espermatozóides congelados e descongelados foram 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% e 26,2% em C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, e BALB / cAnNCrl, respectivamente (Fig. 2) . Durante um período de 1,5 anos, 49 linhas do mouse GM foram arquivados por criopreservação de esperma. Estas linhas foram mais tarde recuperados com sucesso (como definido pela filhotes nascidos vivos) por FIV em 4 cepas do sexo feminino (C57BL / 6, BALB / c, DBA / 1 e 129Sv) (Fig. 3). <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> Figura 1. Rácios de Proteção da motilidade espermática e motilidade progressiva rápida em Ratos <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> Fertilização Figura 2. In Vitro com esperma congelado-descongelado em Ratos 3713fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Fertilização in vitro com esperma congelado-descongelado em camundongos GM

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
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<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

Os autores são funcionários da Charles River, o fabricante deste kit.

Desde 1990, o protocolo de congelamento de esperma básica usando rafinose 18% e 3% de leite desnatado provou ser confiável em muitas cepas de camundongos e um grande número de linhas do mouse foram criopreservados 1,2,3,4,5,6,7. As principais causas de danos às células de esperma durante o congelamento e descongelamento processo têm sido associados com a formação de gelo 8,9 e espécies reativas de oxigênio 10. Suplementação com varredores de radicais livres, tais como aminoácidos e agentes redutores, tais como monotioglicerol, no meio de congelamento foi investigada e comprovada para aumentar substancialmente a taxa de fertilização in vitro com os espermatozóides congelados e descongelados em linhagens puras, incluindo a C57BL / 6 11,6. No protocolo atual, que desenvolveu um novo I • Cryo kit de criopreservação de esperma do mouse através da otimização do CPA básica com antioxidantes comercialmente disponíveis e bloqueadores de gelo e modificando o congelamento de espermatozóides e procedimento de fertilização in vitro. Razões de protecção da motilidade espermática(&gt; 60%) e motilidade progressiva rápida (&gt; 45%) foram observados para o esperma de cinco linhagens de camundongos inbred congelados com a Cryo • Eu kit. O 2-célula estágio taxa de desenvolvimento do embrião com esperma congelado-descongelado em 5 linhagens de camundongos inbred foi marcadamente melhorado em comparação ao que, com base CPA 11,6. Ao utilizar o kit, o usuário cria uma suspensão de espermatozóides concentrado por congelamento de esperma 2 machos para cada linha. Por apenas 15 canudos de congelamento do processo é rápido, fácil e ocupa menos espaço de armazenamento para o armazenamento de curto ou longo prazo. Na maioria das vezes, as linhas do mouse podem ser recuperados por descongelamento apenas 1 ou 2 canudos.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornecido com o kit</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornecido com o kit</td></tr><tr><td>Meio de FIV</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornecido com o kit</td></tr><tr><td>Palhete plástico de 0,25 ml</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornecido com o kit</td></tr><tr><td>Recipiente para congelação de espermatozoides</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornecido com o kit</td></tr><tr><td>Canudo e cálice</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Fornecido com o kit</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Deve ser testado para embriões</td></tr><tr><td>Meio KSOM</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Seladora térmica</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>Placa multipoços de 4 poços</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipetador</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora a 37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de armazenamento em LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria a 37&amp;#x00B0;C</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 cc com agulha 26G 3/8</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura microcirúrgica</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de 30 gauge &amp;frac12;</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

criopreservação do mouse sperm and recovery utilizando o i · cryo kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Milhares de novos geneticamente modificados (GM) linhagens de camundongos foram criados desde o advento das tecnologias de transgênese e knockout. Muitos desses animais valiosos existem apenas como animais vivos, sem plano de backup em caso de emergência. Criopreservação de embriões pode fornecer esta cópia de segurança, mas é caro, pode ser um processo lento, e geralmente requer um grande número de animais para o sucesso. Desde a descoberta que o esperma do mouse podem ser criopreservados com sucesso com um agente básico crioprotectores (CPA), constituído por rafinose 18% e 3% de leite desnatado, a criopreservação de esperma tornou-se um procedimento aceitável e de baixo custo para arquivamento, distribuição e recuperação dessas cepas valiosa . Aqui demonstramos um recém-desenvolvido I • kit Cryo para mouse criopreservação de esperma. Esperma de cinco cepas comumente usados ​​de camundongos isogênicos foram congelados utilizando este kit e depois se recuperou. Maior proteção dos rácios de motilidade espermática (&gt;60%) e motilidade progressiva rápida (&gt; 45%) em relação ao controle (básico CPA) foram vistos por esperma congelado com este kit em 5 linhagens de camundongos inbred. Duas células desenvolvimento embrionário palco após a fertilização in vitro com o esperma recuperado foi melhorado de forma consistente em todas as cinco linhagens de camundongos examinados. Durante um período de 1,5 anos, 49 linhas do mouse GM foram arquivados por criopreservação de espermatozóides com a Cryo kit • I e mais tarde recuperado por fertilização in vitro.

