Name: Dissezione di utricolo topo adulto e adenovirus-mediata non protagonista infezione delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Impara la dissezione dell'utricolo di topo adulto e l'infezione delle cellule di sostegno con adenovirus per studiare la rigenerazione delle cellule ciliate nell'orecchio interno. Questo metodo supporta la ricerca in neuroscienza e medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Divisione di Ricerca intramurale presso il National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione. Ulteriore supporto è stato fornito da dell&#39;NIDCD 5R01 DC007613.

1. Otricolo Dissection e Cultura <ol><li> Eutanasia di un adulto (4 settimane di età) del mouse utilizzando un protocollo approvato e decapitare. </li><li> Snip il canale uditivo esterno su entrambi i lati della testa e tirare la pelle in avanti verso il naso. Dividono in due la testa da dietro in avanti e rimuovere il cervello da entrambi i lati per rivelare il labirinto osseo. </li><li> Tagliare il cranio dalla coclea ossea e trasferire il labirinto osseo (compresa la bolla) ad una cappa coltura tissutale dotato di un microscopio per dissezione (Nota: lavoro Adenovirus deve essere eseguita in una cappa di sicurezza biologica di classe II). </li><li> Nel cappuccio, trasferire ciascuna coclea di un piatto 35 millimetri coltura tissutale sterili contenenti supporti dissezione (M199, Gibco / Invitrogen # 12.350) (Figura 1A). </li><li> Se la bulla uditivo è ancora intatto (è possibile rimuovere il bulla durante la dissezione lordo inserendo il pollice tra la bulla e l&#39;apice dila coclea), utilizzare due pinze (uno # 3 e uno # 5) per rompere la bulla (Figura 1B). </li><li> Identificare i punti di riferimento della preparazione ossea coclea: ossicini apice, base,, ovali e tonde finestre, radice del nervo VIII, canali semicircolari (Figura 1 C, D). </li><li> Posizionare l&#39;orecchio interno nel piatto con il lato mediale rivolto verso l&#39;alto, in modo tale che l&#39;ovale e rotonda finestre e all&#39;apice sono sul fondo del piatto e la radice del nervo VIII è rivolto verso l&#39;alto. Tenere il preparato utilizzando un # 3 pinza nella regione dei canali semicircolari (Figura 1D). </li><li> Usando un bisturi dotato di una lama # 11, tagliare l&#39;apice della coclea appena apicale della radice del nervo (Figura 1D). </li><li> Ruotare il preparato in modo che la porzione di taglio è rivolto verso l&#39;alto. Utilizzare il canale anteriore semicircolare come maniglia per stabilizzare la preparazione (Figura 1E). </li><li> Utilizzando # 5 pinzette, rimuovere la coclea alle modiolus verso il bassoalla base. Nel punto in cui la regione gancio della coclea gira verso il basso, utilizzare una sonda sottile (mezzo di una pinza rotti # 55) per sollevare l&#39;ultimo ripiano ossea della lamina spirale ossea (figura 1F), rivelando la sacculo. Appena sotto il sacculo è la pedana della staffa, che è un importante punto di riferimento. Il otricolo è immediatamente adiacente alla pedana staffa (figura 1G), ed è circondato da osso. Utilizzare la sonda a scheggiare l&#39;osso distanza sufficiente per rivelare circa 1/3 del otricolo. Rimuovere con attenzione il otricolo utilizzando N ° 55 pinze (Figura 1 H). Questa procedura di solito provoca la rimozione del tetto dell&#39;epitelio pigmentato come utricolo è tirato dalla preparazione ossea. Tuttavia, se il otricolo viene rimosso con l&#39;epitelio intatto tetto, il tetto può essere rimosso utilizzando # 55 pinze. </li><li> Otricoli per l&#39;infezione da adenovirus (o esperimenti di imaging dal vivo) deve avere il otoconia rimossa durante la dissezione (prima