Name: Linfezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Impara a microiniettare batteri fluorescenti in embrioni di zebrafish per visualizzare le interazioni tra patogeni e cellule immunitarie. Questo metodo consente l'imaging in vivo del sistema immunitario innato.

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Gli autori desiderano ringraziare Cui Chao, Piano de Kort, Stoop Esther e Ralph Carvalho per le immagini in Figura 4, Ulrike Nehrdich e Davy de Witt per la cura dei pesci e altri membri di laboratorio per le discussioni utili. Questo lavoro è supportato dal Programma Mix intelligente del Ministero olandese degli Affari economici e del Ministero dell&#39;Istruzione, della Cultura e della Scienza, la Commissione europea settimo progetto quadro ZF-sanitaria (salute-F4-2010-242048), il Parlamento europeo Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289.209), e dal NHMRC australiano (637.394). L&#39;australiano Istituto di Medicina Rigenerativa è supportato da sovvenzioni da parte del Governo dello Stato del Victoria e il governo australiano.

<ol><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li>
<li>Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17, 693-702 (2002).</li>
<li>vander Sar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).</li>
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<li>Le Guyader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111, 132-141 (2008).</li>
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<li>Alibaud, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mycobacterium+marinum+TesA+mutant+defective+for+major+cell+wall-associated+lipids+is+highly+attenuated+in+Dictyostelium+discoideum+and+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos.</a> Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).</li>
<li>Carvalho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).</li>
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<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).</li>
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<li>Levraud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+zebrafish+IFN+receptor%3A+implications+for+the+origin+of+the+vertebrate+IFN+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system.</a> Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).</li>
<li>Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+zebrafish+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of zebrafish innate immunity.</a> Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).</li>
<li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo%3A+unlike+macrophages%2C+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).</li>
<li>van Soest, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).</li>
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<li>Mathias, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation+by+retrograde+chemotaxis+of+neutrophils+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi di infezione descritti in questo articolo sono spesso usati per studiare la funzione dei geni dell&#39;immunità innata di accoglienza o geni di virulenza batterica 1. Le micro-iniezione per via endovenosa metodi (protocolli 5 e 6.1) vengono utilizzati più spesso per tali studi. La vena caudale presso l&#39;isola di sangue posteriore è la posizione più conveniente per iniezione endovenosa di 1-giorno-vecchi embrioni. Come la vena caudale diventa più difficile da penetrare nelle fasi successive, si preferisce il dotto di Cuvier, come sito di iniezione per via endovenosa per gli embrioni a 2-3 dpf. In tutti i casi è fondamentale per iniettare gli embrioni con un numero consistenti di batteri, che dovrebbe essere controllato da inoculi placcatura ad iniezione per il conteggio cfu. I seguenti aspetti devono essere considerati per ottenere iniezioni riproducibili. In primo luogo, è essenziale disporre di alta qualità aghi di iniezione microcapillari vetro. Se la punta dell&#39;ago è troppo grande, l&#39;iniezione creerà un foro puntura abbastanza grande per sanguinamento si verifichi ei batteri iniettati fluirà fuori della circolazione sanguigna. In secondo luogo, i batteri devono essere iniettato direttamente nella circolazione sanguigna. Se la punta dell&#39;ago non si trova all&#39;interno della vena, o se si diffonde iniezione di fluidi in pratica l&#39;estensione sacco vitellino, l&#39;embrione deve essere scartato dall&#39;esperimento. In terzo luogo, utilizzando PVP40 come supporto per l&#39;iniezione di M. marinum aiuterà a prevenire i batteri di affondare l&#39;ago di vetro. PVP40 migliorare l&#39;omogeneità della sospensione, con conseguente inoculi più riproducibile