Aqui demonstramos a recém-desenvolvida I • kit Cryo para mouse criopreservação de esperma. Duas células desenvolvimento embrionário palco com descongelado esperma foi melhorado consistentemente em cinco linhagens de camundongos com a utilização deste kit. Durante um período de 1,5 anos, 49 linhas de camundongos geneticamente modificados foram arquivados por criopreservação de espermatozóides com a Cryo kit • I e mais tarde recuperados com sucesso por fertilização in vitro.

Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit

Milhares de novas linhagens de camundongos geneticamente modificados (GM) foram criadas desde o advento da transgênese e das tecnologias de knockout. Muitas dessas...

O objetivo geral deste procedimento é criopreservar espermatozoides de camundongo. Isso é realizado primeiramente coletando espermatozoides de EPIs de camundongo utilizando palhetas para criopreservação. As palhetas são então congeladas em nitrogênio líquido, onde são armazenadas até serem recuperadas pelo descongelamento em água morna.Os espermatozoides de camundongo recuperados são, em última instância, utilizados para fertilização in vitro. A principal vantagem deste kit em relação aos métodos existentes é que ele contém todos os materiais necessários para criopreservar e recuperar espermatozoides de camundongo. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades com o manuseio e o carregamento das palhetas. Comece montando 15 palhetas de criopreservação de espermatozoides por linhagem de camundongos a ser criopreservada.Primeiro, conecte cada palheta de 0,25 mililitro a uma seringa de um mililitro, com o tampão de algodão voltado para o lado mais próximo da seringa. Em seguida, carregue oito centímetros de meio de FIV em cada palheta, seguidos por um centímetro de ar. Por fim, identifique cada uma das 15 palhetas com o nome da linhagem a ser preservada para cada linhagem a ser criopreservada.Encha um poço de uma placa de quatro poços com 240 microlitros de agente crioprotetor. Fixe uma pipeta de um mililitro ao cabo do recipiente de congelamento para prolongar o cabo. Por fim, encha a caixa isolada com espuma fornecida no kit com 15 centímetros de nitrogênio líquido e feche a tampa para eutanasiar.Dois camundongos machos adultos férteis. Para cada linhagem a ser criopreservada, remover cirurgicamente seus EPIs caudais. Colocar o camundongo em decúbito dorsal e abrir a parede corporal ventral.Puxe suavemente o ducto deferente e remova qualquer excesso de gordura. Em seguida, localize o epidídimo e remova-o intacto com um pequeno pedaço do ducto deferente. Coloque os EPIs em um poço de uma placa de quatro poços preparada, contendo CPA, sob um microscópio estereoscópico.Realize cinco a sete cortes longitudinais em cada epidídimo. Em seguida, usando uma pinça, comprima suavemente cada fragmento. Para expelir os espermatozoides, incube a mistura de CPA e epidídimo à temperatura ambiente por três a cinco minutos.Agite suavemente o recipiente manualmente duas a três vezes durante a incubação. Isso permitirá que os espermatozoides saiam por aspiração. Carregue cada palheta preparada com cinco milímetros da suspensão de espermatozoides, seguido por um centímetro de ar.É importante para o processo de congelamento que todos os palhetes sejam carregados igualmente. Após carregar os 15 palhetes, selar cuidadosamente ambas as extremidades de cada palhete com calor. Para garantir a sobrevivência dos espermatozoides, completar o processo para os 15 palhetes dentro de 10 minutos.Uma vez que todos os palitos estejam preparados, carregue-os na coluna de sêmen do recipiente de congelamento. Primeiro, coloque o recipiente na caixa de isopor e permita que ele flutue verticalmente no nitrogênio líquido. Durante 10 minutos, o recipiente deve permanecer flutuando verticalmente, caso contrário a taxa de congelamento do sêmen será afetada.Em seguida, imergir o recipiente no nitrogênio líquido. Assim, o esperma é criopreservado e fica pronto para armazenamento de longo prazo em nitrogênio líquido. Aproximadamente 60 horas antes de uma recuperação planejada de esperma.Siga o protocolo escrito para superovular fêmeas antes da FIV. Para cada palheta a ser descongelada, prepare e equilibre todos os meios por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Esses materiais incluem uma placa de Petri de 35 milímetros com uma gota de 90 microlitros de meio de tratamento de espermatozoides coberta com óleo.Um prato de Petri de 35 milímetros com três mililitros de meio IVF para servir como prato de corte e, para cada cinco fêmeas superovuladas, prepare um prato IVF, que consiste em um poço de uma placa de quatro poços contendo 500 microlitros de meio IVF. Para cada prato IVF, prepare um prato de lavagem, que é um prato de Petri de 35 milímetros com três mililitros de KSOM, e um prato de cultura de embriões, que é um prato de Petri de 35 milímetros com gotas de 50 microlitros de meio KSOM cobertas com óleo. Com todos os materiais necessários preparados, remova rapidamente uma palheta do armazenamento e coloque-a em um banho-maria a 37 graus Celsius por dois a três minutos.Seque a palheta. Em seguida, faça um corte oblíquo na coluna de ar abaixo do tampão de algodão. Na outra extremidade da palheta, faça outro corte oblíquo sobre uma segunda coluna de ar.Evite cortar a coluna de espermatozoides. Agora aspire a suspensão de espermatozoides da extremidade do canudo, utilizando uma pipeta de 200 microlitros, e deposite-a no centro do meio de tratamento de espermatozoides. Em seguida, incube a placa por 45 a 60 minutos.Durante a incubação dos espermatozoides, isole os UCs das fêmeas superovuladas e transfira-os para a placa de dissecção. Use uma agulha de 30 ou pinça para rasgar cada oviduto, liberando os complexos cumulus-células. Transfira os CCs de cinco fêmeas para cada FIV.Bem, com uma quantidade mínima de meio. Evite transferir gordura e sangue, pois meios contaminados inibem a eficiência da fertilização. Após a incubação, colete de 10 a 15 microlitros da suspensão de espermatozoides da periferia da gota de STM e deposite a suspensão em um único procedimento de FIV.Agora, realize a cocultura das células por quatro a seis horas para fecundação. Após a fecundação, passe os embriões por pelo menos duas lavagens com SOM 2K no recipiente de lavagem. Em seguida, cultive.Os embriões em KSOM até que o estágio de desenvolvimento desejado seja atingido. O esperma de cinco linhagens endogâmicas de camundongos Charles River foi congelado. As taxas de proteção da motilidade espermática e da motilidade progressiva rápida variaram de 81% a 47% entre as cinco linhagens provenientes desses espermatozoides.As taxas de FIV com espermatozoides congelados e descongelados variaram entre 26 e 88% em diferentes linhagens ao longo de um ano e meio. Um total de 49 linhagens de camundongos GM foi arquivado por criopreservação de espermatozoides e posteriormente recuperado por FIV em quatro linhagens femininas diferentes. C57 black six, BC, DBA1 e 129SV. Uma vez dominada, a técnica de criopreservação de espermatozoides pode ser realizada em 30 minutos, se executada corretamente.Para este procedimento, é importante fluir para o cilindro verticalmente e com nitrogênio líquido.

