Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule T regolatorie umane a partire da cellule T primarie. Innanzitutto, i globuli bianchi mononucleati vengono isolati da campioni di sangue umano. Le cellule T positive per CD4 vengono quindi purificate dalla miscela di PBMC e coltivate.

Dopo sei giorni, le cellule vengono separate in sottoinsiemi di cellule T naive, della memoria, effettrici e regolatorie indotte mediante citometria a flusso e vengono eseguiti saggi di soppressione. L'utilizzo di queste cellule dimostra che questo metodo genera cellule T regolatorie umane dotate di attività soppressiva. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto a quelle che utilizzano cellule mononucleate del sangue periferico sono che il nostro metodo umano ha una maggiore rilevanza fisiologica e clinica e consente il confronto tra treg e altre popolazioni cellulari all'interno di un singolo donatore.

Eliminazione della variabilità interna tra soggetti. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule regolatorie, come ad esempio quali sono gli eventi regolatori che modulano la transizione tra linfociti T convenzionali e cellule regolatorie, oppure quali sono gli eventi di segnalazione e trascrizionali specifici delle cellule regolatorie? Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie delle malattie autoimmuni, delle condizioni infiammatorie e del cancro, a causa del ruolo fondamentale svolto dalle regs nell'omeostasi immunitaria.

Generalmente, le persone alle prime armi incontrano difficoltà a causa della varietà di tecniche impiegate e, in alcuni passaggi, della ristretta finestra di condizioni ottimali per la coltura cellulare. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo reg, può anche essere utilizzato per monitorare la plasticità della differenziazione della linea cellulare T o per analizzare la capacità del milli delle cellule T di indurre o prevenire tale processo. A dimostrare la procedura saranno Andrea McCool e gli studenti universitari Marie Catherine Ranier Gavin Ellis e Catalina Vale Ortega.

Iniziare questa procedura isolando le cellule mononucleate del sangue periferico umano da 40 a 60 litri di Buffy coat; diluire il Buffy coat trasferendolo in una bottiglia di vetro da 500 millilitri sterilizzata in autoclave contenente 150 millilitri di PBS sterile. Aggiungere quindi altro PBS sterile per portare il volume finale a 250 millilitri. Successivamente, riempire 10 provette coniche da 50 millilitri, ciascuna con 20 millilitri di soluzione lympho prep.

Quindi, sovrapporre delicatamente 25 millilitri del buffy coat diluito alla soluzione Lympho prep, avendo cura di non disturbare la soluzione Lympho prep. Centrifugare i tubi per 30 minuti a temperatura ambiente a 500 ×g. Assicurarsi di disattivare il freno della centrifuga per non disturbare la frazione di linfociti.

Dopo la centrifugazione, il CS PBM si troverà all'interfaccia tra il mezzo lympho prep e lo strato di plasma, da cui va raccolto. Aspirare il mezzo plasmatico fino a quando circa un millilitro ricopre ancora lo strato del buffy coat contenente i pbmc. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire i pbmc in un nuovo tubo da 50 millilitri.

Dopo aver lavato le cellule due volte con PBS, risospendere in 50 millilitri di RPMI freddo e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Il recupero tipico è di otto volte 10 alla ottava fino a una volta 10 alla nona PBMC dopo aver determinato la concentrazione. Risospendere le PBMC a una concentrazione finale di cinque volte 10 alla settima per millilitro in PBS contenente 2% di FBS e un millimolare di EDTA, quindi trasferire le cellule in un nuovo tubo conico in polipropilene da 14 millilitri.

Successivamente, il kit EAs verrà utilizzato per selezionare negativamente le cellule di interesse. I cocktail di arricchimento per linfociti T forniti con il kit contengono un complesso anticorpale tetramerico, che presenta un anticorpo anti-destrina su un lato e un anticorpo contro antigeni di superficie delle cellule indesiderate sull'altro lato. Quando il cocktail viene aggiunto alle cellule, il complesso anticorpale tetramerico collega le cellule indesiderate.

Si aggiungono quindi particelle magnetiche rivestite con destrano, che si legano al complesso anticorpale tetramerico, collegando la cellula indesiderata alla particella magnetica. Si applica quindi un magnete per separare le cellule indesiderate dalle cellule di interesse, che vengono poi raccolte per isolare i linfociti T positivi per CD4. Pipettare da una volta 10 alla ottava a 4,25 volte 10 alla ottava pbmc in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere quindi 50 microlitri di cocktail di arricchimento per linfociti T positivi per CD4 umano, contenente anticorpi, per ogni millilitro di pbmc.