infezione).In questo caso, utilizzare una siringa luer-lock che viene riempito con mezzi di dissezione e dotata di un piccolo foro dell&#39;ago (di solito 26-28 gauge). Tenere il otricolo sul bordo utilizzando N ° 55 pinze (Figura 1I). Portare la punta dell&#39;ago vicino al otricolo con la smussatura dell&#39;ago verso il basso. Utilizzare un flusso di dissezione media per soffiare via la otoconia (Figura 1J). In alternativa, otoconia possono essere rimosse mediante spazzolatura loro fuori utilizzando uno strumento di ciglia (Ted Pella, Inc. # 113). Otricoli che non vanno a subire l&#39;infezione adenovirale sono normalmente coltivate liberamente fluttuante in piastre di tessuto a 24 pozzetti con l&#39;intatta otoconia (vedi sotto per la rimozione post-fix otoconia, che è più facile). </li><li> Una volta che tutti otricoli sono sezionati, cambiare i media sezionare alla cultura dei media sterile: DMEM F12 (Gibco # 11320) supplementato con 5% di FBS e 50 U / ml di penicillina G (Sigma). </li><li> Otricoli vengono coltivate a 37 ° C e 5% CO 2. Se le culture devono essere maintaINED per più di 48 ore, la metà dei terreni di coltura dovrebbero essere cambiati ogni altro giorno. Le culture possono essere mantenuti per una settimana o più. </li></ol> 2. L&#39;infezione Adenovirus di cellule di supporto Importante: Lavorare con adenovirus richiede livello di biosicurezza 2 (BSL2) procedure e certificazione. Verificare con il responsabile istituzionale biosicurezza di orientamento e formazione sulle procedure di BSL2. <ol><li> Dissect otricoli come sopra in media di dissezione (no siero). Rimuovere otoconia come sopra. </li><li> Quando si è pronti per infettare, trasferire 1 utricolo (cellule ciliate up) in ciascun pozzetto di una Nunc mini-vassoio (Fisher # 12-565-68) con 15 microlitri di siero-free DMEM F12 (questo è importante perché siero può inattivare il virus) . Questo trasferimento è più facile con uno 1,5 mm microcurette (# 10082-15 da Strumenti Scienza Arti). </li><li> Il nostro Ad-GFP è sierotipo 5 con i geni virali E1 ed E3 eliminati e il promotore umano CMV guida del transgene (GFP). Questo virus è stato ottenuto da vettore BioLabs (Philadelphia, PA <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Virus archivio sono forniti a titoli di 1,0-4,0 × 10 10 PFU / ml. Aggiungere 0,5-2 microlitri di virus disponibile in ciascun pozzetto contenente un utricolo (Figura 1L). L&#39;importo effettivo utilizzato varia a seconda del titolo virale e il brodo. Noi di solito infettano ogni otricolo con 1,0-4,0 × 10 7 PFU. </li><li> Cultura le otricoli in virus contenenti supporti a 37 ° C / 5% CO 2 per 2 ore. Dopo 2 ore, trasferire i otricoli Torna alla piastra da 24 pozzetti di coltura contenente terreno di coltura con il siero. Culture i otricoli notte a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Otricoli può essere utilizzato il giorno successivo per gli esperimenti di imaging dal vivo, oppure possono essere fissati per immunochimica capelli cella (vedi sotto). Virali transgenici aumenta di espressione nel corso del tempo, quindi se l&#39;espressione del transgene è bassa a 24 ore dopo l&#39;infezione si puòvantaggioso cellule di coltura ulteriori 24 ore nel siero contenenti supporti. Se vedi la tossicità delle cellule dei capelli, ridurre la quantità di virus usato. </li></ol> 3. Fissazione utricolo, rimozione otoconia e immunochimica <ol><li> Al termine del periodo di coltura, otricoli fissare in paraformaldeide al 4% sia per 3 ore a temperatura ambiente (su una piattaforma oscillante) o per una notte a 4 ° C. Otricoli lavaggio (3 volte, a 15 minuti cadauna) a 0,1 M (1X) pH Sorensen tampone fosfato 7,4. Questi passaggi sono eseguiti in una piastra da 24 pozzetti di coltura tissutale. </li><li> Rimozione otoconia: Nota: otoconia deve essere rimossa prima dell&#39;infezione adenovirus (vedere il passaggio sopra 1,11). Tuttavia, otricoli che non devono essere infetti possono essere coltivate e fissato con la otoconia ancora intatta. In questo caso, utilizzare i passaggi descritti qui per rimuovere il otoconia dopo la fissazione. Controllare otricoli per qualsiasi epitelio pigmentato rimanenti tetto. