Modello murino di asma indotta da allergene

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di produrre un modello murn di asma. In primo luogo, i topi vengono sensibilizzati alla volina mediante iniezione intraperitoneale come seconda fase. I topi vengono sfidati con la volina, sia per via intratracheale che per nebulizzazione.

Ciò induce una reazione allergica delle vie aeree simile a un'esacerbazione asmatica umana e può essere misurata mediante provocazione con metilcolina. Inoltre, l'infiltrazione cellulare nelle vie aeree e i livelli sierici di IgE E possono essere quantificati per valutare la gravità di queste caratteristiche tipiche dell'asma. In definitiva, i topi sviluppano manifestazioni simili all'asma, la cui gravità può essere influenzata da ulteriori manipolazioni sperimentali.

Questo modello animale può aiutare a rispondere a domande importanti nel campo dell'asma, come gli effetti del trattamento con specifici farmaci sperimentali o della modulazione di specifiche vie di segnalazione. A dimostrare questa procedura oggi saranno gli studenti laureati di Irvin e Somia nel mio laboratorio. Preparare la soluzione di sensibilizzazione emulsionando un milligrammo per millilitro di volina in PBS sterile contenente 10 milligrammi per millilitro di topi sensibilizzati con idrossido di alluminio iniettando 200 microlitri dell'inoculo di sensibilizzazione o una soluzione di controllo priva di volina intraperitoneale per questo protocollo.

Sensibilizzare i topi come descritto il giorno zero e sette. Quindi eseguire la sfida a giorni alterni, a partire dal giorno 14 al 22 per la sfida intra tracheale. Posizionare il mouse anestetizzato su una superficie inclinata.

Aggancia un filo sotto gli incisivi anteriori del topo e tieni indietro la testa. Quindi livellare la zampa per raddrizzare la trachea e fissare le zampe posteriori alla superficie di lavoro. Per fissare la posizione, immergere il collo e la zona del torace del topo con etanolo al 70% e tamponare con clorexidina per disinfettare il sito chirurgico con una pinza, mordere la pelle sulla gola e tirarla delicatamente in avanti con forbici chirurgiche sterili.

Fai una piccola incisione verticale. Caricare una siringa da un millilitro con 50 microlitri di 0,1%Volin in PBS. Inseriscilo con un ago calibro 27 e inseriscilo in una pipetta ripetitiva con una mano.

Usa una pinza sterile per esporre la trachea con l'altra mano. Tenere la pipetta parallela alla trachea. Inserire con cautela l'ago e iniettare la soluzione.

Chiudere delicatamente la ferita e sigillarla con un punto di sutura. Avendo cura di mantenere la sterilità. Posiziona il mouse su un termoforo e lascialo recuperare per la sfida mediante nebulizzazione.

Usa il metodo descritto in precedenza per sensibilizzare i topi il giorno zero e il giorno 14. Quindi sfida i topi ogni giorno dal giorno 21 al giorno 25. Per eseguire la sfida, posizionare i topi nella camera principale di un sistema di pletismografia di tutto il corpo e lasciarli acclimatare per almeno 10 minuti.

Quindi inserire un millilitro di 0,1% di albumina in PBS sterile nella tazza del nebulizzatore e nebulizzare per 30 minuti. Per eseguire misurazioni non invasive dell'iperreattività delle vie aeree, acclimatare i topi alla camera come mostrato in precedenza. Quindi registrare le letture di base per tre minuti.

Successivamente, inserire un millilitro di PBS nella tazza del nebulizzatore, nebulizzare per due minuti e monitorare le variabili respiratorie per altri sei minuti durante la fase di asciugatura dopo la nebulizzazione. Questo esempio illustra l'aumento della reattività delle vie aeree sviluppato dai topi trattati con ovoalbumina per eseguire misurazioni invasive dell'iperreattività delle vie aeree. Posizionare il topo anestetizzato sulla schiena, disinfettare il collo con etanolo e clorexidina ed esporre la trachea come descritto in precedenza in questo video.

Una volta che la trachea è visibile, usa delle forbici sterili sottili per fare una piccola incisione. Facendo attenzione a non recidere la trachea e inserire delicatamente il tubo tracheale. Legare una sutura attorno alla trachea per evitare perdite d'aria.

Posizionare il mouse sulla schiena e collegare il tubo tracheale al ventilatore. Avviare la ventilazione meccanica per un mouse da 20 grammi. Impostare la frequenza respiratoria a 150 colpi al minuto e il volume corrente a 200 microlitri di misurazioni respiratorie di base del cordone.

Quindi ripetere il test dopo la somministrazione di PBS o l'aumento delle dosi di metilcolina attraverso un nebulizzatore ad ultrasuoni. Utilizzando la misurazione invasiva, sia la resistenza delle vie aeree che l'elastina polmonare possono essere misurate come previsto. I topi trattati con Volin hanno sviluppato una maggiore resistenza ed elastina dopo la sfida.

Dopo l'eutanasia, esporre la cavità addominale del topo, quindi utilizzare le forbici per perforare con cura il diaframma mentre lo si fa. Fare attenzione a non perforare i polmoni o il cuore. Taglia via la gabbia toracica.

Quindi pungere il cuore utilizzando una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 27 e raccogliere lentamente il sangue, conservare il sangue per la separazione del siero e l'analisi degli anticorpi IgE specifici per gli ovuli. Quindi, esponi la trachea e usa le forbici curve per liberare un percorso sotto di essa. Passare la punta di una pinza curva sotto la trachea, quindi legare un pezzo di filo di sutura in un mezzo nodo sciolto attorno alla trachea in una posizione bassa nella gola.

Una volta che il filo è in posizione, praticare una piccola incisione nella trachea sopra il nodo e inserire con cura una cannula nel foro. Quindi premerlo delicatamente in avanti fino a raggiungere l'ingresso dei polmoni. Stringere e completare il nodo.

Quindi collegare una siringa da un millilitro contenente PBS alla cannula e iniettare delicatamente il fluido nei polmoni. Osservare i polmoni gonfiarsi. Fare attenzione a non riempire eccessivamente e rompere i polmoni.

Prelevare il liquido di lavaggio, ruotando delicatamente o premendo delicatamente la cannula un po' più a fondo se si incontra resistenza. Una volta raccolto il liquido, staccare la siringa, trasferire il fluido in un tubo con ghiaccio. Ripetere la procedura due volte con PBS fresco.

Dopo questa procedura, le cellule delle vie aeree possono essere isolate mediante centrifugazione come mostrato qui. Le vie aeree dei topi sensibilizzati e sfidati con la volina contengono molte più cellule totali rispetto a quelle dei topi di controllo. Utilizzando le colorazioni rapide diff, è possibile distinguere e contare eosinofili, neutrofili, macrofagi alveolari e linfociti.

Inoltre, si può osservare che i topi trattati sviluppano livelli più elevati di anticorpi IgE specifici per la volina nel siero e nel liquido di lavaggio broncoalveolare dopo il suo sviluppo. Questo modello animale ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'asma per esplorare i meccanismi alla base di questa importante malattia in un comodo modello marino.