Name: Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Scopri la tecnica ChIA-PET per analizzare le interazioni cromatiniche a livello genomico e comprendere la regolazione trascrizionale. Questo metodo combina immunoprecipitazione della cromatina con ligatione di prossimità e sequenziamento next-generation.

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Gli autori sono supportati da A * STAR di Singapore. Inoltre, MJF è supportata da una borsa di studio STAR A * National Science, uno Oreal For Women in Science Fellowship nazionale e Lee Kuan Yew Post-Doctoral Fellowship. YR è supportato da sovvenzioni NIH Codifica HG004456 (R01-01 e R01 HG003521-01). Gli autori riconoscono anche la squadra videografia di 8 Pixel Productions, Singapore, in particolare il signor Kelvin Issey, Mr. Chang Kai Xiang e il signor Sherwin Gan per girare le scene, la signora Siti Rahim per il video editing e la signora Michelle Teo per la voice-over.

<ol><li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SATB1+packages+densely+looped%2C+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li>
<li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li>
<li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li>
<li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li>
<li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22(2010).</li>
<li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li>
<li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12(2007).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+at+a+distance%3A+DNA-looping+and+initiation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li>
<li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Chia-PET è un metodo sviluppato per identificare le interazioni a lungo raggio di regolazione della trascrizione. Uno dei fattori critici che determinano la qualità di un Chia-PET libreria è la qualità del materiale ChIP. Il protocollo mostrato nel video incorpora l&#39;uso di EGS e formaldeide per reticolare le cellule. L&#39;uso di formaldeide combinato con un secondo reagente di reticolazione che porta un braccio più lungo distanziatore può aiutare nel legame di proteine ​​che non poteva essere vincolati dalla sola formaldeide 3,11,15. Abbiamo costruito librerie con questo metodo, che hanno dimostrato robuste siti di legame e interazioni a lungo raggio 9. Tuttavia, la reticolazione e condizioni chip dovrebbe essere ottimizzato per ogni fattore di interesse, ed è importante non troppo reticolazione come troppo reticolazione comporta difficoltà di frammentazione per sonicazione, e può eventualmente provocare interazioni cromatina spuri . Le interazioni della cromatinaidentificato da Chia-PET dovrebbe essere convalidato con un metodo diverso, come fluorescenza ibridazione in situ 4. Si consiglia un minimo di 100 ng di materiale cromatina. Mentre abbiamo costruito librerie di buona qualità da 50 ng di materiale cromatina, abbiamo osservato che grandi quantità di materiale di partenza ha permesso la costruzione di Chia-PET librerie con meno di 16 cicli di PCR, amplificati in modo da minimizzare e la ridondanza di ogni libreria. Questa ridondanza inferiore correlato con alti tag unici mappati e anche una percentuale elevata di dati utilizzabili, consentendo così una più completa mappa interazione cromatina con meno corsie di sequenziamento. Il volume finale ricco di perle in ogni tubo dovrebbe essere di 50 ul e 100 microlitri per biglie magnetiche e Sepharose rispettivamente. Se il volume ricco di cordone è inferiore a quella indicata, portare a volume minimo imballato con biglie magnetiche o Sepharose simile pre-autorizzato in bianco per ridurre al minimo la perdita di DNA-cuscinetto tallones nei passaggi successivi. Sawed-off consigli o suggerimenti di grandi dimensioni-core dovrebbe essere usato per pipettaggio perline Sepharose. Le modifiche seguenti sono stati inseriti a seguito della precedentemente pubblicato con il Chia-PET protocollo 5. In primo luogo, magnetici perle G sono stati utilizzati per ridurre al minimo la perdita del campione durante i lavaggi. Inoltre, abbiamo identificato non-specifici gruppi con dimensioni approssimative di 100 bp e 138 bp per essere ampliconi di auto-legato mezze linkers o / e adattatori. Pertanto, si riduce la concentrazione di biotinilati mezze linkers e 454 GS20 adattatori per ridurre al minimo non-specifiche bande durante l&#39;amplificazione PCR. Il volume vicinanza ligazione è stato ridotto da 50 ml a 10 ml per minimizzare la perdita di campione durante successive fasi di purificazione e di risparmiare sui costi dei reagenti. Abbiamo anche aumentato il tempo di incubazione di immobilizzare Chia-PET DNA a microsfere per garantire la cattura massima di Chia-PET DNA sulle perline streptavidina. Durante la fase di legatura di prossimità, legature chimerici that non rappresentano vero in vivo interazioni cromatina sono inevitabilmente generate in modo non specifico e casuale. Quindi, per valutare la qualità dei dati da qualsiasi Chia-PET esperimento, il tasso di chimerismo viene stimata dalla uso di due differenti mezze linkers nucleotidica specifica con codici a barre e TAAG ATGT 5. Dopo alta sequenziamento, il Chia-PET sequenze sono dapprima analizzati per la composizione barcode linker e sequenze derivate da prodotti di ligazione specifici e non specifici prodotti di ligazione si possono distinguere 8. La percentuale di chimere conosciute (ad esempio eterodimeri linkers AB) presenti nella nostra società in-house MCF-7 RNA polimerasi II Chia-PET librerie è inferiore al 15%. Chia-PET sequenze sono poi classificati in due categorie, vale a dire auto-legatura tra PET e PET-legatura. Self-legatura PET sono ottenuti da self-circolarizzazione legatura dei frammenti di cromatina, mentre inter-legatura PET sono derivati ​​da inter-ligazione tra due frammenti di DNA differenti. Quest&#39;ultimo è quindi suddiviso in tre differenti categorie a seconda della distanza genomica di ciascuna etichetta sul cromosoma stesso (intracromosomica inter-ligazione PET) o che entrambi i tag vengono mappati a due cromosomi diversi (interchromosomal inter-ligazione PET). Abbiamo sviluppato una Chia-PET pacchetto software strumento per risolvere le diverse categorie 8. Questo si basa sui frammenti di DNA che sono nella libreria. In generale, i frammenti più piccoli ChIP darà una maggiore risoluzione e la tagliata di questi RNA polimerasi II Chia-PET librerie è di circa 4 kb. Inoltre, le interazioni cromatina reali possono essere distinte dal rumore casuale contando il numero di inter-ligazione PET in un cluster interazione, in altre parole, un cluster di conteggio PET alto è detto avere una probabilità maggiore di essere una interazione cromatina reale 8 . Per filtrare i falsi positivi unopassare da ancore altamente arricchito, che può formare inter-legatura PET per caso a caso, un quadro di analisi statistica è stata formulata per spiegare la formazione casuale di qualsiasi inter-legatura animali da compagnia tra due ancore 8. In conclusione, il Chia-PET tecnica permette di mappare le reti di interazione cromatina su scala globale. L&#39;implementazione di ChIP in Chia-PET consente la riduzione della complessità della libreria e rumore di fondo. Inoltre, aggiunge ChIP specificità per le interazioni della cromatina, consentendo l&#39;esame delle interazioni della cromatina specifici associati a particolari fattori di trascrizione 5.