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo epitelio tetto con due f # 55orceps. Per rimuovere il otoconia, sostituire tampone fosfato Sorensen con 750-1000 microlitri Cal-Ex decalcificatore (Fisher # CS510-1D). Lascia Cal-Ex su otricoli per 1 minuto e 40 secondi (non superare i 2 minuti). Sostituire Cal-Ex con 0,1 M tampone fosfato di Sorensen e di lavaggio (5 volte, 5 minuti ciascuno). </li><li> Incubare otricoli di boroidruro di sodio (Sigma # 452882, 1% in acqua deionizzata) per 10 minuti. Lavare otricoli in 0.1 M tampone fosfato di Sorensen (5 volte, 5 minuti ciascuno). </li><li> Otricoli di luogo in Blocking Solution (PBS + 2% albumina di siero bovino + 0,8% siero di capra normale + 0,4% Triton X-100) per 3 ore a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. </li><li> Aggiungere anticorpi primari e incubare durante la notte a 4 ° C. Anti-miosina 7a (o Proteus Biosciences # o # 25-6790 MYO7A 138-1 dal Developmental Studies Ibridoma Bank) a 1:100 nel bloccare le etichette soluzione tutte le cellule dei capelli. Per etichettare separatamente le cellule ciliate striolar e non striolar, abbiamo usato un doppio-label protocol con un anticorpo monoclonale anti-calmodulina (Sigma C # 3545, 1:150) e policlonali anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200). Anticorpi secondari (di solito Alexa Fluor anticorpi coniugati secondari di Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) sono diluiti 1:500 in soluzione bloccante e incubate per 4 ore al buio a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. </li><li> Otricoli Mount su vetrini utilizzando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Otricoli coltivate utilizzando questo metodo mantenere pieno complemento di entrambe le cellule dei capelli e le cellule di supporto (Figura 2). Cellule ciliate nelle culture sani mostrano profili tondi nucleari circondate da sottili regioni citoplasmatici che sono miosina 7a-positivo (Figura 2, pannello superiore). Cellule di sostegno (con etichetta anti-Sox2) sono più piccoli e più densamente di cellule ciliate (Figura 2, pannello inferiore). Adenovirus infetta il 25-50% delle cellule di supporto nella utricolo, e non sono infettate cellule ciliate (Figura 2, Ad-GFP pannelli). Va osservato che il titolo di lavoro ottimale di ciascun adenovirus deve essere determinato empiricamente, poiché la morte delle cellule capelli è possibile se il titolo virale è troppo elevato. Inoltre, le regioni di danni meccanici (causati durante la dissezione) avrà grandi quantità di virus. Queste regioni di danneggiamento meccanico sono facilmente distinguibili da una linea continua di cellule con livelli molto elevati di espressione di GFP e cellule cigliate mancanti. Questo è in contrasto con l&#39;espressione GFP dispersa in cellule di sostegno di una coltura non danneggiato (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Otricolo Dissection. A:. Auditory bulla (AB) B:. La bolla è rotto con due pinze robuste C: Bony coclea (RW = finestra rotonda, S =. arteria stapediale, C = coclea, ST = staffa) D: Una lama di bisturi (SB) viene utilizzato per tagliare