Name: Isolamento delle cellule basali e sottomucosa cellule del dotto di Gland mouse Trachea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Impara a isolare cellule staminali basali e dei dotti ghiandolari dalla trachea di topo per studiare la rigenerazione epiteliale. Questo metodo consente di analizzare il rinnovamento cellulare in vivo e in vitro.

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Vorremmo riconoscere gli indirizzi di massima Stem Cell FACS centro di ricerca e in particolare ringrazio Jessica Scholes e Felicia Codrea per il loro aiuto con la selezione delle cellule. Il lavoro è stato finanziato dal CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / BPCO Fondazione ATS-06-065, la Fondazione preoccupazione, Il toracica UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Oncology Program / Lung Cancer SPORE, l&#39;Università della California Cancer La ricerca e il Comitato di Coordinamento Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).

Schema delle fasi di 1. Dissezione della trachea 2. Pulizia trachea e tagliarlo 3. Enzima digestione e la trasformazione in sospensione singola cella 4. La colorazione per FACS e l&#39;ordinamento 5. Lavorazione di cellule filtrate per in vivo e in vitro 1. Dissezione di Trachea <ol><li> Euthanize il mouse con una iniezione intraperitoneale di 0,1 cc mg/0.2 di pentobarbital. </li><li> Tagliare la parete addominale, e spostare l&#39;intestino verso il lato per esporre l&#39;aorta addominale e poi sezionarlo. </li><li> Aprite la cassa, tagliando attraverso il diaframma e della parete toracica anteriore su entrambi i lati per esporre il cuore ei polmoni. Continua tagliando nel collo rimuovendo le ghiandole salivari e grassi per esporre la trachea. </li><li> Togliere il timo e tagliare il polmone al largo delle sue connessioni sotto e dietro. Separmangiato la trachea dall&#39;esofago inserendo una pinza tra loro poi tagliare la trachea nella sua parte più alta sopra la sua connessione con la laringe. Quindi tenete la trachea con una pinza e sezionarlo dal suo attaccamento e continuare verso il basso per rimuoverlo con il cuore e polmone en-blocco. Tagliare il cuore ei polmoni, vicino alla ilo includere la maggior parte dei bronchi principali destro e sinistro. </li><li> Posizionare la trachea in una piccola scatola di Petri contenente la raccolta media su ghiaccio. </li></ol> 2. Pulizia Trachea e Cutting It <ol><li> Sotto il microscopio da dissezione, utilizzare pinze punto molto fini (n ° 5) e Vannas forbici Tübingen (FST 15003-08 finescience.com) per pulire la trachea da tutti gli altri tessuti ad esso. Ciò include: linfonodi, nervo laringeo ricorrente, grassi, tiroide e le restanti vasi polmonari. La parte superiore della trachea richiede un&#39;attenzione particolare, per rimuovere le cartilagini laringee grandi senza compromettere il più grande gruppo di SMGche è stata presentata tra la cartilagine cricoide e il primo anello tracheale cartilagineo (C1) 4. </li><li> Tagliare la trachea nella parte superiore e la parte inferiore tra C4 e C5 e quindi tagliare aprire entrambe le parti attraverso il lume della trachea. </li></ol> 3. Digestione enzimatica e Trasformazione in sospensione singola cella (SCS) <ol><li> Incubare la parte inferiore della trachea in 1 ml di 16 dispasi U in una provetta Eppendorf a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti, come precedentemente descritto 5. Quindi aggiungere 0,5 mg / ml DNasi I in DMEM per ulteriori 20 minuti a RT. </li><li> Rimuovere le trachee digeriti in fresco medio di raccolta in una piastra di Petri sterile, e spellare l&#39;epitelio superficiale sotto il microscopio da dissezione. Utilizzare una pipetta per trasferire il terreno contenente l&#39;epitelio spogliato in una provetta da 50 ml. </li><li> Centrifugare la epitelio strippato a 1000 xga 4 ° C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,1% tripsina / EDTA e incubare agitando °in un tubo e 37 ° C agitando incubatore (200 rpm) per 30 min. Dopo l&#39;incubazione, utilizzando una punta 1000 microlitri, pipettare su e giù per rompere grumi e formano un&#39;unica sospensione cellulare. </li><li> Posizionare la trachea superiore in un tubo conico contenente 1 ml di 0,15% pronasi. Incubare a 4 ° C per 4 h. </li><li> Vortex delicatamente il tubo e quindi inserire la trachea