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> 4-20% di pendenza TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Fase B, 6.3 </td></tr><tr><td> 5 x T4 DNA ligasi Buffer con PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Fase B, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Fase B, 6.8 </td></tr><tr><td> Agilent DNA 100 Assay </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Fase B, 7.1 </td></tr><tr><td> Agilent ad alta sensibilità del test del DNA </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Centrifugare Filtri tubi (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Fase B, 3.7 e 6.9 </td></tr><tr><td> Reader Transilluminatore scuro </td><td> Clare Chemical Research </td><td> DR46B </td><td> Fase B, 6.8 </td></tr><tr><td> Digital Sonifier cella Disrupter </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Fase A, 4,3 </td></tr><tr><td> DynaMag-2 magnete (Concentrator particelle magnetiche) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Fase A, Fase B 7.5.1, per tutte le biglie magnetiche lavaggio passi </td></tr><tr><td> DynaMag-15 Magnet (Concentrator particelle magnetiche) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Fase A, 5 e 6 </td></tr><tr><td> DynaMag-PCR (Concentrator particelle magnetiche) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Fase B, 6.5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli DNA polimerasi I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Fase B, 5,6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> Fase A, Fase B 7.5.1, 4.3 e 6.5 </td></tr><tr><td> Illumina CBOT System Cluster Generation </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Fase B, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina Genome Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Fase B, 7,5 </td></tr><tr><td> Illumina PE primer </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Fase B, 5,4 (se necessario) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Fase B, le incubazioni con rotazione </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR System </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Fase A, Fase B 7.5.3, 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Fase B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 streptavidina Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Fase B, 5.2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Magnetic (Dynabeads) Proteine ​​G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Fase A, 5.1.1 e 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract ad alta densità (2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Fase A, 7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract ad alta densità (50ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Fase B, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNAsi ONE ribonucleasi </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Fase B, 4.8 </td></tr><tr><td> RNA polimerasi II (8WG16) anticorpo monoclonale </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Fase A, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Provette da centrifuga Oak Ridge (polipropilene) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Fase A, 3,1 </td></tr><tr><td> Provette da centrifuga Oak Ridge (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Fase B, 4.3 </td></tr><tr><td> PHUsion ad alta fedeltà Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Fase B, 6 </td></tr><tr><td> Picogreen (Quant-iT) reagente dsDNA </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Fase A, 7.5.2 </td></tr><tr><td> Polistirolo Provetta a fondo sferico </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Fase A, 4,1 </td></tr><tr><td> Cocktail di inibitori della proteasi compresse (completo, EDTA-free) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Fase A, 1.6 in poi </td></tr><tr><td> Proteinasi K Solution (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Fase A, 4.4, 7.5.1 Fase B, 4.1 </td></tr><tr><td> DNA ligasi T4 </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Fase B, 2.2, 3.9 e 5.4 </td></tr><tr><td> T4 DNA ligasi Buffer (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Fase B, 3.3 e 3.9 </td></tr><tr><td> DNA polimerasi T4 </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Fase B, 1.2 </td></tr><tr><td> DNA T4 polinucleotide chinasi </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Fase B, 3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Reggenti per Illumina Genome Analyzer IIx sistema </td></tr><tr><td> TruSeq PE Cluster Kit v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> per essere utilizzato con il sistema Illumina Generation Cluster CBOT </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Fase B, 6.3 e 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis sistema </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Fase B, 6.3 e 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td colspan="2"> Sequenza </td><td> Comments </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilato mezze linkers A (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato interno Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinilato mezze linkers B (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GGC CGC GA / iBiodT / ATA CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato interno Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA ATG TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato </td></tr><tr><td rowspan="2"> Non biotinilati mezze linkers (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;GGC CGC GAT ATC GGA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptor A (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;CAT TCT CCA CCC TGC GTG TCC CATCTG TTC CCT CCC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC AGA TGG GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adattatore B (200ng/μl) </td><td> Top </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC GCA ACA GGG GAT AGG CAA GGC ACA CAG GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATC CCC CCT TGT GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN adattatori </td><td> Top </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato Vedi Fase B, 5.4 </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;phos - GAT CGG AAG AGC GGT TCA GCA GGA ATG CCG AG 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala HPLC purificato fosforilata 5 &#39;Vedere B Step, 5,4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (in avanti) primer (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC ACC GAG ATC TAC CTA TCC CCT GTG TGC CTT G 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (reverse) primer (10 micron) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmoli scala PCR Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1.1 (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG A 3&#39; </td><td> 10nmole scala PCR Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2.1 (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole scala PCR Grade </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 sequenziamento primer (100 um) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG TTC CCT CCC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole scala HPLC purificato </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 sequenziamento primer (100 um) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA GTT TCC CCT GCG TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> Scala 100nmoleHPLC purificato </td></tr></tbody></table> Oligo ordine Tabella di oligo e adattatori. Da Integrated DNA Technologies (IDT) e preparare linkers e adattatori nello stesso modo descritto in precedenza 10. Mezze linker e adattatori possono essere preparate in anticipo e conservati per diversi mesi a -20 ° C.