l&#39;apice della coclea apicale al nervo craniale VIII (8 ° N) ASC = canale semicircolare anteriore E..: La preparazione viene tenuto fermamente con un # 3 pinza con una forchetta inserito nel canale anteriore semicircolare (ASC) e l&#39;altra sull&#39;osso esterno (frecce). Il labirinto membranoso viene rimossa con pinze F:. Con il labirinto membranoso rimosso, il giro basale della lamina spirale ossea è visibile vicino alla regione gancio. Una sonda sottile viene inserita sotto questa piattaforma ossea per sollevare la piattaforma e rimuoverlo (freccia) G:. Dopo la rimozione del sacculo, utricolo (U) è visibile immediatamente adiacente alla pedana della staffa (SF) H:. Utricolo (U ) viene rimosso utilizzando un pinza # 55 (freccia) SF = pedana staffa I:.. otricolo con otoconia (O) parzialmente rimosso und sensoriali epitelio (SE) sotto visibili J:. otoconia (O) vengono rimossi dal otricolo utilizzando un flusso di supporto fornito da una siringa munita di un 26-gauge. L&#39;ombra dell&#39;ago (S) è visibile nella parte inferiore dell&#39;immagine K:. Otricolo con otoconia rimosso e epitelio sensoriale (SE) visibile L:. Infezione adenovirale: ogni otricolo (U) è collocato in un singolo pozzetto di una mini -tray. Cellule di supporto sono infettate con adenovirus pipettando virus nel pozzo (P = punta della pipetta). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Adenovirus-mediata infezione di cellule di sostegno. Otricoli sono state infettate con espressione di adenovirus di guida di proteina fluorescente verde (Ad-GFP). Vengono mostrati immagini confocali dello strato di cellule capelli e lo strato di cellule di supporto nella stessa area di un dell&#39;utricolo. Cellule ciliate sono etichettate con un anticorpo contro 7a miosina(Magenta). Cellule di sostegno sono etichettate con un anticorpo contro Sox2 (rosso). Mostra la struttura schematica dell&#39;epitelio otricolo sensoriale e le posizioni delle cellule capellute (HC) e cellule di supporto (SC). Posizioni di confocali (ottica) sezioni mostrate in alto (U) e inferiore (L) pannelli sono indicati da linee tratteggiate nella schematica. I pannelli superiori: Nelle immagini confocali adottate a livello dei nuclei delle cellule dei capelli, Ad-GFP segnale appare negli spazi tra le cellule dei capelli e non si sovrappone con la 7a capelli miosina marker delle cellule. Pannelli inferiori: In sezioni confocali a livello dei nuclei di supporto, Ad-GFP segnale colocalizza con il marcatore della cella di supporto Sox-2. Ad-GFP risultati infezione nell&#39;espressione GFP in cellule di sostegno solo, e non cellule ciliate sono infetti. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Infezione adenovirale non provocare la morte delle cellule ciliate o cellule di supporto. Utricles sono stati infettati con Ad-GFP a 4 × 10 8 PFU / ml. Otricoli sono state marcate con anticorpi anti-miosina 7 (marker delle cellule dei capelli) e Sox2 (marker delle cellule di sostegno). Cellule dei capelli e della conta delle cellule di supporto sono stati pari a otricoli di controllo e Ad-GFP otricoli infetti.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Cellule sensoriali sono suscettibili di morte causata da una varietà di stress, compreso l&#39;invecchiamento, trauma rumore, e l&#39;esposizione a farmaci ototossici, compresi gli aminoglicosidi e l&#39;agente antineoplastico cisplatino. Nei risultati di cellule di mammiferi di morte per capelli in perdita permanente dell&#39;udito e / o disturbi dell&#39;equilibrio. In sistemi modello in vitro sono strumenti fondamentali per gli studi volti a determinare i meccanismi cellulari e molecolari alla base ...