nel terreno raccolta fresca e confermare sotto il microscopio da dissezione che c&#39;è completo distacco dell&#39;epitelio di superficie (SE). </li><li> Tritate la trachea con una forbice fine per aprire i vani SMG e poi incubare per un&#39;ora di più in pronasi a temperatura ambiente con agitazione lenta. </li><li> Centrifugare il tessuto tracheale, rimuovere la pronasi, aggiungere 0,1% tripsina / EDTA e incubare a 37 ° C per 30 minuti con agitazione come sopra. </li><li> Passage le cellule digeriti, e gli eventuali grumi bei pezzi rimanenti di ghiandole attraverso aghi 20G, 23G e 26G utilizzando una siringa da 10 ml. Ripetere i tempi passaging più con ogni formato dell&#39;ago primadimissioni. Ora, la maggior parte delle cellule dovrebbe essere in una SCS. </li><li> Filtrare la sospensione attraverso un colino 40 pm quindi lavare il filtro e far girare le cellule. Poi ricostituire le cellule nel volume appropriato del mezzo, contare le cellule e procedere immediatamente alla colorazione FACS e l&#39;ordinamento. Non lasciare le celle a 4 ° C o su ghiaccio per diverse ore, perché abbiamo scoperto che questo riguarda la redditività e riduce notevolmente la sfera formando efficienza. </li></ol> 4. La colorazione per FACS e ordinamento <ol><li> Prendere numero sufficiente di cellule per la preparazione dei tubi senza macchia e singola compensazione macchiati quindi macchiare il resto delle cellule con anticorpi primari, Trop2 capra e ratto ITGA6, per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare quindi con PBS o la raccolta media, rimozione del surnatante con molta attenzione e rompere il pellet di cellule. </li><li> Colorare con l&#39;appropriato anticorpo secondario, incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti, lavare e rimuovere il surnatante e quindi rompere il pellet. </li><li> Sulle FACSARIA, dopo aver regolato la tensione e la compensazione, porta i detriti, cellule molto piccole, doppietti cellulari e cellule morte. Quindi, la maggior parte delle cellule del vento dovrebbe essere TROP2 positivo, mentre il 20-50% delle cellule SMG sarà TROP2 + 6. </li><li> Impostare la porta di ordinamento per Trop2 ITGA6 + + cellule di SE (cellule basali) e per Trop2 + cellule (+ /-ITGA6 cellule positive) da SMG (cellule del dotto). </li></ol> 5. La lavorazione di cellule Ordinati per: coltura in vitro e il modello in vivo 5.1 In ambito vitro la formazione di 5-9 cultura <ol><li> Miscelare 100 ml di &quot;fattore di crescita ridotto Matrigel&quot; con 100 pl di mezzo completo 10,11 (vedi Tabella 1) contenente fino a 50.000 cellule filtrate poi mettere questa miscela nella camera superiore di un 24-ben trans-well. Poi, mettete 400 ml di terreno completo in camera inferiore e incubare a 37 ° C. Variazione media camera inferiore a giorni alterni e di aggiungere ulteriori 100 pl di Matrigelogni settimana o prima, se diventa sottile. </li></ol> 5.2 Nel modello in vivo <ol><li> Ricostituire la cella ordinati pellet in mezzo completo miscelato 1:1 con Matrigel ad una concentrazione di 5.000-10.000 cellule per 50 pl. </li><li> Anestetizzare la C57/BL6 topi riceventi. Somministrare Carprofen (5 mg / kg) subcutaenously come analgesico. Sterilizzare le spalle e la barba poi fare una incisione cutanea longitudinale centrale nella parte superiore della schiena. L&#39;incisione deve essere abbastanza grande per identificare il sito di iniezione grasso pad nonché la bozza che forma dopo l&#39;iniezione. Utilizzare il lato smussato della forbice di allargare sacche tra la pelle e il retro della parete toracica su entrambi i lati per massimizzare l&#39;accesso e la visualizzazione. </li><li> Identificare il bordo mediale della scapola spingendo il mouse verso l&#39;alto arti anteriori e indietro per vedere il movimento scapola. Prelevare 50 ml di sospensione cellulare in una siringa 300 ml insulina BD e iniettare nel cuscinetto adiposo appena mediale alla scapola e lateralmentele vertebre. Si dovrebbe essere in grado di vedere una bozza altrimenti sono troppo profonde. Ripetere lo stesso sull&#39;altro lato quindi clip o punto l&#39;incisione cutanea. Controllare topi e dare Carprofen (5 mg / kg, SC) una volta al giorno per 48 ore. </li><li> Dopo 3 settimane, i topi con l&#39;eutanasia pentobarbatol (0.1 mg/0.2 cc, IP), aprire la pelle come sopra e sezionare