Isolamento delle cellule basali e sottomucosa cellule del dotto di Gland mouse Trachea

Lo scopo di questo metodo è isolare cellule staminali dai dotti delle ghiandole sottomucose della trachea del topo per studiarne la riparazione e rigenerazione. In primo luogo, la trachea viene dissezionata da un topo sacrificato. La trachea viene quindi pulita, tagliata e digerita.

Quindi l'epitelio viene asportato meccanicamente e ulteriormente digerito per generare una sospensione di cellule singole. Le cellule vengono quindi marcate con anticorpi, separate mediante FACS e infine preparate per essere utilizzate in saggi in vivo e in vitro. In definitiva, questo metodo può contribuire a identificare i principali percorsi molecolari che regolano le vie aeree, le cellule staminali epiteliali, l'auto-rinnovamento e la differenziazione.

Queste tecniche sono importanti perché ci forniscono modelli di riparazione e rigenerazione delle vie aeree in vitro ed ex vivo, a livello epiteliale. Ciò ci consente di studiare sia la riparazione normale delle vie aeree sia le malattie delle vie aeree, come la malattia polmonare ostruttiva cronica, la fibrosi cistica e l'asma. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando non siamo riusciti a trovare marcatori superficiali specifici per isolare le cellule basali dalle cellule staminali duttali, e quindi abbiamo deciso di rimuovere l'epitelio superficiale insieme alle cellule basali, lasciando indietro le cellule duttali. Dimostrazione delle procedure di dissezione della trachea.

Lo stripping dell'epitelio delle vie aeree, la creazione di una sospensione di singole cellule e il sorting delle cellule verranno eseguiti da Hega. Un ricercatore postdottorato del mio laboratorio che dimostra le procedure di elaborazione delle cellule ordinate nei modelli in vitro ed ex vivo è sì, Orga il nostro responsabile di laboratorio. Iniziare questa procedura tagliando l'apertura della parete addominale di un topo eutanasizzato.

Spostare gli intestini lateralmente per esporre l'aorta addominale e quindi dissezionarla. Aprire il torace tagliando il diaframma e la parete toracica interna su entrambi i lati per esporre il cuore e i polmoni. Continuare a tagliare verso l'alto lungo il collo, rimuovendo il tessuto adiposo e le ghiandole salivari per esporre la trachea utilizzando forbici fini.

Rimuovere il timo e staccare il polmone dal tessuto connettivo sottostante e posteriore. Inserire quindi la pinza tra la trachea e l'esofago per separarli. Tagliare la trachea nella sua parte più alta, al di sopra della sua connessione con la laringe.

Successivamente, afferrare la trachea con la pinzetta ed estrarla dal suo punto di inserzione. Procedendo verso il basso, rimuoverla insieme al blocco cuore-polmoni, recidendo cuore e polmoni in prossimità dell'ilo per includere la maggior parte dei bronchi principali destro e sinistro. Posizionare la trachea in una piccola capsula di Petri contenente mezzo di raccolta, posta su ghiaccio sotto il microscopio stereoscopico.

Utilizzare una pinzetta molto fine numero cinque, un tubo venoso e delle forbici per rimuovere qualsiasi tessuto aderente alla trachea. Ciò include linfonodi, grasso del nervo laringeo ricorrente, ghiandola tiroidea e vasi polmonari residui. La parte superiore della trachea richiede particolare attenzione per rimuovere i grossi frammenti di cartilagine laringea senza compromettere il più grande gruppo di ghiandole sottomucose situato tra la cartilagine CRICO e il primo anello cartilagineo tracheale C1.

Successivamente, tagliare la trachea nella parte superiore e nella parte inferiore tra la quarta e la quinta vertebra cervicale (C4 e C5), quindi effettuare un ulteriore taglio. Aprire entrambe le parti attraverso il lume della trachea. Trasferire la parte inferiore della trachea in una provetta microcentrifuga da un millilitro e la parte superiore della trachea in una provetta conica da 15 millilitri per la digestione enzimatica e la successiva elaborazione in sospensioni cellulari singole.