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Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medium 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12.350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11.320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine pinza (# 55)</td&gt;<td&gt; Strumenti Scienza Belle</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fine pinza (# 5)</td&gt;<td&gt; Strumenti Scienza Belle</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinza (# 3)</td&gt;<td&gt; Strumenti Scienza Belle</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicillina G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Siero fetale bovino</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc mini-vassoio</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirus-GFP</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex decalcificatore</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sodio boroidruro</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452.882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-miosina 7 bis (policlonale)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-miosina 7 bis (monoclonale)</td&gt;<td&gt; Developmental Studies Ibridoma Bank</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calmodulina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotecnologie Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabella 1</strong&gt;. Reagenti e strumenti utilizzati nella cultura utricolo e l&#39;infezione da adenovirus.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Nota: Ad-GFP è normalmente fornito da Biolabs vettoriali ad un titolo stock di 1x10<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Abbiamo richiesto un&#39;amplificazione personalizzato per fornire il virus stock a un titolo di 1,2 × 10<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissezione di utricolo topo adulto e adenovirus-mediata non protagonista infezione delle cellule

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

La perdita dell&#39;udito e disturbi dell&#39;equilibrio sono spesso causati dalla morte delle cellule ciliate mechanosensory, che sono le cellule recettori dell&#39;orecchio interno. Poiché non vi è alcuna linea cellulare che rappresenta in modo soddisfacente le cellule ciliate dei mammiferi, la ricerca sulle cellule dei capelli si basa su colture primarie di organi. Il più caratterizzato modello in vitro di cellule mature per capelli mammifero utilizza colture organo di otricoli da topi adulti (figura 1) 1-6. L&#39;utricolo è un organo vestibolare, e le cellule ciliate del utricolo sono simili nella struttura e funzione delle cellule ciliate dell&#39;organo uditivo, l&#39;organo del Corti. Il mouse gli adulti, utricolo rappresenta un epitelio sensoriale matura per lo studio dei segnali molecolari che regolano la sopravvivenza, l&#39;omeostasi, e la morte di queste cellule. Mammiferi cellule ciliate cocleari sono terminalmente differenziate e non vengono rigenerati quando vengono persi. In non-mamvertebrati del Mali, uditivi o vestibolare morte delle cellule dei capelli è seguita dalla rigenerazione robusto che ripristina le funzioni dell&#39;udito e dell&#39;equilibrio 7, 8. Rigenerazione delle cellule dei capelli è mediata da cellule gliali, come le cellule di supporto, che contattano le superfici basolaterale delle cellule ciliate nell&#39;epitelio sensoriale 9, 10. Cellule di sostegno sono anche importanti mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli e la morte 11. Abbiamo recentemente sviluppato una tecnica per infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura con adenovirus. Utilizzo di adenovirus di tipo 5 (dE1/E3) per fornire un transgene contenente GFP sotto il controllo del promotore CMV, troviamo che adenovirus specificamente e infetta efficacemente le cellule di supporto. Sostenere infezione efficienza della cella è di circa 25-50%, e le cellule dei capelli non sono infettati (figura 2). Importante, troviamo che l&#39;infezione adenovirale di cellule di sostegno non comporta la tossicità per le cellule ciliate o cellule di supporto, come il conteggio delle cellule in Ad-GFP infette otricoli sono equivalenti a quelle non infette otricoli (Figura 3). Così adenovirus-mediata espressione genica in cellule di sostegno di otricoli coltivate fornisce un potente strumento per studiare i ruoli di cellule di sostegno come mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli, la morte e rigenerazione.

Cellule ciliate Mechanosensory sono le cellule recettori dell&#39;orecchio interno. Il più caratterizzato<em&gt; In vitro</emModello di sistema&gt; di mature cellule ciliate mammiferi utilizza colture d&#39;organo di otricoli da topi adulti. Presentiamo la dissezione del otricolo topo adulto, e dimostriamo adenovirus-mediata infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura.

Dissezione di utricolo topo adulto e adenovirus-mediata non protagonista infezione delle cellule

La perdita dell'udito e i disturbi dell'equilibrio sono spesso causati dalla morte delle cellule ciliate meccanosensoriali, che sono le cellule recettoriali dell'orecchio interno. Poiché vi...