il pad latte intero da entrambi i lati con un margine di sicurezza per evitare di perdere qualsiasi struttura del tessuto che potrebbe essersi formato ed esteso intorno. Fissare in PFA ed embed in paraffina 12. Estrema attenzione deve essere impiegato durante la preparazione e il taglio del blocco di non ignorare o trascurare una struttura. La pratica migliore è quella di tagliare 40 pm una volta quindi tagliare un 4 fetta micron, posizionarlo su un vetrino ed esaminare al microscopio per verificare se ci sono delle &quot;strutture epiteliali&quot; in questa parte del blocco o meno. Se non c&#39;è niente visto, quindi tagliare di nuovo e ripetere l&#39;operazione. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Stripping delle trachee topo si tradurrà in una trachea spoglia che è visibile al microscopio ottico come mostrato nella Figura 1A. Figura 1B mostra la vista di un campo chiaro trachea dopo strippaggio con epiteliale ghiandole della sottomucosa stati rilasciati dai tessuti e grappoli d&#39;uva simili. Pronase rimuove l&#39;epitopo ITGA6 e questo è il motivo per cui i TROP2 cellule del dotto non può essere separato in ITGA6 + e - le popolazioni. Tuttavia, dispasi, che conserva l&#39;epitopo ITGA6, digerisce tutto l&#39;epitelio di superficie e le cellule del dotto anche con tempi di incubazione molto brevi, e pertanto non può essere utilizzato per separare condotto da cellule basali 3. La citometria a flusso delle sospensioni di cellule singole dovrebbe mostrare i diagrammi a dispersione in avanti e laterali che sono rappresentati nella Figura 2A. Buona separazione delle cellule del dotto dal resto se le cellule della trachea deve essere visto con l&#39;anticorpo Trop2 in citometria a flusso per la cella attivata Sorti fluorescenteng (FACS) come mostrato nella figura 2B. Sfere dovrebbe essere visibile nella matrigel dopo circa 1 settimana in coltura e sono densi in apparenza come mostrato in Figura 3. L&#39;efficienza di questo processo è dell&#39;ordine di 1-2% e singole cellule sarà ancora presente in matrigel e probabilmente rappresentano cellule dei dotti delle ghiandole della sottomucosa che non hanno la capacità di auto-rinnovamento. Iniezione di cellule staminali condotto nel grasso mouse pad risultati nella formazione della ghiandola sottomucosa strutture simili che sono mostrate Figura 4. Questi sono visti nei blocchi anche senza colorazione H &amp; E. Questi sono sferiche e possiedono un lume centrale. Molte sezioni devono essere effettuate tramite il cuscinetto adiposo al fine di non perdere queste strutture epiteliali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> Figura 1. Digestione enzimatica di epitelio tracheale. La rimozione delle cellule epiteliali di superficie viene visualizzato con black frecce, la rimozione delle cellule nei dotti delle ghiandole della sottomucosa è mostrato con frecce verdi. Trachee denudato che sono visibili al microscopio ottico sono presenti dopo 30 minuti di digestione dispasi e dopo 4 ore di digestione pronasi. <img alt="Figura 2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> Figura 2A. I. La citometria a flusso delle sospensioni di cellule singole che mostrano rappresentante forward scatter e diagrammi a dispersione laterali da trachee del mouse dopo superficie epiteliale stripping. ii. Rappresentante trame FACS per TROP2 espressione in cellule del dotto di trachee del mouse. <img alt="Figura 2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> Figura 2B. I. La citometria a flusso delle sospensioni singola cellula da epitelio superficiale spogliato dei i due terzi inferiori della trachea del mouse mostra forward scatter rappresentante e diagrammi a dispersione laterali. ii. Tipico diagramma di FACS ITGA6 espressione in surfaccia epitelio. iii. Un altro terreno rappresentante FACS di scatter in avanti e laterale da epitelio superficiale che mostra retro gating della popolazione di cellule basali in verde. iv. ITGA6 tipica e TROP2 esprimere popolazione cellulare in verde. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> Figura 3. Naturalmente il tempo di sviluppo di sfere. Sfere A. Duct. Sfere dovrebbe essere visibile nella matrigel dopo circa 1 settimana di cultura e quasi tutti sono densi in apparenza. Singole cellule che non formano sfere sono anche visto. (Scala bar = 50 micron). Sfere B. basali sono più grandi e luminale in apparenza. Singole cellule che non formano sfere sono anche visto. (Scala bar = 50 micron). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> Figura 4. Iniezione di cellule staminali condotto nel grasso mouse pad risultati nella formazione della ghiandola sottomucosa strutture simili. Rappresentativi delle strutturesono riportati nella cuscinetto adiposo e alcuni sono mostrati produrre mucina (azzurro) con l&#39;Alcian blue acido periodico Schiff macchia.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questa tecnica di isolare cellule del dotto e basale dalle vie aeree è importante per migliorare la nostra comprensione della riparazione e rigenerazione delle vie aeree e malattie delle vie aeree. Le tecniche qui descritte sono a pochi passi critici. Il primo è il periodo ottimizzato digestione enzimatica. Il secondo è la creazione di una sospensione singola cellula tramite seriale passaging con aghi calibro progressivamente più elevate per impedire ghigliottina cella ma per rompere ammassi cellulari. Il terzo è l&#39;...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Completa media 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> Hepes (15 mm) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio (3,6 mm o 0,03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-glutammina (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-Cl </td></tr><tr><td> Penicillina (100 U / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Streptomicina (100 mg / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Amfotericina B (0,25 mg / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> Ininsulina (10 pg / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrina (5 mg / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> Tossina colerica (0,1 mcg / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Bovina estratto ipofisario (30 mg / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (5%) </td><td> Pescatore </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> L&#39;acido retinoico (0,05 mM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Fattore di crescita ridotto Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Completare i componenti Media. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td&gt; <td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> Usato a 0,15%: -O / N a 4 ° C per isolare la digestione totale delle cellule tracheali per la cultura (ALI) -4 Digestione hr 4 ° C per isolare SMG </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> Usato a 16 unità: 30 min a RT </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> Usato a 0,5 mg / ml: 20-30 min a RT </td></tr></tbody></table> Enzimi Tabella 2. Utilizzato per la digestione enzimatica della trachea.

isolamento delle cellule basali e sottomucosa cellule del dotto di gland mouse trachea

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Grandi vie aeree sono direttamente in contatto con l&#39;ambiente e quindi suscettibile al danno da tossine e agenti infettivi che respiro in 1. Le vie aeree di grandi dimensioni richiedono quindi un meccanismo di riparazione efficace per proteggere i nostri corpi. Questo processo di ripristino si verifica a partire da cellule staminali delle vie aeree e isolare queste cellule staminali delle vie aeree è importante per la comprensione dei meccanismi di riparazione e rigenerazione. E &#39;anche importante per comprendere riparazione anormale che può portare a malattie delle vie aeree 2. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di isolare una nuova popolazione di cellule staminali da tracheali dotti delle ghiandole topo sottomucosi e di inserire in queste cellule in vitro e in vivo sistemi modello per identificare i meccanismi di riparazione e rigenerazione delle ghiandole della sottomucosa 3. Questa produzione mostra i metodi che possono essere utilizzati per isolare e saggio le cellule staminali condotto e basale del grande vie aeree 3. Questo ci permetteràstudiare le patologie delle vie aeree, come la fibrosi cistica, asma e malattia polmonare ostruttiva cronica. Attualmente, non esistono metodi per l&#39;isolamento delle cellule della ghiandola sottomucosa condotto e non ci sono modelli in vivo per studiare la rigenerazione delle ghiandole della sottomucosa.