cromatina analisi interazioni con tag sequencing appaiati-end (chia-pet) per la mappatura interazioni cromatina e comprensione del regolamento trascrizione

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomi sono organizzati in strutture tridimensionali, adottando ordine superiore conformazioni all&#39;interno degli spazi nucleari dimensioni micron 7, 2, 12. Architetture di questo tipo non sono casuali e comportano interazioni tra geni promotori e gli elementi normativi 13. Il legame di fattori di trascrizione specifici per sequenze regolatrici determina una rete di regolazione della trascrizione e coordinamento 1, 14. Interaction Analysis cromatina per tag Sequencing paired-End (Chia-PET) è stato sviluppato per identificare queste strutture sovra-ordinate cromatina 5,6. Cellule vengono fissate e loci interagenti sono catturati dal covalenti DNA-proteina legami incrociati. Per minimizzare il rumore non specifico e ridurre la complessità, così come per aumentare la specificità del analisi dell&#39;interazione cromatina, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) viene usato contro fattori proteici specifici per arricchire frammenti cromatina di interesse prima legatura prossimità. Legatura coinvolgendo mezze linkers successivamente forma legami covalenti tra coppie di frammenti di DNA legati insieme all&#39;interno di complessi cromatina individuali. I accompagnamento MmeI siti di restrizione degli enzimi nella mezza linkers permettono l&#39;estrazione di coppie di terminali tag-linker-tag costrutti (PET) su MmeI digestione. Poiché le mezze linkers sono biotinilati, questi costrutti PET sono purificati utilizzando streptavidina-perle magnetiche. Le PET purificati vengono legati con la prossima generazione di adattatori di sequenziamento e un catalogo di frammenti interagenti viene generato tramite sequencer di nuova generazione come il Illumina Genome Analyzer. Mappatura e analisi bioinformatica viene quindi eseguita per identificare ChIP arricchito vincolante siti e ChIP arricchiti interazioni cromatina 8. Abbiamo prodotto un video per dimostrare aspetti critici del Chia-PET protocollo, in particolare la preparazione del chip come la qualità di ChIP gioca un ruolo importante nel risultato di una Chia-PET libreria. Poiché i protocolli sonomolto lungo, solo i punti critici sono mostrati nel video.

Interaction Analysis cromatina per tag Sequencing paired-End (Chia-PET) è un metodo per<em&gt; De novo</emRilevazione&gt; delle interazioni della cromatina, per una migliore comprensione del controllo trascrizionale.

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

I genomi sono organizzati in strutture tridimensionali, assumendo conformazioni di ordine superiore all'interno degli spazi nucleari di dimensioni microniche 7, 2, 12. Tali...

