Name: Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Impara a generare cellule T regolatrici indotte da cellule T naive e memoria umane. Questo metodo consente confronti tra sottopopolazioni cellulari nello stesso donatore, eliminando la variabilità inter-individuale per studi di immunologia.

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<p class="jove_content"&gt; Gli autori desiderano ringraziare Jennifer Strange and Greg Bauman per la loro assistenza con l&#39;analisi di Citometria a Flusso e smistamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal numero di sovvenzione del NIH 2P20 RR020171 dal NCRR e dalla University of Kentucky di avvio dei fondi di FM; GIE riconosce il sostegno della Compagnia Presidenziale e il Graduate Fellowship Opportunity Kentucky.</p

1. Isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) provenienti da Buffy Coat <ol><li> Acquisire una unità di buffy coat dall&#39;ospedale e dintorni posizione centrale sangue. Il nostro centro di sangue ci fornisce circa il 40-60 mL di buffy coat per unità ottenute da donatori di sangue normali. </li><li> Versare il sangue in una bottiglia di vetro sterilizzato 500 mL contenente PBS sterile per diluire buffy coat. Il volume finale di PBS + buffy coat deve essere di 250 mL. </li><li> Riempire dieci provette da 50 ml coniche ciascuno con 20 mL di soluzione Lymphoprep. </li><li> Sovrapporre delicatamente la soluzione Lymphoprep con 25 mL di buffy coat diluito, facendo attenzione a non disturbare la soluzione Lymphoprep. </li><li> Spin provette per 30 minuti a temperatura ambiente a 500 x g. Assicurati di spegnere freno della centrifuga, in modo da non disturbare la frazione dei linfociti. </li><li> Raccogliere le PBMC all&#39;interfaccia tra il Lymphoprep e plasma medio strati con una pipetta. Aspirare il plasma medio-off fino a circa 1 mLricopre ancora il livello di buffy coat contenente le PBMC. Utilizzare una pipetta 10 mL di trasferire PBMC a un nuovo tubo da 50 ml. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS e poi risospendere le cellule in 50 ml di RPMI freddo per contare su un emocitometro. Tipico è il recupero 8 x 10 8 - 1 x 10 9 PBMC. </li></ol> Questa procedura può essere ridotta per i minori volumi di sangue. Diluizione dei campioni di sangue intero è di 1:1 in PBS. 2. Magnetic selezione negativa di cellule CD4 + T totali, CD4 + CD45RA + cellule T naive o CD45RO + CD4 + di memoria delle cellule T da PBMC utilizzando kit di arricchimento EasySep (Cellule Staminali Technologies) Passi da seguire per 1 x 10 8 a 4,25 x 10 8 PBMC. <ol><li> Risospendere le PBMC ad una concentrazione finale di 5 x 10 7 per ml in PBS contenente 2% FBS e 1 mM EDTA. Spostare le celle in una nuova 14 tubo di polipropilene fondo mL. <ol class = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> Isolamento del totale delle cellule CD4 + T umani per selezione negativa: aggiungere umani CD4 + Cocktail cellule T Arricchimento di anticorpi (50 microlitri per ml di PBMC), mescolare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> L&#39;isolamento di cellule T naive per selezione negativa: si aggiungono 50 pl di anticorpo anti-CD45RO per mL di sospensione di cellule PBMC, mescolare e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungi cocktail arricchimento fornito con il kit (50 pl di mL per delle PBMC), mescolare e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> L&#39;isolamento di cellule umane T di memoria per selezione negativa: aggiungere umani CD4 + di memoria Cocktail cellule T Arricchimento di anticorpi (50 microlitri per ml di PBMC), mescolare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Mescolare particelle magnetiche bene anche li distribuiscono in tutta la soluzione. Sei nanoparticelle non vortice dal kit ingenuo. </li><li> Aggiungere le particelle magnetiche (100 pl per mL di PBMC per CD4 + totali e naif selezione di cellule T, 50 pl per mL di PBMC per la selezione della cella di memoria T). Mix pipettando gentilmente 2-3 volte e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per la selezione delle cellule T naive o 5 minuti per CD4 + di memoria o totale di selezione delle cellule T. </li><li> Aggiungi PBS contenente 2% di FBS e 1 mM EDTA per portare il volume fino a 10 ml per provetta. Mescolare con delicatezza pipettando 2-3 volte prima di tubo non livellata in argento EasySep calamita per i minuti 5, 10 o 2.5 per complessivi CD4 + cellule T naive, sottoinsiemi e la memoria, rispettivamente. </li><li> Con tubo ancora in magnete EasySep, versare il liquido in un nuovo tubo da 50 ml a isolare le cellule di interesse. </li><li> Ripetere i punti 2.5 e 2.6 per un miglior recupero. </li></ol> 3. Condizioni della coltura cellulare per indurre cellule T regolatorie <ol><li> Il giorno prima passaggi 1 e 2, cappotto piastre di coltura tissutale da prima diluendo anticorpo anti-CD3 (OKT3 clone) ad una concentrazione di 1 ug / ml in PBS sterile. Per un piatto ben 6 aggiungere 2 mL di PBS + anti-CD3 per bene, per un piatto ben 12 aggiungere 1 ml o per una piastra a 24 pozzetti aggiungere 500 ul per pozzetto. Mantenere la piastra rivestita a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Preparare un mezzo di polarizzazione aggiungendo 10% inattivato al calore siero fetale di bovino (FBS), 100 U / ml penicillina, 100 pg / mL di