L'infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare embrioni di pesce zebra con batteri fluorescenti per l'imaging dal vivo dell'interazione con le cellule immunitarie dell'ospite. Ciò si ottiene preparando e caricando prima l'ago per iniezione con sospensioni batteriche. Successivamente, gli embrioni vengono messi in scena e allineati su una piastra di iniezione.

Quindi l'inoculo batterico viene iniettato utilizzando una via per ottenere un'infezione batterica locale o sistemica. Infine, gli embrioni vengono montati e gli embrioni vengono sottoposti a un'immagine. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la localizzazione intracellulare di patogeni batterici all'interno dei fagociti fluorescenti dell'ospite embrionale trasparente di zebrafish attraverso la fluorescenza e la microscopia confocale.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia perché il modello di embrione di pesce zebra è molto potente per l'imaging a vita delle interazioni tra agenti patogeni dell'ospite, in generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché richiede molta pratica per microiniettare in modo riproducibile batteri nella circolazione sanguigna di embrioni di pesce zebra per l'infezione sistemica o in compartimenti specifici per ottenere infezioni locali. Dopo aver tirato gli aghi micro capillari di vetro e smussato le punte a un angolo di 45 gradi, metti in scena gli embrioni di pesce zebra a 28 ore dopo la fecondazione controllando la circolazione sanguigna costante. L'inizio della pigmentazione nell'occhio, una coda dritta e il cuore posizionato appena ventralmente rispetto all'occhio.

Una volta che gli embrioni sono stati anestetizzati, utilizzare una punta di micro caricatore per caricare l'ago con un inoculo batterico precedentemente preparato. Montare l'ago caricato su un micromanipolatore collegato a un supporto e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio. Impostare il tempo di iniezione su 0,2 secondi e la pressione di compensazione su 15 Hector Pascals.

Regolare la pressione di iniezione tra 700 e 900 Hector Pascals per ottenere il volume di iniezione corretto per l'ago utilizzato. Posizionare il micromanipolatore con l'ago carico nella posizione corretta prima dell'iniezione. Posizionare gli embrioni anestetizzati su una piastra piatta per l'iniezione di agarosio all'1% e rimuovere l'acqua d'uovo in eccesso.

Quindi, usa uno strumento ad anello per capelli per allineare gli embrioni per ogni iniezione. Muovi la piastra a mano durante le iniezioni per orientare gli embrioni con la coda rivolta verso la punta dell'ago. Posizionare la punta dell'ago direttamente sopra la vena della coccola vicino all'apertura urogenitale.

Forare il periderma con la punta dell'ago e iniettare la dose desiderata di batteri marcati con fluorescenza. Utilizziamo circa 250 unità formanti colonie o CFU di salmonella typhimurium e circa 120 CFU di mycobacterium marum. La sospensione batterica iniettata seguirà il flusso sanguigno attraverso la vena del coccodrillo verso il cardiofrequenzimetro se l'iniezione è stata eseguita correttamente, controllando l'espansione del volume del sistema vascolare subito dopo l'impulso.

Controllare frequentemente che il volume di iniezione rimanga lo stesso durante l'esperimento. Per fornire un controllo della consistenza delle iniezioni durante l'esperimento, iniettare una goccia di batteri direttamente su una goccia di PBS sterile su un terreno di crescita batterico. Dopo circa ogni 30 iniezioni di embrioni, estrarre questa goccia e contare le colonie batteriche dopo l'incubazione.

Per determinare la CFU nel volume di iniezione, utilizzare uno stereomicroscopio fluorescente per osservare le singole cellule fluorescenti della stiria che circolano nel flusso sanguigno subito dopo l'iniezione e scartare gli embrioni che non sono stati iniettati correttamente. Gli aggregati fluorescenti di batteri M marum dovrebbero essere visibili entro due giorni dall'infezione e ingrandirsi nel tempo. Per iniettare nel dotto del cuvier, allineare l'anestetismo due o tre giorni dopo la fecondazione degli embrioni.

Per quanto riguarda l'iniezione in vena a un angolo di 45 gradi dal lato dorsale dell'embrione, inserire l'ago nel punto iniziale del dotto di cuvier. Appena dorsale alla posizione in cui il dotto inizia ad allargarsi sopra il sacco vitellino per la posizione di iniezione del ventricolo posteriore. Anestetizzare gli embrioni 32 ore dopo la fecondazione con il lato dorsale rivolto verso la punta dell'ago.