Nella parte successiva della procedura, le porzioni inferiore e superiore della trachea vengono trattate per generare sospensioni cellulari singole. Sebbene qui debbano essere processate contemporaneamente, i due metodi verranno dimostrati in modo sequenziale. Per processare la parte inferiore della trachea, aggiungerla a un millilitro di 16 unità di dis nello spazio di una provetta per microcentrifuga, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Quindi trasferire la trachea in un nuovo tubo contenente 0,5 milligrammi per millilitro di DNAasi I in DMM per ulteriori 20 minuti a temperatura ambiente dopo la digestione; utilizzare pinzette fini per trasferire il tessuto in una piastra di Petri sterile contenente mezzo di raccolta fresco. Successivamente, sotto il microscopio stereoscopico, rimuovere l'epitelio superficiale tirando delicatamente sui foglietti epiteliali per separarli dalla membrana basale sottostante. In seguito, utilizzare una pipetta per trasferire il mezzo contenente l'epitelio rimosso in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a 1000 ×g a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il SNAT e aggiungere tripsina 0,1% EDTA; incubare il tubo in un incubatore agitato a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta con punta da 1000 microlitri per aspirare e dispensare ripetutamente il campione, rompendo gli aggregati cellulari ed assicurando che le cellule formino una sospensione di cellule singole. Posizionare la parte superiore della trachea in un tubo conico contenente un millilitro di Pronasi 0,15%, quindi incubare a quattro gradi Celsius per quattro ore. Trasferire la parte inferiore della trachea in un microtubo da un millilitro contenente un millilitro di mezzo con 16 unità di disc base.

Dopo l'incubazione, vortexare delicatamente il tubo e quindi immergere la trachea in un mezzo di raccolta fresco. Al microscopio stereoscopico, verificare il completo distacco dell'epitelio superficiale. Utilizzare forbici fini per tritare la trachea ed esporre i compartimenti delle ghiandole sottomucose.

Incubare ancora per un'ora in pronasi allo 0,15% a temperatura ambiente con agitazione lenta. Centrifugare il tessuto tracheale dopo aver rimosso la pronasi. Aggiungere tripsina EDTA allo 0,1% e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti con agitazione.

Successivamente, filtrare i frammenti più grandi utilizzando un setaccio da 70 micron. Quindi lavare il setaccio con mezzo di coltura. Far passare gli aggregati cellulari digeriti e tutti i frammenti residui di ghiandole attraverso aghi da 20, 23 e 26 gauge utilizzando una siringa da 10 millilitri.

Ripetere l'operazione di confezionamento diverse volte con ciascuna dimensione dell'ago prima di passare a quella successiva. A questo punto, la maggior parte delle cellule dovrebbe trovarsi in sospensione monocellulare. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 40 micron, quindi lavare il filtro con mezzo di coltura e centrifugare le cellule.

Quindi ricostituire le cellule nel volume appropriato di mezzo, contare le cellule e procedere immediatamente alla colorazione e al sorting. Prelevare un numero sufficiente di cellule per preparare i tubi di compensazione non colorati e singolarmente colorati. Successivamente, colorare il resto delle cellule con anticorpi primari contro tropo tubulo e ITGA6 per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare con PBS o mezzo di raccolta, rimuovendo con grande attenzione il soprannatante.

Disperdere il pellet cellulare con l'anticorpo secondario appropriato. Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi lavare ed eliminare la soluzione, quindi disperdere il pellet.

Le cellule possono ora essere separate mediante citometria a flusso attivata da fluorescenza. Dopo che le cellule sono state ordinate, possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di riparazione e rigenerazione al fine di generare colture in vitro capaci di formare sfere. Mescolare 100 microlitri di matrigel con fattori di crescita ridotti con 100 microlitri di mezzo completo contenente fino a 50.000 cellule ordinate.

Pipettare questa miscela nella camera superiore di una piastra trans well da 24 pozzetti; nella camera inferiore pipettare 400 microlitri di mezzo completo e incubare a 37 gradi Celsius. Cambiare il mezzo nella camera inferiore ogni due giorni e aggiungere ulteriori 100 microlitri di matrigel ogni settimana o prima, se diventa sottile.