streptomicina e 50 pM β-mercaptoetanolo a RPMI-1640 pre-integrato con 2,06 mM Glutamax-I e 25 mM HEPES tampone. Successivamente, aggiungere 2 ng / mL TGF-β e 5 ng / ml IL-2. Qui, si può aggiungere ligandi o inibitori di interesse per i media. Risospendere le cellule dal passaggio 2 alla concentrazione di 2 x 10 6 cellule / mL di mezzo di polarizzazione. </li><li> Pre-riscaldare le piastre a 37 ° C e aspirare il PBS di anti-CD3-pozzetti rivestiti prima di aggiungere le cellule. Aggiungere 4 mL per pozzetto di sospensione cellulare per una piastra da 6 pozzetti, 2 mL di cellule per una piastra da 12 pozzetti o 1 mL di cellule per una piastra di ben 24. Riempire i pozzi vuoti con PBS per ridurre l&#39;evaporazione delmedia. Incubare per 3 giorni a 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Il giorno 3 placcatura, spin down piastra in una centrifuga per 5 minuti a 500 x g. Senza disturbare cellule T sul fondo del piatto, togliere la metà di media e sostituirli con mezzi freschi. In alternativa, se il pozzo diventa sovraffollati con cellule (concentrazione superiore 3 x 10 6 / ml), suddividere il volume equamente in un altro anti-CD3 piastra rivestita e aggiungere mezzi freschi indietro fino al volume iniziale. Incubare per due o tre giorni più a 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> 4. Fluorescence-Activated cell sorting (FACS) di tre popolazioni di cellule T <ol><li> Preparare tampone FACS lavaggio aggiungendo 0,5% (w / v) albumina di siero bovino (BSA) e 2 mM EDTA a PBS sterile. Luogo tampone a 4 ° C a fare freddo. </li><li> Rimuovere le cellule di coltura cellulare ben e risciacquare ciascun pozzetto con 2 ml di PBS per assicurare un completo recupero delle cellule. Mettere tutte le celle in tubi di polipropilene da 50 ml e centrifugare a 500 xg per 10minuti a 4 ° C. </li><li> Contare le cellule su un emocitometro per determinare la densità cellulare. </li><li> Luogo 3-5 x 10 5 cellule per tubo in quattro distinte 5 provette a fondo tondo polistirene mL per i controlli di compensazione. Porre le cellule rimanenti in provette da 50 ml di polipropilene, non più di 35 x 10 6 cellule per provetta. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 4 ° C e supporti aspirato. Risospendere le cellule da ordinare in 90 microlitri di tampone di lavaggio a freddo per 1 x 10 6 cellule. Risospendere in 100 pl di tampone di lavaggio a freddo dei tubi di compensazione di controllo. </li><li> Per le celle da ordinati, combinare 2 microlitri di anti-CD25-PE, 3 pl di anti-CD45RA-PE-Cy5 e 1 ul di anti-CD127-APC per 1 x 10 6 cellule. Aggiungere l&#39;assenza di anticorpi al primo tubo controllo compensazione, 2 microlitri di anti-CD25-PE al secondo tubo, 3 pl di anti-CD45RA - PE-Cy5 al terzo tubo e1 pl di anti-CD127-APC al tubo quarto. Incubare tutte le provette in ghiaccio per 45 minuti al buio. </li><li&gt; Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio a freddo alle cellule per essere ordinati e 1 ml di provette controllare la compensazione. Centrifugare tutte le celle a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aspirare celle buffer e risospendere ad una concentrazione di 1 x 10 7 cellule per ml di tampone di lavaggio. Aggiungere 1,5 microlitri di DNasi II per ml di cellule prima di filtrare attraverso un colino 40 cella nylon pM. Spostare le celle a più 5 tubi in polipropilene mL a fondo tondo con non più di 3,5 mL per provetta. Risospendere le cellule di controllo di compensazione in 300 microlitri di tampone di lavaggio. </li><li> Impostare la compensazione al citofluorimetro MoFlo per ridurre al minimo il rilevamento incrociato da parte, PE APC e PE-Cy5 filtri. Impostare porte per ordinare iTregs (CD25 CD127 Hi -/LOW CD45RA - cellule), naïve (CD25-CD45RA +) e la memoria (CD25 - CD45RA -) le cellule T in 5 provette a fondo tondo di polistirolo contenenti 1 ml di siero di vitello neonato mL. </li></ol> 5. Soppressione Assay <ol><li> Fai supprmezzi di analisi ESSIONE aggiungendo 100 U / mL di penicillina, 100 pg / ml di streptomicina, 5 ng / ml di IL-2 e 2 ng / ml di TGF-β per AIM-V. </li><li> Il giorno del saggio, purificare le cellule CD4 + T eterologhi da buffy coat come indicato nei punti 1 e 2. Questi saranno le cellule bersaglio per il saggio soppressione e non contiene CD25 + Treg, come visibile in figura 2, giorno 0. </li><li> Cellule etichette con CellTrace kit come da istruzioni del produttore, ad eccezione usando solo 1 ml di soluzione madre 5 mM per mL di cellule invece di 2 pl. Tenere fuori dalla luce diretta, aggiungere 18 microlitri della DMSO fornito dal kit CellTrace ad un flaconcino di CFSE per ottenere una soluzione stock 5 mM. Risospendere il numero di cellule bersaglio (ad un massimo di 1 x 10 7) preriscaldato in PBS + 0,1% (w / v) BSA ad una concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule / ml. Aggiungere 1 ml di 5 mM CFSE per mL di cellule e incubare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 5 minutes. Aggiungere 5 volumi di completo, ghiacciata RPMI con 10% FBS per placare la colorazione ed incubare in ghiaccio per 5 minuti. Lavare le cellule due volte con freddo RPMI completo e risospendere 1 x 10 5 cellule per 100 pl di mezzi di analisi di soppressione. </li><li> Treg perle ispettore di soppressione sono ad una concentrazione stock di 2 x 10 7 perle / mL. Pellet un