per tutta la durata di iniezioni. PVP40 possono anche essere utilizzati per S. iniezioni typhimurium, ma qui è meno importante perché la dimensione più grande e fluorescenza dei batteri permette un controllo visivo l&#39;inoculo di iniezione durante gli esperimenti. Per praticare le iniezioni si consiglia l&#39;uso del colorante rosso fenolo (1% v / v) o di 1 micron sfere fluorescenti disponibili in diversi colori (Invitrogen). Una volta che la tecnica è padroneggiata, ci vogliono circa 30 minutes per iniettare 50-100 embrioni, incluso il tempo necessario per allineare le embrioni su piastre di agarosio e regolando il volume di iniezione batterica. Mentre iniezioni endovenose nel isola sangue (protocollo 5) o nel condotto di Cuvier (protocollo 6,1) sono più comunemente utilizzati, i percorsi alternativi di infezione descritti in questo articolo video sono dimostrati utili per studiare macrofagi e neutrofili chemiotassi (protocolli 6,2, 6,3 , e 6.4), per studiare la crescita di ceppi batterici attenuati (protocollo 6.5), e ad adeguare il modello di zebrafish infezione per applicazioni ad elevato throughput (protocollo 6.6) 4-8. Le descritte micro-iniezione metodi possono essere applicati anche per le iniezioni di virus 18, 19, spore fungine 14, 20 o protozoi parassiti (Maria Forlenza, comunicazione personale). Un accessorio utile per le procedure di iniezione descritte in questo articolo il video è una procedura descritta di recente per l&#39;iniezione sottocutanea di batteri in zebrembrioni afish 21. Questa procedura è stata applicata per studiare fagocitosi dei batteri da parte di neutrofili, che sono stati trovati per batteri efficiente fuo su superfici tessuto ma, a differenza di macrofagi, sono praticamente in grado di fagocitare i batteri dopo l&#39;iniezione nel sangue o in piene di liquido cavità del corpo. Per gli embrioni iniezioni sottocutanee sono posizionati simile a quello per le iniezioni muscolari di coda descritti in questo articolo video, ma l&#39;ago viene inserito sotto la pelle per iniettare i batteri nel corso di un somite. È importante considerare che il micro-iniezione è essenzialmente un percorso artificiale di infezione. Tuttavia, gli embrioni precoci sono altamente resistenti alla esposizione esterna agli agenti patogeni batterici. In realtà, saggi immersione, in cui gli embrioni sono immerse in una sospensione batterica, non sono riproducibili nelle nostre mani 22. Mentre alcuni embrioni possono essere infettati al momento immersione, abbiamo osservato una grande variazione nei tassi di mortalità e l&#39;espressoione di geni marcatori infiammatori tra embrioni individuali in tali dosaggi. Le micro-iniezione metodi descritti in questo articolo raggiungere infezioni riproducibili e sono particolarmente utili per studiare le interazioni delle cellule batteriche con ospiti immunitarie innate. Un approccio efficace per quantificare l&#39;infezione batterica in embrioni individuali è quello di analizzare le immagini fluorescenti di embrioni infetti con misura, software dedicato quantificazione pixel 17, 23. Questo approccio è stato dimostrato che correla bene con i risultati della conta cfu dopo placcatura di embrioni infetti. Allo stesso modo, variazioni relative al numero dei leucociti embrioni sono stati quantificati mediante analisi di immagini digitali in linee transgeniche leucociti fluorofori reporter; questo approccio sarebbe applicabile a quantificare la risposta leukopoietic ospite alle infezioni 24. La funzione di geni ospitanti immune innato può essere studiata in modo efficiente in vivo combinando i modelli di infezione descrittecon knockdown morfolino. Morpholinos sono oligonucleotidi antisenso che colpiscono RNA sintetici specifici e ridurre l&#39;espressione dei prodotti genici quando iniettate in embrioni allo stadio 1-cellule zebrafish come mostrato in articoli altre video in questa rivista 10, 25. Negli studi atterramento morpholino, è di grande importanza che tutti i gruppi di embrioni da confrontare sono in scena correttamente prima di iniezioni batteriche. Questo è particolarmente importante perché embrioni avere un sistema di sviluppo immunitario che diventa sempre più competente nel tempo. Ci sono diverse linee transgeniche giornalista attualmente disponibili per distinguere le principali sottoinsiemi innata del sistema immunitario, i macrofagi e neutrofili, in embrioni di zebrafish. Il mpx e promotori LYZ sono stati utilizzati per generare linee giornalista neutrofili 16, 26, 27, e la csf1r (FMS) e MPEG1 promotori sono stati utilizzati per produrre reporter macrofago 14, 28. Mentre CSF1r (FMS) è inoltre espresso in xanthophores, mpeg1 espressione