Qui mostriamo il nostro protocollo per l&#39;isolamento di cellule della ghiandola basali e sottomucoso condotto da trachee del mouse. Abbiamo anche dimostrare il metodo di iniezione di cellule staminali nel cuscinetto di grasso dorsale del mouse per creare un<em&gt; In vivo</emModello&gt; di rigenerazione ghiandola sottomucosa.

Isolamento delle cellule basali e sottomucosa cellule del dotto di Gland mouse Trachea

Le vie respiratorie superiori sono a diretto contatto con l'ambiente e, pertanto, sono suscettibili a danni causati dalle tossine e dagli agenti infettivi che respiriamo 1. ...

Lo scopo di questo metodo è isolare cellule staminali dai dotti delle ghiandole sottomucose della trachea del topo per studiarne la riparazione e rigenerazione. In primo luogo, la trachea viene dissezionata da un topo sacrificato. La trachea viene quindi pulita, tagliata e digerita.Quindi l'epitelio viene asportato meccanicamente e ulteriormente digerito per generare una sospensione di cellule singole. Le cellule vengono quindi marcate con anticorpi, separate mediante FACS e infine preparate per essere utilizzate in saggi in vivo e in vitro. In definitiva, questo metodo può contribuire a identificare i principali percorsi molecolari che regolano le vie aeree, le cellule staminali epiteliali, l'auto-rinnovamento e la differenziazione.Queste tecniche sono importanti perché ci forniscono modelli di riparazione e rigenerazione delle vie aeree in vitro ed ex vivo, a livello epiteliale. Ciò ci consente di studiare sia la riparazione normale delle vie aeree sia le malattie delle vie aeree, come la malattia polmonare ostruttiva cronica, la fibrosi cistica e l'asma. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando non siamo riusciti a trovare marcatori superficiali specifici per isolare le cellule basali dalle cellule staminali duttali, e quindi abbiamo deciso di rimuovere l'epitelio superficiale insieme alle cellule basali, lasciando indietro le cellule duttali. Dimostrazione delle procedure di dissezione della trachea.Lo stripping dell'epitelio delle vie aeree, la creazione di una sospensione di singole cellule e il sorting delle cellule verranno eseguiti da Hega. Un ricercatore postdottorato del mio laboratorio che dimostra le procedure di elaborazione delle cellule ordinate nei modelli in vitro ed ex vivo è sì, Orga il nostro responsabile di laboratorio. Iniziare questa procedura tagliando l'apertura della parete addominale di un topo eutanasizzato.Spostare gli intestini lateralmente per esporre l'aorta addominale e quindi dissezionarla. Aprire il torace tagliando il diaframma e la parete toracica interna su entrambi i lati per esporre il cuore e i polmoni. Continuare a tagliare verso l'alto lungo il collo, rimuovendo il tessuto adiposo e le ghiandole salivari per esporre la trachea utilizzando forbici fini.Rimuovere il timo e staccare il polmone dal tessuto connettivo sottostante e posteriore. Inserire quindi la pinza tra la trachea e l'esofago per separarli. Tagliare la trachea nella sua parte più alta, al di sopra della sua connessione con la laringe.Successivamente, afferrare la trachea con la pinzetta ed estrarla dal suo punto di inserzione. Procedendo verso il basso, rimuoverla insieme al blocco cuore-polmoni, recidendo cuore e polmoni in prossimità dell'ilo per includere la maggior parte dei bronchi principali destro e sinistro. Posizionare la trachea in una piccola capsula di Petri contenente mezzo di raccolta, posta su ghiaccio sotto il microscopio stereoscopico.Utilizzare una pinzetta molto fine numero cinque, un tubo venoso e delle forbici per rimuovere qualsiasi tessuto aderente alla trachea. Ciò include linfonodi, grasso del nervo laringeo ricorrente, ghiandola tiroidea e vasi polmonari residui. La parte superiore della trachea richiede particolare attenzione per rimuovere i grossi frammenti di cartilagine laringea senza compromettere il più grande gruppo di ghiandole sottomucose situato tra la cartilagine CRICO e il primo anello cartilagineo tracheale C1.Successivamente, tagliare la trachea nella parte superiore e nella parte inferiore tra la quarta e la quinta vertebra cervicale (C4 e C5), quindi effettuare un ulteriore taglio. Aprire entrambe le parti attraverso il lume della trachea. Trasferire la parte inferiore della trachea in una provetta microcentrifuga da un millilitro e la parte superiore