Inserire l'ago nel ventricolo rombencefalico da una posizione anteriore senza toccare il neuroelio da iniettare nei muscoli della coda. Posizionare gli embrioni anestetizzati uno o due giorni dopo la fecondazione con la coda rivolta verso la punta dell'ago e con l'ago a un angolo di circa 65 gradi, iniettare nel muscolo sopra l'apertura urogenitale per l'iniezione della vescicola otica. Orientare gli embrioni anestetizzati due o tre giorni dopo la fecondazione con le code rivolte verso l'ago.

Iniettare con un angolo di 65 gradi e a bassa pressione per iniettare nel cordone del nodo impiegando uno o due giorni. Embrioni post-fecondazione con la coda rivolta lontano dall'ago. Inserire l'ago attraverso il tessuto muscolare della coda nel cordone.

Per un'iniezione di tuorlo degli embrioni in stadio da 16 a 1000 cellule, perforare l'ago attraverso il corion al centro del tuorlo per visualizzare l'infezione. Anestetizzare gli embrioni infetti in una capsula di Petri a strati all'1% ricoperta di acqua d'uovo contenente trica. Utilizzando uno strumento ad anello per capelli, gli embrioni sono stati allineati nella posizione corretta per l'imaging con uno stereomicroscopio a fluorescenza.

Si possono osservare singole cellule S fluorescenti che circolano nel flusso sanguigno subito dopo l'iniezione. Se è richiesta una posizione diversa da quella laterale view. Monta gli embrioni in metilcellulosa all'1,5% e usa uno strumento ad anello per manipolare l'embrione nella posizione richiesta per visualizzare l'infezione usando un microscopio confocale invertito.

Metti una goccia di aeros a basso punto di fusione su un piatto con fondo di vetro. Posiziona l'embrione anestetizzato nella goccia aerodinamica con una quantità limitata di acqua d'uovo e usa uno strumento ad anello per capelli per manipolare l'embrione in posizione. Lascia che l'aero si solidifichi e immergi la goccia aero in acqua d'uovo contenente trica.

Il campione è ora pronto per l'iniezione di imaging confocale di batteri salmonella typhimurium o mycobacterium marum nell'isola di sangue degli embrioni in un solo giorno. La post-fecondazione provoca la rapida fagocitosi da parte dei macrofagi, disseminata del DS relativamente grande e brillantemente fluorescente. I batteri della Stiria marcati in rosso possono essere acquisiti direttamente con la fluorescenza stereo e l'imaging confocale a due ore. La post-infezione mostra che molti batteri vengono fagocitatizzati dai macrofagi fluorescenti.

Una dose iniettabile di 250 CFU di stiria wild type indurrà una forte risposta pro-infiammatoria ed è letale entro un giorno. Al contrario, l'iniezione endovenosa di siero porta a un'infezione persistente in cui i macrofagi infetti formano aggregati stretti che sono considerati come gli stadi iniziali dei granulomi, che sono il segno distintivo della tubercolosi. L'imaging confocale di un aggregato simile a un granuloma nella linea EG transgenica di uno EGFP a cinque giorni dall'infezione mostra la crescita intracellulare di batteri M num marcati con ciliegia.

All'interno dei macrofagi fluorescenti verdi, i batteri possono essere iniettati nel ventricolo cerebrale posteriore, che è un compartimento privo di macrofagi a 32 ore dopo la fecondazione l'iniezione di 20-100 batteri M marum marcati con ciliegia in questo compartimento porta alla rapida infiltrazione da parte dei macrofagi che fagocitano i batteri come mostrato qui. Utilizzando il transgenico M-P-X-E-G-F-P, l'iniezione di circa 20 CFU di Styria nella vescicola otica porta all'attrazione dei neutrofili tre ore dopo l'infezione. Sebbene questa risposta non sia osservata nelle iniezioni di controllo della PBS, la notocorda, che sembra essere resistente all'infiltrazione da parte dei leucociti, è un compartimento permissivo per la crescita di mutanti erumistici che sono fortemente attenuati quando iniettati in altri tessuti.

Dopo l'iniezione di una dose di 2240 UFC, i batteri del siero si diffondono per diversi giorni nei tessuti embrionali e formano aggregati simili a granulomi. Simili a quelli osservati con il metodo convenzionale di iniezione endovenosa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la corretta stadiazione degli embrioni di zebrafish è fondamentale perché il sistema immunitario embrionale diventa sempre più competente durante lo sviluppo.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la profilazione del trascrittoma e l'immunoistochimica per rispondere a ulteriori domande, come il modo in cui il sistema immunitario innato embrionale risponde alle infezioni patogene.