Mescolare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Mescolare le particelle magnetiche per distribuirle uniformemente in tutta la soluzione. Aggiungere 100 microlitri di particelle magnetiche per ogni millilitro di PBMC.

Mescolare pipettando delicatamente due o tre volte, quindi incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Aggiungere PBS contenente FBS ed EDTA per portare il volume a 10 millilitri per tubo, mescolando delicatamente con la pipetta due o tre volte. Successivamente, posizionare il tubo senza tappo nel magnete cept per cinque minuti, lasciando il tubo all'interno del magnete.

Versare il liquido in un nuovo tubo da 50 millilitri per isolare le cellule di interesse e ottenere un migliore recupero. Ripetere questa procedura aggiungendo ulteriore P-B-S-F-B-S-E-D-T-A al tubo, mescolare e riposizionare il campione nel magnete. Una volta isolate le cellule, contarle quindi centrifugare a 500 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di polarizzazione per raggiungere una concentrazione di due per 10 alla sesta cellule per millilitro. Procedere quindi alla coltura come descritto nella sezione successiva del video per indurre linfociti T regolatori. Preriscaldare le piastre di coltura tissutale, da sei pozzetti, rivestite con anti-CD3 a 37 gradi Celsius.

Una volta che le piastre sono calde, aspirare il PBS dai pozzetti. Quindi aggiungere quattro millilitri di sospensione cellulare arricchita in CD4 positivi a ciascun pozzetto. Riempire eventuali pozzetti vuoti con PBS per ridurre l'evaporazione del mezzo e incubare per tre giorni dopo l'incubazione.

Centrifugare la piastra per cinque minuti a 500 × g. Successivamente, senza disturbare le cellule sul fondo della piastra, rimuovere metà del mezzo e sostituirlo con mezzo fresco, quindi incubare per altri due o tre giorni. Le cellule possono ora essere ordinate mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza come descritto nella sezione successiva, oppure utilizzate come cellule bersaglio per un saggio di soppressione come descritto in seguito. Dopo il trascorrere di due o tre giorni, preparare le cellule e i controlli di compensazione appropriati per lo sorting cellulare attivato da fluorescenza. Per separare mediante sorting le cellule T regolatorie indotte, naive e della memoria, colorare le cellule da ordinare con anti-CD25 PE, anti-CD45RA PE-Cy5 e anti-CD127 APC come descritto nel documento allegato.

Assicurarsi inoltre di aggiungere anticorpi ai controlli di compensazione appropriati per l'analisi FACS. Dopo la colorazione, risospendere le cellule a una concentrazione di 1 × 10⁷ cellule per millilitro di buffer di lavaggio, quindi aggiungere 1,5 microlitri di DNAsi II per millilitro di cellule e filtrare le cellule attraverso un filtro in nylon da 40 micron. Trasferire le cellule in provette polipropileniche rotonde da 5 millilitri, con non più di 3,5 millilitri per provetta.

Risospendere le cellule di controllo per la compensazione in 300 microlitri di buffer di lavaggio. Impostare la compensazione sul citometro a flusso per minimizzare il rilevamento incrociato da parte dei filtri PE, APC e PE-Cy5. Impostare le finestre di selezione (gates) per ordinare le cellule Treg, naive e a memoria, in provette rotonde da 5 millilitri in polistirene contenenti 1 millilitro di siero di vitello neonato, al fine di valutare se le cellule T regolatorie generate durante l'ordinamento siano in grado di sopprimere la proliferazione delle cellule T.

Viene eseguito un saggio di soppressione. Le cellule CD4 positive arricchite, non ordinate, fungeranno da cellule bersaglio. Queste non dovrebbero contenere cellule T regolatorie indotte CD25 positive.

Iniziare etichettando le cellule bersaglio con CFSE utilizzando un kit per il tracciamento cellulare secondo le istruzioni del produttore, impiegando un microlitro di soluzione madre a cinque moli per millilitro di cellule invece di due microlitri. Successivamente, formare un pellet di un numero di microsferette ispettrici per la soppressione da parte delle Treg pari al numero totale di cellule, mediante centrifugazione rapida in una provetta per microcentrifuga. Lavare le microsferette una volta con RPMI e riguadagnare il pellet dopo la centrifugazione.

Aspirare l'RPMI e ri-sospendere in otto microlitri di mezzo per saggio di soppressione per pozzetto, fino alla concentrazione appropriata, in una piastra per colture cellulari a fondo rotondo da 96 pozzetti. Aggiungere otto microlitri di cellule bersaglio marcate con CFSE. Ispezionare le microsfere e le cellule ordinate polarizzate fino a raggiungere un volume finale di saggio di soppressione fresco.