è esclusivamente in macrofagi. Come mostrato in questo articolo video, MPEG1 recentemente messo a punto le linee del reporter sono molto utili per l&#39;imaging fagocitosi batterica da parte dei macrofagi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Rosso fenolo </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H10 agar </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC Enrichment </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H9 </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC Enrichment </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidone (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-Phenylthiourea (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Ethyl 3-amminobenzoato metansolfonato sale (Tricaine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Metil cellulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque agarosio (agarosio a basso punto di fusione) </td><td> Lonza Inc. </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 um, fluorescente rosso (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 micron, giallo-verde fluorescenti (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

l&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embrioni sono sempre più utilizzati come modello per studiare la funzione del sistema immunitario innato dei vertebrati in interazioni ospite-patogeno 1. I principali tipi di cellule del sistema immunitario, macrofagi e dei neutrofili, sviluppano durante i primi giorni di embriogenesi prima della maturazione dei linfociti che sono necessari per le risposte immunitarie adattative. La facilità di ottenere un gran numero di embrioni, la loro accessibilità a causa dello sviluppo esterno, la trasparenza ottica degli stadi embrionali e larvale, una vasta gamma di strumenti genetici, le vaste risorse mutanti e collezioni di linee giornalista transgenici, tutti a creare la versatilità del pesce zebra modello. Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (S. typhimurium) e Mycobacterium marinum possono risiedere intracellulare nei macrofagi e sono spesso utilizzati per studiare le interazioni ospite-patogeno in embrioni di zebrafish. I processi di infezione di questi duepatogeni batterici sono interessanti per confrontare, perché S. typhimurium infezione è acuta e letale entro un giorno, mentre M. marinum infezione è cronica e può essere ripreso fino allo stadio larvale 2, 3. Il sito di micro-iniezione di batteri nell&#39;embrione (figura 1) determina se l&#39;infezione diventerà rapidamente sistemico o inizialmente rimane localizzata. Una infezione sistemica rapido può essere stabilita da micro-iniezione batteri direttamente nella circolazione sanguigna attraverso la vena caudale all&#39;isola sangue posteriore o attraverso il condotto di Cuvier, un canale di circolazione ampia sul sacco vitellino collega il cuore alla vascolarizzazione tronco. A 1 dpf, quando gli embrioni a questo stadio sono attivi i macrofagi phagocytically neutrofili, ma non hanno ancora maturato, iniettando nel sangue, l&#39;isola è preferito. Per le iniezioni a 2-3 dpf, anche quando gli embrioni hanno sviluppato funzionali (mieloperossidasi che produce) neutrofili, il dotto di Cuvier è preferito come tche al sito di iniezione. Per studiare la migrazione diretta di cellule mieloidi verso infezioni locali, i batteri possono essere iniettato nel muscolo coda, vescicola otica, o rombencefalo ventricolo 4-6. Inoltre, la notocorda, una struttura che sembra essere normalmente inaccessibile alle cellule mieloidi, è altamente suscettibile di infezione locale 7. Un&#39;alternativa utile per applicazioni ad elevato throughput è l&#39;iniezione di batteri nel tuorlo di embrioni entro le prime ore dopo la fecondazione 8. La combinazione di batteri fluorescenti e le linee di zebrafish transgenico con macrofagi fluorescenti o neutrofili crea le circostanze ideali per il multi-color imaging di interazioni ospite-patogeno. Questo articolo video descrivere i protocolli dettagliati per l&#39;infezione per via endovenosa e locale di embrioni di zebrafish con S. typhimurium o M. marinum batteri e per la successiva immagine di fluorescenza della interazione con le cellule del sistema immunitario.

Embrioni di zebrafish trasparente si sono dimostrati padroni di casa modello utile per la visualizzazione e lo studio delle interazioni funzionali tra cellule immunitarie innate e batteri patogeni intracellulari, come ad esempio<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Micro-iniezione di batteri e multi-colore di imaging fluorescenza sono tecniche essenziali interessate dall&#39;applicazione di modelli zebrafish infezione embrioni.