L'analisi dell'interazione COMIN mediante sequenziamento di polvere e marcatura è un metodo per l'analisi su scala genomica delle interazioni comin a lungo raggio. In breve, definiamo questo metodo come magic share pad. Il metodo comprende numerosi passaggi di biologia molecolare e può risultare complesso.Pertanto, in questo video dimostrativo, vi mostreremo alcuni dei passaggi chiave coinvolti nella costruzione della libreria per l'analisi ChIP-PET, compresa l'immunoprecipitazione della cromatina. L'immunoprecipitazione della cromatina, nota come ChIP, rappresenta il primo passaggio fondamentale nella costruzione di una libreria ChIP-PET. In questa fase, i campioni di cromatina ottenuti da colture cellulari vengono cross-linkati, sonificati e sottoposti a immunoprecipitazione.Aliquote separate di DNA da chip vengono quindi ligate a mezzicollegatori con codice a barre e viene effettuata la ligazione per prossimità. I PET (tag di estremità concatenati) vengono rilasciati mediante digestione con enzimi di restrizione, purificati su microsfere magnetiche rivestite e ligati ad adattatori per il sequenziamento di nuova generazione. I PET chimera vengono identificati tramite la composizione del collegatore AB e il sequenziamento delle regioni adiacenti ai tag.La sequenza del linker centrale viene letta e mappata sul genoma. In questo video mostreremo il protocollo chip standard utilizzato abitualmente nel nostro laboratorio su una linea cellulare tumorale della mammella, MCF7. Dai nostri dati, un arricchimento chip maggiore con anticorpi specifici produce dati chair pet migliori. Pertanto, raccomandiamo vivamente l'ottimizzazione del protocollo chip e la validazione dell'arricchimento mediante QPCR.Prima di procedere alla costruzione della libreria di cromatina, coltivare sette linee cellulari fino a raggiungere una confluenza del circa 75% in una piastra per colture cellulari quadrata da 500 centimetri quadrati, contenente circa 20 milioni di cellule prima dell'incrocio. Rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule due volte. Fissare le cellule con EGS 1,5 millimolare appena preparato per 45 minuti su un agitatore rotante a temperatura ambiente, aggiungendo formaldeide al 37% per ottenere una concentrazione finale dell'1% e incubare per 20 minuti.L'efficienza della crosslinking è fondamentale e varia in base alle linee cellulari e alla proteina di interesse. La concentrazione, il tempo di incubazione e la temperatura della reazione di crosslinking devono essere ottimizzati. Bloccare i crosslinker con una concentrazione finale di 200 millimoli di glicina per 10 minuti.Scartare i cross linker spenti e lavare due volte con PBS freddo. Raccogliere le cellule raschiando il pellet delle cellule con una centrifuga da banco refrigerata. Il pellet è ora pronto per la lisi cellulare. In alternativa, congelare il pellet a meno 80 gradi Celsius. Se il pellet cellulare è congelato, scongelare sul ghiaccio prima di procedere con la lisi cellulare e risospendere il pellet in buffer di lisi contenente SDS 0,1%.Ruotare il tubo a quattro gradi Celsius con una centrifuga refrigerata, scartare il soprannatante e ripetere la lisi cellulare. Una volta eseguita la lisi nucleare per rilasciare la cromatina legata a incrocio, prima della frammentazione della cromatina. L'assenza della membrana nucleare permette alla cromatina legata a incrocio di essere sottoposta a sonificazione in condizioni più dolci.Reus Band palette nucleare nel buffer di lisi al 1% SDS. Trasferire la sospensione in una provetta per centrifuga ad alta velocità. Ruotare la provetta a quattro gradi Celsius.Rimuovere i detriti nucleari mediante centrifugazione. La cromatografia dovrebbe apparire così. Usare una punta da pipetta P1000 per frantumare la cromatografia in frammenti e lavare due volte con tampone di lisi SDS 0,1%.Centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius con una centrifuga refrigerata. Il pellet nucleare è ora pronto per la sonica. In alternativa, congelare il pellet a meno 80 gradi Celsius.Trasferire il palato in un tubo pulito. Aggiungere il buffer di lisi contenente SDS 0,1% al palato ed eliminare tutte le bolle. Mantenere i campioni freddi durante tutta la sonicazione per evitare surriscaldamento. Diverse condizioni, come il volume del buffer, la profondità della sonda, l'intensità della sonicazione, il numero di cicli e il grado di cross-linking, possono influenzare l'efficienza della sonicazione.Effettuare la de-cross-linking inversa e un'aliquote di cromatina utilizzando proteina K e analizzare su gel agarosio. Per verificare l'efficienza della frammentazione, si raccomanda di ottimizzare in modo da ottenere l'intervallo desiderato di dimensione del DNA compreso tra 200 e 600 paia di basi. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione.La cromatina è ora pronta per essere pre-purificata con perline magnetiche. In alternativa, può essere arrestata a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene raccolta una quantità sufficiente di cromatina. Per iniziare un chip, lavare le perline tre volte con il buffer di lavaggio delle perline; questo e tutti i successivi lavaggi che coinvolgono perline proteiche magnetiche comprendono i seguenti passaggi.Aggiungere la cromatina sonicata alle perle prelavate e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius in un tubo separato. Rivestire le perle prelavate con l'anticorpo ed incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Lavare due volte le perle rivestite con l'anticorpo con il buffer di lavaggio per le perle.L'elevata complessità del substrato per la ligazione per prossimità porta inevitabilmente a un rumore non specifico sostanziale, aumentando così il costo del sequenziamento. Oltre a ridurre il livello di complessità e di rumore di fondo, abbiamo utilizzato un anticorpo monoclonale contro la RNA polimerasi due murina per identificare le interazioni della cromatina coinvolte nella regolazione della trascrizione.Questo permette lo studio di promotori attivi e delle loro regioni regolatorie corrispondenti, consentendo di comprendere la trascrizione efficiente e possibilmente cooperativa. Scartare il tampone di lavaggio dai campioni di cromatina pre-pulita combinati con le perle rivestite con anticorpo e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna, le perle vengono sottoposte a una serie di lavaggi per rimuovere la cromatina non legata, quindi le perle vengono risospese in aliquote di tampone TE. Una piccola quantità è utilizzata per analisi quantitative e verifica dell'arricchimento. L'analisi delle interazioni della cromatina mediante sequenziamento pad e tag è una tecnica sviluppata per l'analisi su larga scala *de novo* di strutture cromatiniche di ordine superiore che interagiscono.I frammenti di DNA arricchiti mediante immunoprecipitazione della cromatina vengono catturati tramite legazione per prossimità. Alla costruzione delle librerie CHI PET viene applicata la strategia pad e tag, che successivamente vengono sottoposte a sequenziamento mediante tecnologie di sequenziamento di nuova generazione ad alto rendimento. In questo video mostreremo gli aspetti sperimentali critici nella costruzione delle librerie CHI PET.La prima metà della costruzione della libreria prevede la manipolazione delle perle di proteina A o G, alle quali sono legati i frammenti di DNA, per rimuovere gli enzimi e il sale tampone. Dopo ogni reazione enzimatica, utilizzare una centrifugazione delicata e un'azione di agitazione leggera per ogni passaggio di lavaggio. Aspirare e dispensare il soprannatante più volte per massimizzare il recupero delle perle quando vengono posizionate su una particella magnetica.Concentratore per tutti i passaggi di incubazione contenenti le perle nella miscela di reazione. Preparare in anticipo la miscela maestra e aggiungere l'enzima per ultimo, dopo che le perle sono state risospese in modo omogeneo. Assicurarsi che le perle siano ben miscelate per tutta la durata dell'incubazione. Gli oligonucleotidi semilinker sono progettati con una barcodice interna costituita da quattro nucleotidi e un sito di riconoscimento per l'enzima di restrizione di tipo due MME1.Dopo la ligazione dei mezzi linker ai frammenti di DNA ancorati nei complessi cromatici C, i frammenti di DNA interagenti saranno collegati da una sequenza completa di linker. Questi mezzi linker generano sequenze con linker ab eterodimeri derivati da prodotti di ligazione non specifici, oppure sequenze con linker omodimeri, AA o BB, derivati da prodotti di ligazione specifici. Pertanto, l'uso di due mezzi linker con barcodici nucleotidici diversi permette di specificare diversi esperimenti o replicati, nonché di monitorare le frequenze di ligazione chimera non specifica tra diversi complessi chip.