Le sfere si formano tipicamente dopo sette giorni e possono essere coltivate per diverse settimane o passate in modo seriale. Per il modello in vivo, ricostituire il pellet di cellule ordinate in mezzo completo mescolato in rapporto uno a uno con matri gel a una concentrazione di 5.000-10.000 cellule per 50 microlitri. Dopo aver anestetizzato il topo C57 black six ricevente, sterilizzare e rasare la schiena, quindi la parte superiore della schiena.

Eseguire un'incisione cutanea longitudinale centrale. Utilizzare il lato ottuso della lama delle forbici per allargare le tasche tra la cute e la parete toracica posteriore su entrambi i lati. Spingere l'arto del mouse verso l'alto e all'indietro per spostare e identificare il bordo mediale della scapola.

Quindi, utilizzando una siringa per insulina da 300 microlitri, iniettare 50 microlitri della sospensione cellulare nel cuscinetto adiposo appena mediale alla scapola e laterale alle vertebre. Deve formarsi una bolla; ripetere l'iniezione sull'altro lato, quindi rimuovere le graffette o i punti di sutura dall'incisione cutanea dopo tre settimane. Aprire la cute del topo sacrificato come in precedenza ed estrarre l'intero cuscinetto adiposo da entrambi i lati con un margine di sicurezza.

Per evitare di perdere qualsiasi struttura tissutale che possa essersi formata ed estesa attorno, fissare il cuscinetto adiposo dissezionato in PFA e incorporarlo in paraffina per evitare di saltare o trascurare strutture durante il taglio del blocco. Tagliare una volta 40 micron, quindi effettuare una sezione di quattro micron.

Posizionarlo su un vetrino e quindi esaminarlo al microscopio per determinare la presenza di strutture epiteliali. Se non si osserva nulla, tagliare nuovamente ed eseguire nuovamente questo passaggio. La rimozione della trachea del topo, come descritta in questo video, produrrà una trachea denudata che risulta visibile mediante microscopia ottica, come mostrato qui nelle trachee denudate.

Dopo 30 minuti di digestione con pronasi, a sinistra sono mostrati i trachei con epitelio e quelli denudati. A destra sono mostrati i trachei dopo quattro ore di digestione con pronasi. Dopo la rimozione dell'epitelio, le ghiandole sottomucose vengono rilasciate dai tessuti e assomigliano a grappoli d'uva.

La rimozione delle cellule epiteliali superficiali è indicata con frecce nere. La rimozione delle cellule nelle ghiandole sottomucose e nei dotti è indicata con frecce verdi. La citometria a flusso delle sospensioni cellulari singole dovrebbe mostrare i grafici di scattering anteriore e scattering laterale come mostrato qui.

Ottima separazione delle cellule duttali dal resto. Se le cellule tracheali devono essere visualizzate con l'anticorpo Trop due mediante citometria a flusso per il sorting cellulare attivato da fluorescenza, dopo circa una settimana di coltura dovrebbero essere visibili sfere nel matrigel: di aspetto luminale quando derivate da cellule basali e di aspetto denso quando derivate da cellule duttali. L'efficienza di questo processo è dell'ordine dell'1-2% e saranno ancora presenti cellule singole nel matrigel, che probabilmente rappresentano cellule dei dotti delle ghiandole sottomucose prive della capacità di autorinnovamento.

Le sferoidi basali sono più grandi e hanno un aspetto luminale. L'iniezione di cellule staminali duttali nel cuscinetto adiposo del topo porta alla formazione di ghiandole sottomucose, strutture simili a sferoidi dotate di un lume centrale. Queste strutture sono visibili nei blocchi anche in assenza di colorazione con ematossilina ed eosina.

Sono necessarie molte sezioni trasversali del cuscinetto adiposo per ottenere un frammento che contenga queste strutture epiteliali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare una popolazione di cellule staminali dai dotti della ghiandola subiacoidea e, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 10 ore. Dopo questa procedura, le condizioni di coltura possono essere modificate per rispondere a diverse domande relative alla formazione di sfere e alla rigenerazione mediante fattori di crescita stimolanti.