L&#39;infezione di embrioni di zebrafish con batteri patogeni intracellulari

Gli embrioni di zebrafish (Danio rerio) sono sempre più utilizzati come modello per studiare la funzione del sistema immunitario innato dei vertebrati nell'interazione ospite-patogeno...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare embrioni di pesce zebra con batteri fluorescenti per l'analisi in tempo reale dell'interazione con le cellule immunitarie dell'ospite. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando e caricando l'ago di iniezione con sospensioni batteriche. Successivamente, gli embrioni vengono stadiati e allineati su una piastra per iniezioni.Successivamente, l'inoculo batterico viene iniettato utilizzando una via che consente di ottenere un'infezione batterica locale o sistemica. Infine, gli embrioni vengono montati e sottoposti a imaging. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la localizzazione intracellulare di patogeni batterici all'interno di fagociti fluorescenti dell'ospite embrionale trasparente di zebrafish, mediante microscopia a fluorescenza e microscopia confocale.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, poiché il modello di embrione di pesce zebra si rivela molto efficace per l'analisi in vivo delle interazioni tra ospite e patogeno. In generale, chi si approccia per la prima volta a questa tecnica potrebbe incontrare difficoltà, in quanto richiede molta pratica per iniettare in modo riproducibile batteri nella circolazione sanguigna degli embrioni di pesce zebra al fine di ottenere un'infezione sistemica, oppure in compartimenti specifici per indurre infezioni localizzate. Dopo aver preparato aste capillari di vetro e affilato le punte con un angolo di 45 gradi, si procede al posizionamento degli embrioni di pesce zebra a 28 ore post-fecondazione, verificando la presenza di una circolazione sanguigna costante, l'inizio della pigmentazione oculare, una coda dritta e la posizione del cuore appena ventrale rispetto all'occhio.Dopo aver anestetizzato gli embrioni, utilizzare una punta micro loader per caricare l'ago con un inocolo batterico precedentemente preparato. Montare l'ago caricato su un micromanipolatore collegato a un supporto e posizionarlo sotto un microscopio stereoscopico. Impostare il tempo di iniezione su 0,2 secondi e la pressione di compensazione su 15 Hector Pascals.Regolare la pressione di iniezione tra 700 e 900 hPa per ottenere il volume di iniezione corretto per l'ago utilizzato. Posizionare il micromanipolatore con l'ago caricato nella posizione corretta prima dell'iniezione. Posizionare gli embrioni anestetizzati su una piastra di iniezione piatta contenente agarosio al 1% e rimuovere l'eventuale eccesso di acqua per uova.Successivamente, utilizzare uno strumento a cappio per capelli per allineare gli embrioni per ciascuna iniezione. Durante le iniezioni, spostare manualmente la piastra per orientare gli embrioni in modo che le code siano rivolte verso la punta dell'ago. Posizionare la punta dell'ago direttamente sopra la vena coddle, vicino all'apertura urogenitale.Bucare il periderma con la punta dell'ago e iniettare la dose desiderata di batteri marcati con fluorescenza. Utilizziamo circa 250 unità formanti colonie o CFU di salmonella typhimurium e circa 120 CFU di mycobacterium marum. La sospensione batterica iniettata seguirà il flusso sanguigno attraverso la vena coddle verso il monitor cardiaco, se l'iniezione è stata eseguita correttamente, verificando la presenza di un volume in espansione del sistema vascolare immediatamente dopo il battito.Verificare frequentemente che il volume di iniezione rimanga costante durante l'esperimento. Per fornire un controllo sulla coerenza delle iniezioni nell'intero esperimento, inoculare una goccia di batteri direttamente su una goccia di PBS sterile su un mezzo di crescita batterica. Dopo circa ogni 30ª iniezione di embrione, seminare questa goccia e contare le colonie batteriche dopo l'incubazione.Per determinare le UFC nel volume di iniezione, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per osservare singole cellule fluorescenti dello styria in circolo nel torrente ematico immediatamente dopo l'iniezione, scartando gli embrioni non correttamente iniettati. Aggregati fluorescenti di batteri M marum dovrebbero essere visibili entro due giorni dal contagio e aumentare di dimensione nel tempo. Per effettuare l'iniezione nel dotto di Cuvier, allineare embrioni anestetizzati di due o tre giorni post-fecondazione.Per l'iniezione nella vena coddle a un angolo di 45 gradi dal lato dorsale dell'embrione, inserire l'ago nel punto iniziale del dotto di Cuvier. Appena dorsalmente rispetto al punto in cui il dotto inizia ad allargarsi sopra il sacco vitellino, per l'iniezione nel ventricolo del romboencefalo. Anestetizzare gli