È importante preparare la reazione sul ghiaccio e scongelare delicatamente i mezzilinker sul ghiaccio. Combinare accuratamente i mezzilinker con acqua e successivamente con un buffer per ligasi contenente PEG. Assicurarsi che il mix master sia ben mescolato prima della risospensione.Sospendere il DNA del chip e aggiungere la DNA ligasi T4 solo dopo che i mezzo-adattatori e i frammenti di DNA del chip siano stati ben mescolati per prevenire la concatenazione dei mezzo-adattatori. Sigillare il tubo con del parafilm e incubare tutta la notte a 16 gradi Celsius con rotazione. I complessi di cromatina integri vengono quindi eluiti dalle perle aggiungendo SDS nel buffer EB per eluire il DNA, riducendo così la concentrazione di SDS con Triton X-100 per neutralizzare tutto l'SDS. La ciclizzazione dei complessi di cromatina è facilitata dalla ligazione dei due mezzo-adattatori, creando una sequenza di adattatore completa al punto di interazione. Ligatorare ed eluire i complessi di cromatina in condizioni estremamente diluite per minimizzare le legature tra diversi complessi DNA-proteina, utilizzando la DNA ligasi T4 solo dopo che i complessi di cromatina eluiti siano stati ben diluiti nella miscela di reazione. Dopo il reverse cross-linking, per rimuovere le proteine associate al DNA, purificare i frammenti di DNA circolarizzati mediante estrazione con fenolo-cloroformio, utilizzando il sistema KaiGen con gel di blocco di fase per una facile separazione.Dopo l'estrazione fenilica, utilizzare il glyco blue, un vettore per DNA, per aumentare la massa e la visibilità del palato. Gli oligonucleotidi con mezzo adattatore contengono siti di riconoscimento MM E one ai capi. MM E one, un enzima di restrizione di tipo due S, taglia a 18 e 20 paia di basi a valle dei suoi siti di legame bersaglio, generando brevi sequenze (tag) del frammento di cromatina, producendo costrutti chiamati PET tag linker tag, abbreviati in pets.Inoltre, ciascun half linker viene modificato con biotina per consentire la purificazione dei costrutti pet mediante perle magnetiche rivestite di streptavidina. Eseguire una digestione con MME one per rilasciare i costrutti del linker con tag. Purificare i pet mediante legame selettivo a perle Aden legate, quindi legare i costrutti pet con adattatori per il sequenziamento ad alto rendimento.Utilizzare una DNA polimerasi di fusione per amplificare la libreria di fusione CHI PET. La DNA polimerasi viene utilizzata per generare template con elevata accuratezza ed efficienza. Impostare la reazione PCR al freddo e aggiungere per ultimo la DNA polimerasi di fusione.Poiché l'enzima presenta un'attività esonucleasica da tre primi a cinque primi che può degradare i primer in assenza di DN Tps. Se la libreria chair pet viene costruita con successo, dovrebbe essere presente una banda intensa e ben definita di circa 223 paia di basi. Evitare bande non specifiche durante l'escissione della banda di 223 paia di basi dal gel e purificare la banda escissa utilizzando il Gel Crush Protocol.Eseguire un controllo di qualità utilizzando l'Agilent 2,100 bioanalyzer con un kit DNA 1000 prima del sequenziamento ad alto rendimento. Abbiamo appena illustrato la procedura CHI PET per il rilevamento imparziale di interazioni della cromatina a livello genomica. La qualità dei dati CHI PET dipende dall'efficacia dell'anticorpo utilizzato nella procedura chip e dalla profondità di sequenziamento.Qui utilizziamo da 18 a 20 milioni di letture per la mappatura delle interazioni. Questo protocollo specifico è stato impiegato con successo per caratterizzare le reti di interazione della cromatina legate al recettore degli estrogeni e alla RNA polimerasi nel genoma umano. Prevediamo che questo saggio rappresenti uno strumento potente per futuri studi sull'architettura tridimensionale della biologia della trascrizione nel contesto dell'intero genoma.Speriamo che questo video sia utile per voi. Grazie per averlo guardato.I.

