Tecniche analitiche per il saggio Bioattività Ossido Nitrico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare come rilevare in modo accurato e specifico i metaboliti dell'ossido nitrico nei campioni biologici. Ciò si ottiene elaborando i campioni di sangue immediatamente dopo la raccolta per prevenire la perdita di metaboliti o la formazione di artefatti. Allo stesso tempo, viene eseguito un prelievo di tessuto rapido ed efficiente per ridurre al minimo gli effetti di un ambiente ipossico sui metaboliti dell'ossido nitrico.

Gli anelli aortici vengono raccolti e appesi in un bagno d'organo per valutarne la funzione endoteliale. Inoltre, i saggi biochimici vengono utilizzati per quantificare i livelli di nitrati, i livelli di nitriti e i livelli relativi di nitrotioli e altri prodotti nitrosati nel tessuto. Utilizzando questi saggi, un corretto confronto tra animali da esperimento e di controllo può generare informazioni preziose sulla produzione e sul metabolismo dell'ossido nitrico.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di questo approccio multisistemico rispetto a singoli metodi o saggi è che ciò consentirebbe un quadro più ampio della biochimica dell'ossido nitrico in più sistemi di organi. Quindi possiamo iniziare a capire quali di questi metaboliti possono avere utilità prognostica o diagnostica e come il repertorio dei metaboliti dell'ossido nitrico rifletta la formazione e la disponibilità di ossido nitrico endoteliale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto ogni fase del processo è fondamentale per mantenere l'integrità del campione.

Alcuni di questi passaggi non sono evidenti dalla sezione dei metodi di lettura in una rivista tipica a causa dei dettagli della raccolta dei campioni e dell'estrazione dei tessuti. A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Hong Jing. Un ricercatore senior nel mio laboratorio Per questo protocollo ho a disposizione una persona o un animale da esperimento per un prelievo di sangue per animali da esperimento i cui tessuti saranno anche esaminati.

Innanzitutto, raccogli il sangue intero inserendo un ago da 25 gauge nella vena cava inferiore. Una volta raccolti da 500 a 1000 microlitri, perfondere l'animale libero dal sangue residuo infondendo il tampone fisiologico attraverso l'apice del ventricolo sinistro e consentire la sostituzione completa del sangue quando il sangue e il tampone escono attraverso il ven CVA inferiore. Il sangue venoso deve essere raccolto in provette da centrifuga da 1,5 millilitri contenenti NEM e EDTA immediatamente dopo la raccolta.

Centrifugare il sangue a 14.300 RCF per sette minuti dopo la centrifugazione. Aspirare il plasma dal pellet di globuli rossi con una pipetta e trasferirlo in una provetta separata. Preparare i campioni di plasma isolato per l'HPLC aggiungendo prima un volume uno a uno di metanolo freddo a 50 microlitri di raccolta al plasma.

Agitare energicamente la miscela per tre-cinque secondi fino a quando non diventa torbida. Quindi centrifugare la miscela a 14, 300 RCF per sette minuti. Per precipitare le proteine plasmatiche, raccogliere il supernat in una provetta separata da 1,5 millilitri e conservarlo a quattro gradi Celsius fino a quando non può essere analizzato.

Per preparare il plasma per l'analisi in chemiluminescenza, prendere il volume di plasma rimanente, che dovrebbe essere di circa 200-400 microlitri, e dividerlo in due volumi. Preparare metà del plasma aggiungendo un volume del 10% di solfuro acidificato al 5% e attendere 10 minuti. Questo campione è ora pronto per l'analisi CLD.

Preparare un'altra metà del plasma aggiungendo il 10% in volume di cloruro di mercurio al 2% dopo cinque minuti. A temperatura ambiente, aggiungere il 10% in volume di sulfonamide acidificato. Attendere altri 10 minuti e iniettare questo campione nel CLD come il plasma.

Il pellet di globuli rossi può essere preparato per HPLC e CLD per entrambe le analisi. Inizia mescolando una parte di pellet cellulare con quattro parti di soluzione di lisi ipotonica. Agitare accuratamente la miscela per l'analisi CLD.

La preparazione delle cellule è la stessa che si esegue per il plasma. Inizia aggiungendo un volume uguale di metanolo. Quindi agitare energicamente la miscela per tre o cinque secondi, quindi farla girare per sette minuti a 14, 300 RCF.

Ora pipettare il surnatante e conservarlo a quattro gradi Celsius fino a quando non può essere analizzato mediante HPLC per determinare i livelli tissutali di metaboliti dell'ossido nitrico. Nei tessuti di interesse provenienti da animali da esperimento, il sangue deve essere prima raccolto e preparato come descritto nella sezione precedente, il prelievo dei tessuti deve essere effettuato come al solito con particolare attenzione alla velocità e all'efficienza in modo che i tessuti non diventino ipossici. Una volta raccolti, omogeneizzare i campioni di tessuto in un rapporto da uno a cinque di N-E-M-E-D-T-A contenente PBS.