della trachea in una provetta conica da 15 millilitri per la digestione enzimatica e la successiva elaborazione in sospensioni cellulari singole.Nella parte successiva della procedura, le porzioni inferiore e superiore della trachea vengono trattate per generare sospensioni cellulari singole. Sebbene qui debbano essere processate contemporaneamente, i due metodi verranno dimostrati in modo sequenziale. Per processare la parte inferiore della trachea, aggiungerla a un millilitro di 16 unità di dis nello spazio di una provetta per microcentrifuga, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi trasferire la trachea in un nuovo tubo contenente 0,5 milligrammi per millilitro di DNAasi I in DMM per ulteriori 20 minuti a temperatura ambiente dopo la digestione; utilizzare pinzette fini per trasferire il tessuto in una piastra di Petri sterile contenente mezzo di raccolta fresco. Successivamente, sotto il microscopio stereoscopico, rimuovere l'epitelio superficiale tirando delicatamente sui foglietti epiteliali per separarli dalla membrana basale sottostante. In seguito, utilizzare una pipetta per trasferire il mezzo contenente l'epitelio rimosso in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a 1000 ×g a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, rimuovere il SNAT e aggiungere tripsina 0,1% EDTA; incubare il tubo in un incubatore agitato a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta con punta da 1000 microlitri per aspirare e dispensare ripetutamente il campione, rompendo gli aggregati cellulari ed assicurando che le cellule formino una sospensione di cellule singole. Posizionare la parte superiore della trachea in un tubo conico contenente un millilitro di Pronasi 0,15%, quindi incubare a quattro gradi Celsius per quattro ore. Trasferire la parte inferiore della trachea in un microtubo da un millilitro contenente un millilitro di mezzo con 16 unità di disc base.Dopo l'incubazione, vortexare delicatamente il tubo e quindi immergere la trachea in un mezzo di raccolta fresco. Al microscopio stereoscopico, verificare il completo distacco dell'epitelio superficiale. Utilizzare forbici fini per tritare la trachea ed esporre i compartimenti delle ghiandole sottomucose.Incubare ancora per un'ora in pronasi allo 0,15% a temperatura ambiente con agitazione lenta. Centrifugare il tessuto tracheale dopo aver rimosso la pronasi. Aggiungere tripsina EDTA allo 0,1% e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti con agitazione.Successivamente, filtrare i frammenti più grandi utilizzando un setaccio da 70 micron. Quindi lavare il setaccio con mezzo di coltura. Far passare gli aggregati cellulari digeriti e tutti i frammenti residui di ghiandole attraverso aghi da 20, 23 e 26 gauge utilizzando una siringa da 10 millilitri.Ripetere l'operazione di confezionamento diverse volte con ciascuna dimensione dell'ago prima di passare a quella successiva. A questo punto, la maggior parte delle cellule dovrebbe trovarsi in sospensione monocellulare. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 40 micron, quindi lavare il filtro con mezzo di coltura e centrifugare le cellule.Quindi ricostituire le cellule nel volume appropriato di mezzo, contare le cellule e procedere immediatamente alla colorazione e al sorting. Prelevare un numero sufficiente di cellule per preparare i tubi di compensazione non colorati e singolarmente colorati. Successivamente, colorare il resto delle cellule con anticorpi primari contro tropo tubulo e ITGA6 per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare con PBS o mezzo di raccolta, rimuovendo con grande attenzione il soprannatante.Disperdere il pellet cellulare con l'anticorpo secondario appropriato. Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi lavare ed eliminare la soluzione, quindi disperdere il pellet.Le cellule possono ora essere separate mediante citometria a flusso attivata da fluorescenza. Dopo che le cellule sono state ordinate, possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di riparazione e rigenerazione al fine di generare colture in vitro capaci di formare sfere. Mescolare 100 microlitri di matrigel con fattori di crescita ridotti con 100 microlitri di mezzo completo contenente fino a 50.000 cellule ordinate.Pipettare questa miscela nella camera superiore di una piastra trans well da 24 pozzetti; nella camera inferiore