Questa presentazione illustra le procedure per la coltura di organi interi dell'utricolo provenienti da topi adulti. Verrà inoltre dimostrato l'uso dell'adenovirus per infettare le cellule di sostegno dell'utricolo in coltura. Questo viene realizzato mediante la dissezione accurata dell'utricolo dall'orecchio interno.Il secondo passaggio consiste nella rimozione dell'epitelio del tetto. Successivamente, vengono rimossi gli otoconi, lasciando intatto l'epitelio sensoriale. L'ultimo passaggio prevede l'infezione delle cellule di sostegno dell'utricolo mediante adenovirus.Queste tecniche possono essere utilizzate in una vasta gamma di esperimenti progettati per esaminare le cellule ciliate maturi dei mammiferi e le cellule di sostegno in vitro. Le cellule recettrici sensoriali nell'orecchio interno sono chiamate cellule ciliate, e queste cellule sono responsabili della conversione dell'energia sonora o del movimento della testa in segnali neurali diretti al cervello.La perdita dell'udito è spesso causata dalla morte di queste cellule sensoriali ciliate. Per studiare i meccanismi alla base della morte delle cellule sensoriali ciliate, è molto utile disporre di un sistema modello in vitro. Il metodo che illustreremo utilizza colture di organi interi dell'utricolo di topi adulti.L'utricolo è un organo vestibolare nell'orecchio interno, e le cellule ciliate dell'utricolo sono simili alle cellule ciliate dell'organo dell'udito, chiamato organo del Corti. Il preparato dell'utricolo rappresenta il sistema modello meglio caratterizzato per lo studio delle cellule ciliate e delle cellule di sostegno nei mammiferi adulti. Inoltre, illustreremo un metodo recentemente sviluppato nel nostro laboratorio che utilizza il virus adenovirale per infettare le cellule di sostegno dell'utricolo.La tecnica con adenovirus consente di esaminare i ruoli delle cellule di sostegno come mediatori della sopravvivenza, morte e rigenerazione delle cellule ciliate. Utilizziamo queste tecniche nel nostro laboratorio per affrontare due domande fondamentali. In primo luogo, quali sono i segnali cellulari e molecolari che determinano se una cellula cigliata sotto stress sopravvive o muore?E in secondo luogo, come possiamo utilizzare queste informazioni per sviluppare terapie, terapie cliniche in grado di prevenire o invertire la perdita dell'udito? Lindsey Maye, un biologo del mio laboratorio, mostrerà queste tecniche. La dimostrazione visiva della dissezione dell'utricolo è importante perché il tessuto è piccolo e fragile, ed è molto suscettibile ai danni meccanici, specialmente durante le fasi di rimozione delle otocorie e dell'epitelio del tetto.Dopo aver soppresso e decapitato un topo adulto in conformità a un protocollo istituzionalmente approvato per la cura e l'uso degli animali, dividere longitudinalmente il cranio dalla parte caudale a quella rostrale ed estrarre il cervello da entrambe le emisfere per esporre il labirinto osseo. Successivamente, rimuovere le parti del cranio attorno alla coclea ossea e trasferire il labirinto osseo in una piastra per colture tessutali da 35 millimetri contenente mezzo sterile, 1 99. Se il bulbo timpanico è ancora integro, utilizzare due pinze robuste per frantumare il bulbo.Dedichi un momento all'identificazione dei punti di riferimento della preparazione ossea, inclusi l'apice, la base, le finestre ovale e rotonda, la radice del nervo ottavo e i canali semicircolari, come mostrato in queste immagini riprodotte nel protocollo scritto. Orienti la preparazione nella piastra in modo che le ossicini si trovino nella parte inferiore della piastra e la radice del nervo ottavo sia rivolta verso l'alto. Usi una pinzetta per tenere ferma la preparazione nella regione dei canali semicircolari; con un bisturi dotato di lama numero 11, recida l'apice della coclea appena al di sopra della radice nervosa. Usi il canale semicircolare anteriore come maniglia per stabilizzare la preparazione e ruoti quest'ultima in modo che la sezione tagliata sia rivolta verso l'alto.Ora, utilizzando pinze numero cinque, rimuovere il coclea al modiolo fino alla base. Quindi utilizzare una sonda fine realizzata con metà di un paio di pinze numero 55 per sollevare l'ultimo ripiano osseo della lamina spirale ossea. Per rivelare la S al di sotto della S si trova la piastra del piede dello stapedio.Questa immagine mostra la piastra stapediale, indicata con sf, che costituisce un punto di riferimento importante per identificare la posizione dell'utricolo, indicato con U, il quale si trova immediatamente adiacente alla piastra stapediale. Utilizzare