Quindi preparare i tessuti omogeneizzati per l'analisi HPLC e CLD come descritto nelle sezioni precedenti per i globuli rossi. Dopo aver anestetizzato un topo adulto con etere datilico e aver confermato che non risponde a un pizzicamento del dito del piede, eseguire una toracotomia. Viene praticata un'incisione sulla linea mediana dallo sterno fino alla regione pubica per esporre le cavità toraciche e addominali.

Quindi, perfondere l'animale con tampone Krebs Alite ossigenato. Utilizzare una siringa da 25 gauge per iniettare il tampone all'apice del ventricolo sinistro. Con l'atrio destro viene tagliato per fornire un'uscita per il sangue.

Dopo la perfusione, isolare l'aorta addominale tagliando e rimuovendo il fegato, i polmoni e altri tessuti che possono coprire l'aorta. Quindi, tieni il cuore con un paio di pinze e taglia via l'aorta dalla parete posteriore dell'animale in modo delicato. Metti il cuore e l'aorta in una capsula di Petri piena di ghiaccio.

Tampone Krebs freddo nel piatto. Tagliare e pulire con cura il grasso e l'avventizia dall'aorta. Evitare di danneggiare l'endotelio all'interno del vaso durante la pulizia.

Mantieni lento il metabolismo dell'aorta per prevenire l'ipossia trasferendola in un tampone ossigenato fresco e ghiacciato ogni cinque minuti. Ora usa un bisturi per tagliare l'aorta in segmenti a forma di anello lunghi tre millimetri. Trasferire i segmenti in un bagno di organi tissutali a quattro canali da 10 millilitri caricato con tampone Krebs ossigenato.

Utilizzando la manopola del trasduttore, applicare 1,5 grammi di pretensionamento a ciascun anello aortico. Secondo i risultati empirici. 1,5 grammi è la tensione di avviamento appropriata per una funzione vasomotoria ottimale.

Nel mouse monitorare e registrare la misurazione della forza utilizzando un ponte ottale a otto canali e un software di acquisizione dati, lasciare che gli anelli si equilibrino per 80 minuti, cambiando il tampone ogni 20 minuti, quindi procedere con la sperimentazione. Dopo che la tensione del tessuto si è equilibrata, aggiungere 100 nanomolari di finocchio a ciascun anello per una contrazione submassimale. Una volta che la tensione dell'anello si è stabilizzata e c'è un livello costante di tono, eseguire un'analisi dose-risposta a un agonista endoteliale come l'acetilcolina.

Questo determinerà la produzione di ossido nitrico e il grado di rilassamento dei vasi. Dopo la dose di risposta all'acetilcolina, sciacquare i bagni con tampone Krebs e aggiungere 100 nanomolari di finocchio in ogni bagno d'organo per contrarre i vasi. Ancora una volta, determinare la reattività degli anelli muscolari lisci a una fonte esogena di ossido nitrico come il lato nitropress di sodio con e senza ODQ, un inibitore della ciclasi solubile di aguglia.

Questo tipo di approccio determinerà un valore di rilassamento del 100% per i vasi e dimostrerà anche la natura essenziale della guile ciclasi solubile nel mediare la risposta dell'ossido nitrico al rilassamento vascolare. Poiché l'ODQ impedirà il rilassamento al sodio nitro IDE in risposta all'acetilcolina, gli anelli aortici dal controllo sano, i topi si sono rilassati mentre gli anelli aortici dai topi con disfunzione endoteliale hanno mostrato un rilassamento ridotto a causa di una riduzione della produzione di ossido nitrico. Sono stati condotti anche saggi di denitro specifici per gruppo sulla chemiluminescenza del nitrito negli animali di controllo.

RSNO e RNNO sono stati rilevati utilizzando un test riduttivo de nitros. Sottraendo le aree di picco, sono stati misurati i livelli di nitriti e r sno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ossido nitrico e della biologia vascolare, ad esempio in che modo i livelli circolanti di questi metaboliti dell'ossido nitrico riflettono i livelli tissutali e come cambiano i metaboliti della malattia in diverse condizioni di malattia?

La determinazione delle concentrazioni allo stato stazionario e dell'emivita di questi metaboliti rilevanti dell'ossido nitrico in più sistemi di organi e in tutta la circolazione di un singolo animale consentirà l'identificazione di specifiche firme molecolari dei processi patologici e ci aiuterà a definire nuove modalità di trattamento basate sull'ossido nitrico, che consentiranno al medico di essere armato di migliori biomarcatori per la gravità o la progressione della malattia. In generale, gli individui che non conoscono il campo dell'acido nitrico avranno difficoltà perché molti minimizzano abbastanza sensibili da rilevare e quantificare questi bassi livelli di metabolizzare l'acido trico trovati nei campioni biologici. Prima di tutto, una persona non esperta nell'arte probabilmente creerà artefatti durante l'elaborazione del campione che richiedono dati errati e un'interpretazione errata dei dati.