certo numero di perline pari al numero totale di cellule per centrifugazione esperimento pratica in una provetta Eppendorf. Lavare perline una volta con RPMI e ri-pellet. Dopo l&#39;aspirazione di RPMI, Risospendere le sfere in modo che la quantità appropriata di perline per pozzetto sono in 8 microlitri di mezzi di soppressione di saggio. </li><li> Per un pozzo rotondo 96 piastra di coltura tissutale inferiore, aggiungere CFSE cellule colorate (1 x 10 5 cellule / ml), perline ispezione e cellule polarizzate e ordinati (1 x 10 5 cellule / ml) in mezzi freschi analisi soppressione di un bersaglio desiderato (tinto CFSE): effector (ordinato) il rapporto in un volume finale di 200 pl. Tutte le condizioni sono impostati in tripliCates. </li><li> Preparare la prima delle due condizioni di controllo aggiungendo 100 pl di cellule colorate CFSE, 8 microlitri di perline di ispezione e 1 x 10 5 di cellule fresche, non marcate in 92 pl dosaggio medio soppressore per pozzetto. Preparare il secondo controllo con gli stessi componenti cellulari come sopra ma senza Treg perline di ispezione. </li><li> Piastra di copertura in foglio di alluminio e incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per cinque giorni. </li><li> Nel buio, raccogliere le cellule di ogni bene da pipettaggio e posto in una provetta da 5 ml fondo rotondo polistirolo. Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C, media aspirato, e risospendere in 300 FACS ul tampone di lavaggio a freddo dal punto 4. Analizzare i primi 3 x 10 4 CFSE + eventi dal cancello dal vivo dei linfociti che rappresentano le cellule bersaglio in un istogramma con il software Cell Quest. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Esempio di pseudocolori flussocitometrici punteggiano trame nell&#39;arco di cinque giorni di tempo couRSE differenziazione iTreg monitoraggio basato sul relativo co-espressione di CD25 con FoxP3, CTLA-4 e CD45RA può essere visto in Figura 2. L&#39;istogramma in figura 3 mostra un saggio di successo soppressione in cui ordinati iTregs (CD25 Hi CD45RA - cellule CD127 -/LOW). Sono il sottoinsieme solo da cinque giorni coltura che ha acquisito la capacità di regolamentazione / soppressore Figura 4 mostra l&#39;induzione di Tregs da un pool di cellule T naïve (pannelli superiori) e un pool di memoria delle cellule T (pannelli inferiori), dopo cinque giorni di cultura medio iTreg standard. CFSE colorazione delle cellule iniziali dimostrano che sia le cellule T naive (pannello superiore a destra) o la memoria (in basso pannello di destra) differenziarsi iTregs (più alto FoxP3-cellule che esprimono) solo dopo diversi cicli di divisione cellulare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di procedura sperimentale. PBMC are separati dal sangue periferico umano tramite centrifugazione in gradiente prima magnetico selezione negativa di CD4 + CD25 - cellule T. Dopo cinque o sei giorni in coltura, le cellule subiscono FACS e sono co-incubate con eterologhe cellule bersaglio CFSE etichettati per misurare l&#39;attività di soppressione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> Figura 2 purificati umani primari CD4 + CD25 -. Cellule T vengono coltivate in iTreg media. Un&#39;aliquota di cellule viene raccolto subito dopo isolamento (giorno 0) e nei giorni 1, 3 e 5 di coltura cellulare per monitorare il progresso di CD45RA, FoxP3, CTLA-4 e marker CD25. Il profilo corrisponde a iTreg CD45RA -, FoxP3 Hi, CTLA-4 e CD25 Hi Hi (evidenziato nel grafico in-finestra). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> Figura 3. Purificato CD4 + CFSE lacellule Beled (1 x 10 5 / pozzetto) sono coltivate con Treg perle ispettore di soppressione in presenza di cellule ordinati ingenuo, di memoria o iTreg (3 x 10 4 / pozzetto). Dopo cinque giorni, le cellule vengono raccolte e il profilo CFSE delle cellule colorate sono analizzate mediante citometria di flusso. La presenza di cellule iTreg abolisce completamente la proliferazione delle cellule T CD4 +. I numeri sono indicativi della percentuale di cellule CFSE marcati che sono stati sottoposti divisione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> Figura 4 purificata umana primaria naïve. (CD4 + CD25 - CD45RA +) e la memoria (CD4 + CD25 - CD45RO +) le cellule T sono colorate con CFSE e coltivate in iTreg media. Dopo cinque giorni, le cellule sono fenotipizzati e le aliquote divisione cellulare stimato. Come indicato nella figura 2, il sottoinsieme iTreg differenziato da entrambi i sottoinsiemi corrispondeCD45RA - CD25 Hi FoxP3 Hi e CTLA-4 Hi (ultime due non mostrato). Profili comparativi di colorazione CFSE identificare iTregs (qui come le cellule che esprimono alti FOXP3 T), come le cellule più proliferativi durante i cinque giorni di cultura.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre il trasferimento Treg detiene un enorme promessa terapeutica nella lotta contro il rigetto del trapianto autoimmunità e altri disturbi del sistema immunitario o infiammatorio-mediata, i metodi per la loro generazione efficiente e stabile di mantenimento non sono ancora state sviluppate. Poiché solo il 1-5% delle cellule T circolanti sono Tregs, la loro espansione e la differenziazione controllata supera questa carenza come un deterrente importante di attuazione del Tregs nella clinica. D&#39;altra parte, come abb...