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La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l'esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

La questione di come le autorità di regolamentazione e degli stati della cromatina cromatina influisce sul genoma in vivo è fondamentale per la nostra comprensione di come presto decisioni destino cellulare sono realizzati negli embrioni. ChIP-Seq-il metodo più popolare per studiare le caratteristiche della cromatina a livello globale è qui delineato per gli embrioni di Xenopus.

Genoma Snapshot dei regolatori della cromatina e membri<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli embrioni da Chip-Seq

Cromatina immunoprecipitazione è una tecnica potente per l'identificazione di DNA siti di Arabidopsis proteine ​​in vivo vincolante. Questa procedura include cromatina reticolazione e frammentazione, immunoprecipitazione con anticorpi selettivi contro la proteina di interesse, e l'analisi qPCR di DNA legato. Descriviamo un semplice saggio di ChIP ottimizzato per piante di Arabidopsis.

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA<em&gt; In Vivo</em

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Qui, descriviamo i metodi per eseguire ChIP-Seq e CARIP-Seq, compresa la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, per generare globale epigenomic e cromatina-associated RNA mappe in cellule ES.

CARIP-Seq e ChIP-Seq: metodi per identificare la cromatina associata RNAs e interazioni proteina-DNA in cellule staminali embrionali

L'identificazione delle interazioni fisiche tra geni ed elementi regolatori è impegnativo ma è stata facilitata dai metodi di cattura conformazione del cromosoma. Questa modifica del protocollo 4C-seq mitiga bias PCR riducendo al minimo eccessiva amplificazione dei modelli di PCR e massimizza la mappability di letture incorporando un passo di digest di aggiunta degli enzimi di limitazione.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

La determinazione precisa delle posizioni di legame proteico in tutto il genoma è importante per comprendere la regolazione genica. Qui descriviamo un metodo di mappatura genomica che tratta il DNA immunoprecipitato di cromatina con digestione dell'esonucleasi (ChIP-exo) seguito da sequenziamento ad alta produttività. Questo metodo rileva le interazioni proteina-DNA con una risoluzione di mappatura vicina alla coppia di basi e un elevato rapporto segnale-rumore nei neuroni dei mammiferi.

Mappatura ad alta risoluzione delle interazioni proteina-DNA nei neuroni derivati dalle cellule staminali del topo utilizzando l'immunoprecipitazione-esonucleasi della cromatina (ChIP-Exo)

Qui presentiamo un protocollo ATAC-seq rapido e semplice da implementare nel verme intero Caenorhabditis elegans a stadio L4 utilizzando solo 30 μL di pellet di verme.

Profilazione dell'accessibilità della cromatina in larve intere di Caenorhabditis elegans L4

Qui presentiamo un protocollo per catturare le interazioni DNA-DNA cromatina associate all'RNA per mappare l'organizzazione genomica tridimensionale correlata all'RNA.

Metodo di Interazione DNA-DNA con Cromatina Associata a RNA

Scopri la tecnica ChIA-PET per analizzare le interazioni cromatiniche a livello genomico e comprendere la regolazione trascrizionale. Questo metodo combina immunoprecipitazione della cromatina con ligatione di prossimità e sequenziamento next-generation.

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione (Video) | JoVE Journal

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

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