la sonda fine per rimuovere una quantità sufficiente di osso da esporre circa un terzo dell'utricolo. Successivamente, utilizzando pinzette numero 55, rimuovere con attenzione l'utricolo afferrandolo molto vicino al margine oppure alla radice nervosa.Se l'epitelio pigmentato del tetto è ancora attaccato all'utricolo, rimuoverlo utilizzando pinzette fini. Se si desidera utilizzare le utricole per l'infezione da adenovirus, è necessario rimuovere le otoconie. Riempire una siringa con mezzo di dissezione e applicarvi un ago da 26 o 28 gauge.Tenere l'utricolo al bordo con pinzette numero 55 e rimuovere le otoconie utilizzando un flusso di mezzo. In alternativa, le otoconie possono essere rimosse con uno strumento a ciglio. Una volta completata la dissezione di tutti gli utricoli, sostituire il mezzo di dissezione con mezzo di coltura sterile e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.Tutte le procedure con adenovirus vengono eseguite seguendo le precauzioni previste per il livello di sicurezza biologica due. Quando si è pronti per l'infezione, utilizzare una microcurette per trasferire una cellula ciliata utricolare in una pozzetta di una piastra senza mini contenente 15 microlitri di D-M-E-M-F 12 privo di siero. Aggiungere da uno a quattro volte 10 alla settima unità formanti placche di adenovirus nella pozzetta contenente la coltura dell'utricolo.I frammenti U vengono incubati in un ambiente umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due ore. Trascorse due ore, trasferire i frammenti U in una piastra da coltura tissutale a 24 pozzetti contenente mezzo di coltura con siero. Una volta trasferiti, i frammenti U vengono nuovamente coltivati per tutta la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.I utricoli possono essere utilizzati il giorno successivo per esperimenti di imaging in vivo oppure possono essere fissati per immunoistochimica. I utricoli vengono fissati con paraformaldeide al 4% su una piattaforma oscillante per tre ore a temperatura ambiente o per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, lavare l'utricolo tre volte per 15 minuti ciascuna in tampone fosfato sorense 0,1 molare.Se le otocorie non sono state rimosse per l'infezione da adenovirus, rimuoverle a questo punto immergendo l'utricolo in calx decalcify per uno o due minuti, quindi lavare con soluzione fosfato tampone sorens 0,1 M e immergere l'utricolo nella soluzione di blocco per tre ore a temperatura ambiente. Dopo il passaggio di blocco, diluire l'anticorpo primario nella soluzione di blocco. Aggiungere alla piastra contenente le utricoli e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, lavare i trickles di U e le sorens e il tampone fosfato. Quindi aggiungere l'anticorpo secondario diluito nella soluzione di blocco e incubare per quattro ore al buio a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. Infine, montare l'utricolo su vetrini utilizzando il supporto flora G. Queste immagini confocali mostrano il livello delle cellule ciliate e il livello delle cellule di sostegno nella stessa area di un utricolo infettato con adenovirus che induce l'espressione della proteina fluorescente verde.I recettori uditivi vengono marcati con un anticorpo contro la miosina sette A, che appare magenta. Le cellule di sostegno vengono marcate con un anticorpo contro socks, due, che appare rosso qui. Si può osservare che l'adenovirus GFP si localizza nelle cellule di sostegno e non nei recettori uditivi.Questo grafico dimostra che l'infezione adenovirale con adenovirus GFP a quattro volte 10 alla ottava unità formanti placche per millilitro non provoca la morte delle cellule ciliate o delle cellule di sostegno. Una volta acquisita padronanza della dissezione, entrambi gli uricoli da un singolo animale possono essere posti in coltura in 10-15 minuti.Tuttavia, è fondamentale, durante lo sviluppo di questa procedura, prendersi il proprio tempo ed essere accurati nella manipolazione del tessuto dopo aver eseguito tale procedura. Altri metodi, come l’imaging confocale in vivo, l’immunohistochemia, la R-T-P-C-R e il Western blotting, possono essere eseguiti per indagare domande relative alla morte, sopravvivenza e rigenerazione delle cellule di sostegno e delle cellule ciliate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissezionare l’utricolo e infettare le cellule di sostegno utilizzando il virus adenovirale.Ricordare che lavorare con virus può essere pericoloso e richiede misure di biosicurezza. Si devono sempre adottare precauzioni di livello due quando si eseguono queste procedure.