Medio di 200 microlitri. Tutte le condizioni sono seminate in triplicato. Per preparare i controlli, aggiungere 100 microlitri di cellule marcate con CFSE, otto microlitri di microsfere indicatrici e una volta 10 alla quinta di cellule fresche non marcate in 92 microlitri di saggio di soppressione.

Aggiungere 100 microlitri di mezzo per pozzetto nei primi due pozzetti di controllo. Quindi aggiungere 100 microlitri di cellule marcate con CFSE e una volta 10 alla quinta di cellule fresche non marcate in 92 microlitri di saggio di soppressione. Aggiungere 100 microlitri di mezzo per pozzetto nei secondi due pozzetti di controllo.

Coprire la piastra con della carta d'alluminio e collocarla nell'incubatrice per cinque giorni al buio. Raccogliere le cellule da ogni pozzetto mediante pipettaggio e trasferirle in un tubo in polistirene rotondo da cinque millilitri. Centrifugare le cellule a 500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Aspirare il mezzo e ri-sospendere in 300 microlitri di buffer freddo per il lavaggio FAX. Per monitorare l'andamento della differenziazione in cellule T regolatorie indotte, cellule T primarie umane CD4 positive CD25 negative purificate sono state coltivate in aliquote di mezzo iTreg; campioni prelevati al giorno 0, 1, 3 e 5 sono stati analizzati mediante citometria a flusso per valutare l'espressione dei marcatori CD45RA, FoxP3, CTLA-4 e CD25, come mostrato in questi grafici a punti pseudocolorati. Nel corso di cinque giorni, le cellule proliferano e si differenziano in vitro in risposta al cross-linking del CD3 in presenza di TGF-beta e IL-2, portando infine a un profilo CD45RA negativo, FoxP3 alto, CTLA-4 alto e CD25 alto. Questo indica lo sviluppo di treg indotte a partire da precursori convenzionali di cellule T. Per valutare la capacità relativa delle treg generate di sopprimere la proliferazione delle cellule T.

Le cellule marcate con CFSE sono state coltivate con microsferette ispettore della soppressione da treg in presenza di cellule naive, memory e treg ordinate, come si può osservare in questo istogramma. Cellule CD25 high, CD45RA negative, CD127 negative. Le cellule T regolatorie indotte a basso livello sono l'unico sottoinsieme derivante da una coltura di cinque giorni che ha acquisito capacità soppressiva regolatoria.

Ciò indica che le cellule generate in questo sistema sono cellule T regolatorie soppressorie sia fenotipicamente che funzionalmente, piuttosto che cellule T convenzionali attivate, che possono esprimere transitoriamente FOX P tre e CD 25, ma non sono immunosoppressive. La presenza di cellule T regolatorie indotte abolisce completamente la proliferazione delle cellule T positive per CD quattro. I valori numerici indicano la percentuale di cellule marcate con CFSC che hanno subito divisione, al fine di verificare che ciò valga anche per i sottoinsiemi purificati di cellule T.

I linfociti T primari umani naïve e della memoria sono stati marcati con CFSE e coltivati nel mezzo per Treg. Dopo cinque giorni, le cellule sono state fenotipizzate e i tassi di divisione cellulare sono stati stimati come osservato. In questo caso, i Treg sono stati indotti a partire da un pool di linfociti T naïve e da un pool di linfociti T della memoria dopo una coltura di cinque giorni.

In un mezzo di coltura IT standard, colorazione con CFSE. La colorazione delle cellule iniziali mostra che sia le cellule T naive che le cellule T della memoria si differenziano in cellule T regolatorie solo dopo diversi cicli di divisione cellulare; i profili comparativi di colorazione con CFSE identificano le cellule T regolatorie indotte come le cellule più proliferative durante la coltura di cinque giorni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come ottenere cellule T indotte a partire da una popolazione di cellule T naive, della memoria o totali ottenute da un singolo donatore durante il tentativo di questa procedura.

È fondamentale mantenere una tecnica sterile per tutto il tempo e prevenire l'esposizione della CFSE alla luce seguendo questa procedura. Altri metodi, come saggi funzionali, possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande, ad esempio quali sono le differenze nei tassi di divisione cellulare, nella sintesi di citochine specifiche e nell'utilizzo di canali ionici tra linfociti T regolatori e convenzionali dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare malattie autoimmuni e altre patologie correlate alle cellule T regolatorie in pazienti umani.

Non dimenticare che lavorare con sangue umano è estremamente pericoloso e che durante questa procedura devono sempre essere adottate precauzioni come adeguati test presso banche del sangue e lo smaltimento corretto.