<table border="1"><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114547 </td><td> Conservare a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> Refrigerato da banco Centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> Brillante-Line emocitometro </td><td> Hausser Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep CD4 + Kit cellule umane T Enrichment </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> CD4 + di memoria EasySep umani Kit cellule T Enrichment </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep umani CD4 + naive Kit cellule T Enrichment </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td> The Big Easy EasySep Magrete </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 18001 </td><td> Argento </td></tr><tr><td> 5 mL di fondo in polistirolo Tubes </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml in polipropilene provette da centrifuga; </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 ml in polipropilene a fondo rotondo Tubes </td><td> BD Falcon </td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml in polipropilene provette da centrifuga; </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> Umana anti-CD3 Antibody </td><td> Bio X cella </td><td> BE0001-2 </td><td> Clone: ​​OKT3 </td></tr><tr><td> 24 Beh piastra di coltura cellulare in polistirolo </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 Beh fondo sferico Tissue piastra di coltura </td><td> Grenier Bio-One </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 con Glutamax-I e tampone HEPES </td><td> Gibco </td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Siero bovino fetale (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> Ricombinante umano TGF-β1 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> Umano ricombinante IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina sierica bovina (BSA) </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> Clone: ​​4E3 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> Clone: ​​HI100 </td></tr><tr><td> Mouse Anti-Human CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> Clone: ​​MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNasi II </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo Citofluorimetro </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo Software </td><td> Albero Star, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cella Quest Software Pro </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Newborn di siero di vitello </td><td> Gibco </td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace CFSE Kit proliferazione cellulare </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg Beads Inspector soppressione </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 micron Nylon ceppo cellulareer </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