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In questo video possiamo utilizzare un adenovirus che trasportano il gene Cre ricombinasi per infettare i fibroblasti di topo primario embrionale porta un allele floxed Rac1.

Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

Un metodo di tracciare neuroni sinapticamente collegate è descritto. Usiamo specificità TVA di una cella a monte per sondare se una popolazione di cellule riceve input sinaptico da tipi di cellule geneticamente definiti.

Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

L'approccio chirurgico post-auricolare descritto consente una somministrazione rapida e diretta nel timpano della scala cocleare del topo, riducendo al minimo la perdita di sangue e la mortalità animale. Questo metodo può essere utilizzato per la terapia cocleare utilizzando la somministrazione molecolare, farmacologica e virale a topi postnatali attraverso la membrana rotonda della finestra.

Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna all&#39;orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana

Vi presentiamo un metodo per isolare l'organo del Corti adulta come tre turni intatte cocleari (apice, il medio e basso). Abbiamo anche dimostrare una procedura per immunocolorazione con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio di cellule ciliate, cellule di supporto, e altri tipi di cellule trovato nella coclea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

In questo rapporto, vengono evidenziati i vantaggi delle colture organotipiche e colture primarie dissociate di gangli spinali del mouse-derivati per studiare una vasta gamma di meccanismi connessi con interazione neurone-glial, neuroplasticità, neuroinflammation e risposta all'infezione virale.

Topo adulto DRG Explant e dissociato modelli cellulari per studiare neuroplasticità e risposte agli insulti ambientali, compreso l'infezione virale

Qui descriviamo la procedura canalostomy che permette la consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati attraverso il canale semicircolare con minimo danno alla funzione uditiva e vestibolare. Questo metodo può essere utilizzato per inoculare vettori virali, prodotti farmaceutici e le piccole molecole nell'orecchio interno del mouse.

Canalostomy come un approccio chirurgico alla consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati

Colture organotipiche tridimensionale dell'utricolo murino e coclea in otticamente deselezionare collagene gel morfologia del tessuto innata di riserva, consentono per stimolazione meccanica attraverso la regolazione della rigidità di matrice e consentono il recapito della virus-mediata del gene.

Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari

Questo protocollo descrive il processo di generazione e caratterizzazione di organoidi uroteliali di topo che ospitano delezioni in geni di interesse. I metodi includono la raccolta di cellule uroteliali di topo, la trasduzione ex vivo con adenovirus che guida l'espressione di Cre con un promotore CMV e la caratterizzazione in vitro e in vivo .

Ex Vivo Modello organoide delle delezioni geniche mediate da Adenovirus-Cre in cellule uroteliali di topo

Vengono descritti metodi per la generazione di grandi quantità di adenovirus ricombinanti, che possono quindi essere utilizzati per trasdurre l'urotelio nativo dei roditori consentendo l'espressione di transgeni o la downregulation di prodotti genici endogeni.

Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

La stria vasculare è vitale per la generazione del potenziale endococleare. Qui, presentiamo la dissezione della stria vasculare del topo adulto per il sequenziamento a singolo nucleo o l'immunocolorazione.

Dissezione della stria vascolare del topo adulto per sequenziamento di singoli nuclei o immunocolorazione

Impara la dissezione dell'utricolo di topo adulto e l'infezione delle cellule di sostegno con adenovirus per studiare la rigenerazione delle cellule ciliate nell'orecchio interno. Questo metodo supporta la ricerca in neuroscienza e medicina rigenerativa.

Dissezione di utricolo topo adulto e adenovirus-mediata non protagonista infezione delle cellule

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