Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

L'analisi dell'interazione COMIN mediante sequenziamento di polvere e marcatura è un metodo per l'analisi su scala genomica delle interazioni comin a lungo raggio. In breve, definiamo questo metodo come magic share pad. Il metodo comprende numerosi passaggi di biologia molecolare e può risultare complesso.

Pertanto, in questo video dimostrativo, vi mostreremo alcuni dei passaggi chiave coinvolti nella costruzione della libreria per l'analisi ChIP-PET, compresa l'immunoprecipitazione della cromatina. L'immunoprecipitazione della cromatina, nota come ChIP, rappresenta il primo passaggio fondamentale nella costruzione di una libreria ChIP-PET. In questa fase, i campioni di cromatina ottenuti da colture cellulari vengono cross-linkati, sonificati e sottoposti a immunoprecipitazione.

Aliquote separate di DNA da chip vengono quindi ligate a mezzicollegatori con codice a barre e viene effettuata la ligazione per prossimità. I PET (tag di estremità concatenati) vengono rilasciati mediante digestione con enzimi di restrizione, purificati su microsfere magnetiche rivestite e ligati ad adattatori per il sequenziamento di nuova generazione. I PET chimera vengono identificati tramite la composizione del collegatore AB e il sequenziamento delle regioni adiacenti ai tag.

La sequenza del linker centrale viene letta e mappata sul genoma. In questo video mostreremo il protocollo chip standard utilizzato abitualmente nel nostro laboratorio su una linea cellulare tumorale della mammella, MCF7. Dai nostri dati, un arricchimento chip maggiore con anticorpi specifici produce dati chair pet migliori. Pertanto, raccomandiamo vivamente l'ottimizzazione del protocollo chip e la validazione dell'arricchimento mediante QPCR.

Prima di procedere alla costruzione della libreria di cromatina, coltivare sette linee cellulari fino a raggiungere una confluenza del circa 75% in una piastra per colture cellulari quadrata da 500 centimetri quadrati, contenente circa 20 milioni di cellule prima dell'incrocio. Rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule due volte. Fissare le cellule con EGS 1,5 millimolare appena preparato per 45 minuti su un agitatore rotante a temperatura ambiente, aggiungendo formaldeide al 37% per ottenere una concentrazione finale dell'1% e incubare per 20 minuti.

L'efficienza della crosslinking è fondamentale e varia in base alle linee cellulari e alla proteina di interesse. La concentrazione, il tempo di incubazione e la temperatura della reazione di crosslinking devono essere ottimizzati. Bloccare i crosslinker con una concentrazione finale di 200 millimoli di glicina per 10 minuti.

Scartare i cross linker spenti e lavare due volte con PBS freddo. Raccogliere le cellule raschiando il pellet delle cellule con una centrifuga da banco refrigerata. Il pellet è ora pronto per la lisi cellulare. In alternativa, congelare il pellet a meno 80 gradi Celsius. Se il pellet cellulare è congelato, scongelare sul ghiaccio prima di procedere con la lisi cellulare e risospendere il pellet in buffer di lisi contenente SDS 0,1%.

Ruotare il tubo a quattro gradi Celsius con una centrifuga refrigerata, scartare il soprannatante e ripetere la lisi cellulare. Una volta eseguita la lisi nucleare per rilasciare la cromatina legata a incrocio, prima della frammentazione della cromatina. L'assenza della membrana nucleare permette alla cromatina legata a incrocio di essere sottoposta a sonificazione in condizioni più dolci.

Reus Band palette nucleare nel buffer di lisi al 1% SDS. Trasferire la sospensione in una provetta per centrifuga ad alta velocità. Ruotare la provetta a quattro gradi Celsius.

Rimuovere i detriti nucleari mediante centrifugazione. La cromatografia dovrebbe apparire così. Usare una punta da pipetta P1000 per frantumare la cromatografia in frammenti e lavare due volte con tampone di lisi SDS 0,1%.

Centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius con una centrifuga refrigerata. Il pellet nucleare è ora pronto per la sonica. In alternativa, congelare il pellet a meno 80 gradi Celsius.