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Biologia

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Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

A abordagem comparativa permite que os neurocientistas espécies de comportamento para explorar vários fatores neurobiológicos associados com comportamentos específicos vistos como característica de um modelo animal específico. Aproveitando naturalmente diferenças de comportamento entre espécies estreitamente relacionadas, esta técnica não requer técnicas invasivas para manipular a expressão do comportamento.

Usando uma abordagem comparativa de espécies para investigar o Neurobiology of Responses Paternal

Neste vídeo, demonstramos um método de criovitrificação ultrarrápida para preservar amostras biológicas. O método envolve o uso de uma combinação de crioprotetores para proteger o tecido biológico dos danos causados pelo congelamento, evitando a formação de cristais de gelo intracelulares.

Criopreservação baseada em vitrificação: uma técnica de resfriamento ultrarrápido para preservar espécimes biológicos em temperaturas muito baixas para armazenamento de longo prazo

MicroSecure Vitrification foi desenvolvido como um sistema de dispositivo de vitrificação fechado asséptico não comercial que está em conformidade com as boas práticas de fabricação e manuseio de tecidos da FDA. Devido à retirada de canudos de embriões com tamponamento hidrofóbico da indústria, o procedimento de vitrificação foi modificado para incluir uma vedação interna antes do tampão de algodão interno padrão.

Modificada Vitrificação MicroSecure: Um Altamente procedimento seguro, simples e eficaz para Criopreservação blastócitos humanos

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

Protocolos de criopreservação de maturação e esperma de enguia Europeia foram melhorados nos últimos anos. Este artigo descreve o melhor protocolo disponível usando gonadotrofina coriônica humana (hCG) para induzir a maturação e metanol como crioprotetor.

Manipulação e tratamento de macho Europeu enguias (Anguilla anguilla) para maturação Hormonal e criopreservação de esperma

Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.

Uso de embriões congelados para produção de ratos geneticamente modificados

Este protocolo descreve um caminho semiautomatizado para melhorar a eficiência e a capacidade de processamento e criopreservação de espermatozoides de espécies de corais ameaçadas, com o objetivo de garantir a diversidade genética e apoiar os esforços de restauração de recifes.

Um fluxo de trabalho semiautomatizado para a criopreservação de espermatozóides de coral para apoiar biobancos e aquicultura

Aprenda a criopreservação de espermatozoides de camundongo e recuperação usando o kit I·Cryo. Este método melhora o desenvolvimento embrionário em múltiplas linhagens e facilita o arquivamento de linhas geneticamente modificadas.

Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit

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