generazione di cellule t regolatrici indotte da cellule primarie umane t naive e memoria

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Lo sviluppo e la manutenzione di immunosoppressori CD4 + cellule T regolatorie (Tregs) contribuiscono alla tolleranza periferica necessario per rimanere in omeostasi immunologica con la grande quantità di antigeni self e commensali nel e sul corpo umano. Perturbazioni in bilico tra Tregs e infiammatorie cellule T convenzionali può portare a immunopatologia o il cancro. Sebbene iniezione terapeutico di Tregs ha dimostrato di essere efficace in modelli murini di colite 1, diabete di tipo I 2, artrite reumatoide e malattia dell&#39;innesto verso l&#39;ospite, 4 varie differenze fondamentali umano contro topo Treg biologia 5 ha finora precluso l&#39;uso clinico. La mancanza di numero sufficiente, la purezza, la stabilità e la specificità di homing terapeutica Tregs necessaria una piattaforma dinamica di sviluppo umano su cui Treg per ottimizzare le condizioni per la loro espansione ex vivo 6. Qui D TuttoEscribe un metodo per la differenziazione di indotto Tregs (iTregs) da un singolo donatore di sangue periferico umano che può essere suddiviso in quattro fasi: isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico, selezione magnetico di cellule T CD4 +, in coltura cellulare in vitro e fluorescenza attivato di separazione delle cellule (FACS) di sottoinsiemi di cellule T. Poiché la firma fattore di trascrizione Treg P3 forkhead scatola (FoxP3) è una attivazione indotta da fattore di trascrizione nell&#39;uomo 7 e nessun altro marcatore unico esiste, un pannello combinatoria di marcatori devono essere utilizzati per identificare cellule T con attività soppressiva. Dopo sei giorni di coltura, le cellule del nostro sistema può essere delimitato in ingenui cellule T, cellule T di memoria o iTregs in base alla loro relativa espressione di CD25 e CD45RA. Mentre le cellule T di memoria e ingenuo hanno diversi requisiti di polarizzazione segnalati e plasticities 8, pre-selezione della popolazione iniziale delle cellule T in CD45RA + e + CD45RO sottoinsiemi possono be utilizzato per esaminare queste discrepanze. Coerentemente con gli altri, il nostro CD25 Hi CD45RA - iTregs esprimono alti livelli di FoxP3 9, GITR e CTLA-4 11 e bassi livelli di CD127 12. Dopo FACS di ciascuna popolazione, le cellule risultanti possono essere utilizzati in un saggio soppressore che valuta la relativa capacità di ritardare la proliferazione di carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE)-marcato cellule T autologhe.