Trasferire il palato in un tubo pulito. Aggiungere il buffer di lisi contenente SDS 0,1% al palato ed eliminare tutte le bolle. Mantenere i campioni freddi durante tutta la sonicazione per evitare surriscaldamento. Diverse condizioni, come il volume del buffer, la profondità della sonda, l'intensità della sonicazione, il numero di cicli e il grado di cross-linking, possono influenzare l'efficienza della sonicazione.

Effettuare la de-cross-linking inversa e un'aliquote di cromatina utilizzando proteina K e analizzare su gel agarosio. Per verificare l'efficienza della frammentazione, si raccomanda di ottimizzare in modo da ottenere l'intervallo desiderato di dimensione del DNA compreso tra 200 e 600 paia di basi. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione.

La cromatina è ora pronta per essere pre-purificata con perline magnetiche. In alternativa, può essere arrestata a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene raccolta una quantità sufficiente di cromatina. Per iniziare un chip, lavare le perline tre volte con il buffer di lavaggio delle perline; questo e tutti i successivi lavaggi che coinvolgono perline proteiche magnetiche comprendono i seguenti passaggi.

Aggiungere la cromatina sonicata alle perle prelavate e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius in un tubo separato. Rivestire le perle prelavate con l'anticorpo ed incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Lavare due volte le perle rivestite con l'anticorpo con il buffer di lavaggio per le perle.

L'elevata complessità del substrato per la ligazione per prossimità porta inevitabilmente a un rumore non specifico sostanziale, aumentando così il costo del sequenziamento. Oltre a ridurre il livello di complessità e di rumore di fondo, abbiamo utilizzato un anticorpo monoclonale contro la RNA polimerasi due murina per identificare le interazioni della cromatina coinvolte nella regolazione della trascrizione.

Questo permette lo studio di promotori attivi e delle loro regioni regolatorie corrispondenti, consentendo di comprendere la trascrizione efficiente e possibilmente cooperativa. Scartare il tampone di lavaggio dai campioni di cromatina pre-pulita combinati con le perle rivestite con anticorpo e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna, le perle vengono sottoposte a una serie di lavaggi per rimuovere la cromatina non legata, quindi le perle vengono risospese in aliquote di tampone TE. Una piccola quantità è utilizzata per analisi quantitative e verifica dell'arricchimento. L'analisi delle interazioni della cromatina mediante sequenziamento pad e tag è una tecnica sviluppata per l'analisi su larga scala *de novo* di strutture cromatiniche di ordine superiore che interagiscono.

I frammenti di DNA arricchiti mediante immunoprecipitazione della cromatina vengono catturati tramite legazione per prossimità. Alla costruzione delle librerie CHI PET viene applicata la strategia pad e tag, che successivamente vengono sottoposte a sequenziamento mediante tecnologie di sequenziamento di nuova generazione ad alto rendimento. In questo video mostreremo gli aspetti sperimentali critici nella costruzione delle librerie CHI PET.

La prima metà della costruzione della libreria prevede la manipolazione delle perle di proteina A o G, alle quali sono legati i frammenti di DNA, per rimuovere gli enzimi e il sale tampone. Dopo ogni reazione enzimatica, utilizzare una centrifugazione delicata e un'azione di agitazione leggera per ogni passaggio di lavaggio. Aspirare e dispensare il soprannatante più volte per massimizzare il recupero delle perle quando vengono posizionate su una particella magnetica.

Concentratore per tutti i passaggi di incubazione contenenti le perle nella miscela di reazione. Preparare in anticipo la miscela maestra e aggiungere l'enzima per ultimo, dopo che le perle sono state risospese in modo omogeneo. Assicurarsi che le perle siano ben miscelate per tutta la durata dell'incubazione. Gli oligonucleotidi semilinker sono progettati con una barcodice interna costituita da quattro nucleotidi e un sito di riconoscimento per l'enzima di restrizione di tipo due MME1.

Dopo la ligazione dei mezzi linker ai frammenti di DNA ancorati nei complessi cromatici C, i frammenti di DNA interagenti saranno collegati da una sequenza completa di linker. Questi mezzi linker generano sequenze con linker ab eterodimeri derivati da prodotti di ligazione non specifici, oppure sequenze con linker omodimeri, AA o BB, derivati da prodotti di ligazione specifici. Pertanto, l'uso di due mezzi linker con barcodici nucleotidici diversi permette di specificare diversi esperimenti o replicati, nonché di monitorare le frequenze di ligazione chimera non specifica tra diversi complessi chip.