pipettare 400 microlitri di mezzo completo e incubare a 37 gradi Celsius. Cambiare il mezzo nella camera inferiore ogni due giorni e aggiungere ulteriori 100 microlitri di matrigel ogni settimana o prima, se diventa sottile.Le sfere si formano tipicamente dopo sette giorni e possono essere coltivate per diverse settimane o passate in modo seriale. Per il modello in vivo, ricostituire il pellet di cellule ordinate in mezzo completo mescolato in rapporto uno a uno con matri gel a una concentrazione di 5.000-10.000 cellule per 50 microlitri. Dopo aver anestetizzato il topo C57 black six ricevente, sterilizzare e rasare la schiena, quindi la parte superiore della schiena.Eseguire un'incisione cutanea longitudinale centrale. Utilizzare il lato ottuso della lama delle forbici per allargare le tasche tra la cute e la parete toracica posteriore su entrambi i lati. Spingere l'arto del mouse verso l'alto e all'indietro per spostare e identificare il bordo mediale della scapola.Quindi, utilizzando una siringa per insulina da 300 microlitri, iniettare 50 microlitri della sospensione cellulare nel cuscinetto adiposo appena mediale alla scapola e laterale alle vertebre. Deve formarsi una bolla; ripetere l'iniezione sull'altro lato, quindi rimuovere le graffette o i punti di sutura dall'incisione cutanea dopo tre settimane. Aprire la cute del topo sacrificato come in precedenza ed estrarre l'intero cuscinetto adiposo da entrambi i lati con un margine di sicurezza.Per evitare di perdere qualsiasi struttura tissutale che possa essersi formata ed estesa attorno, fissare il cuscinetto adiposo dissezionato in PFA e incorporarlo in paraffina per evitare di saltare o trascurare strutture durante il taglio del blocco. Tagliare una volta 40 micron, quindi effettuare una sezione di quattro micron.Posizionarlo su un vetrino e quindi esaminarlo al microscopio per determinare la presenza di strutture epiteliali. Se non si osserva nulla, tagliare nuovamente ed eseguire nuovamente questo passaggio. La rimozione della trachea del topo, come descritta in questo video, produrrà una trachea denudata che risulta visibile mediante microscopia ottica, come mostrato qui nelle trachee denudate.Dopo 30 minuti di digestione con pronasi, a sinistra sono mostrati i trachei con epitelio e quelli denudati. A destra sono mostrati i trachei dopo quattro ore di digestione con pronasi. Dopo la rimozione dell'epitelio, le ghiandole sottomucose vengono rilasciate dai tessuti e assomigliano a grappoli d'uva.La rimozione delle cellule epiteliali superficiali è indicata con frecce nere. La rimozione delle cellule nelle ghiandole sottomucose e nei dotti è indicata con frecce verdi. La citometria a flusso delle sospensioni cellulari singole dovrebbe mostrare i grafici di scattering anteriore e scattering laterale come mostrato qui.Ottima separazione delle cellule duttali dal resto. Se le cellule tracheali devono essere visualizzate con l'anticorpo Trop due mediante citometria a flusso per il sorting cellulare attivato da fluorescenza, dopo circa una settimana di coltura dovrebbero essere visibili sfere nel matrigel: di aspetto luminale quando derivate da cellule basali e di aspetto denso quando derivate da cellule duttali. L'efficienza di questo processo è dell'ordine dell'1-2% e saranno ancora presenti cellule singole nel matrigel, che probabilmente rappresentano cellule dei dotti delle ghiandole sottomucose prive della capacità di autorinnovamento.Le sferoidi basali sono più grandi e hanno un aspetto luminale. L'iniezione di cellule staminali duttali nel cuscinetto adiposo del topo porta alla formazione di ghiandole sottomucose, strutture simili a sferoidi dotate di un lume centrale. Queste strutture sono visibili nei blocchi anche in assenza di colorazione con ematossilina ed eosina.Sono necessarie molte sezioni trasversali del cuscinetto adiposo per ottenere un frammento che contenga queste strutture epiteliali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare una popolazione di cellule staminali dai dotti della ghiandola subiacoidea e, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 10 ore. Dopo questa procedura, le condizioni di coltura possono essere modificate per rispondere a diverse domande relative alla formazione di sfere e alla rigenerazione mediante fattori di crescita stimolanti.

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