Noi descriviamo un metodo per generare le cellule T normativo, di memoria e naif da un singolo donatore di sangue umano. Polarizzato Tregs può essere quindi confrontato con altri sottoinsiemi in una varietà di applicazioni genetiche e funzionali con omogeneità genetica, comprendente un saggio di soppressione anche dettagliati qui.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

Lo sviluppo e il mantenimento delle cellule T regolatorie (Treg) CD4+ immunosoppressive contribuiscono alla tolleranza periferica necessaria per rimanere in...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule T regolatorie umane a partire da cellule T primarie. Innanzitutto, i globuli bianchi mononucleati vengono isolati da campioni di sangue umano. Le cellule T positive per CD4 vengono quindi purificate dalla miscela di PBMC e coltivate.Dopo sei giorni, le cellule vengono separate in sottoinsiemi di cellule T naive, della memoria, effettrici e regolatorie indotte mediante citometria a flusso e vengono eseguiti saggi di soppressione. L'utilizzo di queste cellule dimostra che questo metodo genera cellule T regolatorie umane dotate di attività soppressiva. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto a quelle che utilizzano cellule mononucleate del sangue periferico sono che il nostro metodo umano ha una maggiore rilevanza fisiologica e clinica e consente il confronto tra treg e altre popolazioni cellulari all'interno di un singolo donatore.Eliminazione della variabilità interna tra soggetti. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule regolatorie, come ad esempio quali sono gli eventi regolatori che modulano la transizione tra linfociti T convenzionali e cellule regolatorie, oppure quali sono

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra un test per generare cellule T CD8αβ+ derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da cellule T CD8αβ+ specifiche per l'antigene tumorale. Le iPSC antigene-specifiche del tumore vengono coltivate su un monostrato di cellule stromali e differenziate in cellule progenitrici ematopoietiche (HPC). Le HPC sono differenziate in cellule T CD4+ CD8+ doppiamente positive utilizzando un mezzo di differenziazione. Queste cellule vengono quindi stimolate a generare...

Generazione di singole cellule T CD8 positive da cellule staminali pluripotenti indotte

CD4+ Le cellule T regolatorie sono potenti immunomodulatori e svolgono importanti funzioni nell'omeostasi immunitaria. La scarsità di queste cellule nel sangue periferico rende difficili gli studi funzionali, in particolare nel contesto dell'infezione da HIV-1. Qui descriviamo un metodo per isolare ed espandere le Treg CD4+ funzionali dal sangue periferico di individui con infezione da HIV-1.

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

Adenovirale trasferimento genico nelle cellule T CD4 naive con transgenici espressione del recettore adenovirus Coxsackie permette l'analisi molecolare della differenziazione delle cellule T...

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Questo articolo descrive un metodo per la generazione e la propagazione di cloni di cellule T umane che rispondono specificamente a un alloantigene definito. Questo protocollo può essere adattato per la clonazione di cellule T umane specifiche per una varietà di ligandi peptidici-MHC.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

Le cellule T CD4+ ingenue si polarizzano in vari sottoinsiemi a seconda dell'ambiente al momento dell'attivazione.  La differenziazione delle cellule T CD4+ naive in vari sottogruppi di effettori può essere ottenuta in vitro attraverso l'aggiunta di stimoli recettoriali delle cellule T e segnali specifici delle citochine.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Questo protocollo descrive la generazione riproducibile e fenotipizzazione delle cellule T regolatorie indotte umane (iTregs) dalle cellule naïve T CD4 + in vitro. Diversi protocolli per l'induzione FOXP3 permettono lo studio di specifici fenotipi iTreg ottenuti con rispettivi protocolli.

La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Questo articolo descrive un nuovo metodo per generare emigranti timici (iTE) derivati da cellule staminali specifiche dell'antigene tumorale del tumore da un sistema di coltura timica tridimensionale (3D). ITE sono un sottoinsieme omogeneo di cellule T strettamente correlate alle cellule T ingenue con la capacità di proliferazione, formazione della memoria, e la soppressione del tumore.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

In questo articolo viene descritto un metodo per generare un metodo per generare un sistema di cocoltura indotto da cellule staminali indotto specifico dell'antigene del tumore funzionale, cd8- singole cellule T positive utilizzando il sistema di co-coltura OP9/DLL1.

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

Presentato qui è un protocollo per l'effettiva soppressione della replicazione del virus dell'epatite B (HBV) nei topi utilizzando il trasferimento di cellule adottive (ACT) di antigeni virali (Ag) specifici di cellule staminali. Questa procedura può essere adattata per una potenziale immunoterapia basata su ACT dell'infezione da HBV.

Le cellule staminali derivate dall'ag virale specifico t linfociti sopprimeno la replica HBV nei topi

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).

Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Impara a generare cellule T regolatrici indotte da cellule T naive e memoria umane. Questo metodo consente confronti tra sottopopolazioni cellulari nello stesso donatore, eliminando la variabilità inter-individuale per studi di immunologia.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

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