È importante preparare la reazione sul ghiaccio e scongelare delicatamente i mezzilinker sul ghiaccio. Combinare accuratamente i mezzilinker con acqua e successivamente con un buffer per ligasi contenente PEG. Assicurarsi che il mix master sia ben mescolato prima della risospensione.

Sospendere il DNA del chip e aggiungere la DNA ligasi T4 solo dopo che i mezzo-adattatori e i frammenti di DNA del chip siano stati ben mescolati per prevenire la concatenazione dei mezzo-adattatori. Sigillare il tubo con del parafilm e incubare tutta la notte a 16 gradi Celsius con rotazione. I complessi di cromatina integri vengono quindi eluiti dalle perle aggiungendo SDS nel buffer EB per eluire il DNA, riducendo così la concentrazione di SDS con Triton X-100 per neutralizzare tutto l'SDS. La ciclizzazione dei complessi di cromatina è facilitata dalla ligazione dei due mezzo-adattatori, creando una sequenza di adattatore completa al punto di interazione. Ligatorare ed eluire i complessi di cromatina in condizioni estremamente diluite per minimizzare le legature tra diversi complessi DNA-proteina, utilizzando la DNA ligasi T4 solo dopo che i complessi di cromatina eluiti siano stati ben diluiti nella miscela di reazione. Dopo il reverse cross-linking, per rimuovere le proteine associate al DNA, purificare i frammenti di DNA circolarizzati mediante estrazione con fenolo-cloroformio, utilizzando il sistema KaiGen con gel di blocco di fase per una facile separazione.

Dopo l'estrazione fenilica, utilizzare il glyco blue, un vettore per DNA, per aumentare la massa e la visibilità del palato. Gli oligonucleotidi con mezzo adattatore contengono siti di riconoscimento MM E one ai capi. MM E one, un enzima di restrizione di tipo due S, taglia a 18 e 20 paia di basi a valle dei suoi siti di legame bersaglio, generando brevi sequenze (tag) del frammento di cromatina, producendo costrutti chiamati PET tag linker tag, abbreviati in pets.

Inoltre, ciascun half linker viene modificato con biotina per consentire la purificazione dei costrutti pet mediante perle magnetiche rivestite di streptavidina. Eseguire una digestione con MME one per rilasciare i costrutti del linker con tag. Purificare i pet mediante legame selettivo a perle Aden legate, quindi legare i costrutti pet con adattatori per il sequenziamento ad alto rendimento.

Utilizzare una DNA polimerasi di fusione per amplificare la libreria di fusione CHI PET. La DNA polimerasi viene utilizzata per generare template con elevata accuratezza ed efficienza. Impostare la reazione PCR al freddo e aggiungere per ultimo la DNA polimerasi di fusione.

Poiché l'enzima presenta un'attività esonucleasica da tre primi a cinque primi che può degradare i primer in assenza di DN Tps. Se la libreria chair pet viene costruita con successo, dovrebbe essere presente una banda intensa e ben definita di circa 223 paia di basi. Evitare bande non specifiche durante l'escissione della banda di 223 paia di basi dal gel e purificare la banda escissa utilizzando il Gel Crush Protocol.

Eseguire un controllo di qualità utilizzando l'Agilent 2,100 bioanalyzer con un kit DNA 1000 prima del sequenziamento ad alto rendimento. Abbiamo appena illustrato la procedura CHI PET per il rilevamento imparziale di interazioni della cromatina a livello genomica. La qualità dei dati CHI PET dipende dall'efficacia dell'anticorpo utilizzato nella procedura chip e dalla profondità di sequenziamento.

Qui utilizziamo da 18 a 20 milioni di letture per la mappatura delle interazioni. Questo protocollo specifico è stato impiegato con successo per caratterizzare le reti di interazione della cromatina legate al recettore degli estrogeni e alla RNA polimerasi nel genoma umano. Prevediamo che questo saggio rappresenti uno strumento potente per futuri studi sull'architettura tridimensionale della biologia della trascrizione nel contesto dell'intero genoma.

Speriamo che questo video sia utile per voi. Grazie per averlo guardato.I.