embrioni a 32 ore post-fecondazione con il lato dorsale rivolto verso la punta dell'ago.Inserire l'ago nel ventricolo del cervelletto da una posizione anteriore senza toccare il neuroelio per iniettare nei muscoli della coda. Posizionare gli embrioni anestetizzati di uno o due giorni dopo la fecondazione con la coda rivolta verso la punta dell'ago e con l'ago a un angolo di circa 65 gradi, quindi iniettare nel muscolo sopra l'apertura urogenitale per le iniezioni nella vescicola otica. Orientare gli embrioni anestetizzati di due o tre giorni dopo la fecondazione con le code rivolte verso l'ago.Iniettare con un angolo di 65 gradi e a bassa pressione per iniettare nel cordone nodale utilizzando embrioni da uno a due giorni dopo la fecondazione con la coda rivolta lontano dall'ago. Inserire l'ago attraverso il tessuto muscolare della coda fino al cordone.Per un'iniezione nel tuorlo degli embrioni allo stadio da 16 a 1000 cellule, forare con l'ago la coriona fino al centro del tuorlo per visualizzare l'infezione. Anestetizzare gli embrioni infetti in una piastra di Petri stratificata al 1% con acqua per uova contenente trica. Utilizzando uno strumento a cappio di capello, allineare gli embrioni nella posizione corretta per l'analisi mediante microscopio stereoscopico a fluorescenza.È possibile osservare singole cellule fluorescenti di *M. tuberculosis* circolare nel flusso sanguigno immediatamente dopo l'iniezione. Se è richiesta una posizione diversa dalla vista laterale, montare gli embrioni in metilcellulosa al 1,5% e utilizzare uno strumento a cappio di capello per posizionare l'embrione nella posizione necessaria per acquisire l'immagine dell'infezione mediante microscopio confocale invertito.Posizionare una goccia di aeros a basso punto di fusione su una piastra di vetro con fondo in vetro. Posizionare l'embrione anestetizzato nella goccia di aeros con una quantità limitata di acqua per uova e utilizzare uno strumento a loop di capello per posizionare l'embrione. Lasciare solidificare l'aeros e immergere la goccia di aeros nell'acqua per uova contenente trica.Il campione è ora pronto per l'iniezione, mediante imaging confocale, di batteri salmonella typhimurium o mycobacterium marum nell'isola ematica di embrioni di un giorno. Dopo la fecondazione, si osserva una rapida fagocitosi da parte dei macrofagi. La disseminazione dei batteri styrian marcati con DS.Red, relativamente grandi e fortemente fluorescenti, può essere visualizzata direttamente mediante microscopia stereofluorescenza e imaging confocale dopo due ore. A seguito dell'infezione, si osserva che molti batteri vengono fagocitati dai macrofagi fluorescenti.Una dose di iniezione di 250 UFC di styria di tipo selvaggio indurrà una forte risposta pro-infiammatoria ed è letale entro un giorno. Al contrario, l'iniezione endovenosa di erum provoca un'infezione persistente in cui i macrofagi infetti formano aggregati compatti considerati le fasi iniziali dei granulomi, che rappresentano la caratteristica distintiva della tubercolosi. L'immagine confocale di un tale aggregato simile a un granuloma nella linea transgenica EG one EGFP a cinque giorni dall'infezione mostra la crescita intracellulare dei batteri M num marcati con m cherry.All'interno dei macrofagi fluorescenti verdi, i batteri possono essere iniettati nel ventricolo cerebrale posteriore, un compartimento privo di macrofagi a 32 ore dalla fecondazione; l'iniezione di 20-100 UFC di batteri M marum marcati con M cherry in questo compartimento determina un rapido reclutamento di macrofagi che fagocitano i batteri, come mostrato qui. Utilizzando il ceppo transgenico M-P-X-E-G-F-P, l'iniezione di circa 20 UFC di Styria nella vescicola otica induce l'attrazione di neutrofili a tre ore post infezione. Mentre questa risposta non viene osservata nelle iniezioni di controllo con PBS, la notocorda, che appare resistente all'infiltrazione da parte dei leucociti, rappresenta un compartimento permissivo per la crescita di mutanti erum fortemente attenuati quando iniettati in altri tessuti.Dopo l'iniezione congiunta di una dose di 2240 CFU, i batteri erum si diffondono nell'arco di diversi giorni nei tessuti embrionali e formano aggregati simili a granulomi, simili a quelli osservati con il metodo convenzionale di iniezione endovenosa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che lo stadio corretto degli embrioni di pesce zebra è fondamentale, poiché il sistema immunitario embrionale diventa progressivamente più competente durante lo sviluppo.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il profilo del trascrittoma e l'immunohistochimica per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su come il sistema immunitario innato dell'embrione risponde alle infezioni patogene.

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