A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana

Siamo Laura Manfra e Federica Selli ricercatrici dell'Istituto Superiore per la Protezione e la Ricerca Ambientale, ISRA, dipartimento di Monitoraggio della Qualità Ambientale del Laboratorio di Fitoplancton, eco Tossicologia ed Ecologia. Le nostre attività di ricerca sono finalizzate all'utilizzo di metodi biologici per la valutazione della qualità ambientale con particolare riferimento alle acque salate, alle acque salmastre e ai sedimenti. Il nostro ultimo studio riguarda lo sviluppo e la standardizzazione di un prezioso protocollo metodologico per determinare la tossicità letale a lungo termine di 14 giorni esercitata da sostanze chimiche, rifiuti industriali, acque reflue o liquami e campioni ambientali liquidi sui crostacei di acqua salata artea francescana.

Questo video descrive le prestazioni dei test di tossicità procedurali. I nostri test prevedono l'esposizione delle larve di artia a un intervallo di concentrazioni di sostanze o a un campione di prova allo scopo di determinare i livelli di concentrazione o diluizione che causerebbero la morte del 50% degli organismi esposti nell'arco di 14 giorni e che soddisfano le condizioni definite da questo metodo. Se necessario e possibile, possono essere stabiliti anche i seguenti elementi.

Il livello di concentrazione che provoca la morte del 20% degli organismi esposti il livello di concentrazione analizzato più alto che non determina un tasso di mortalità superiore a quello del controllo negativo, il livello di concentrazione più basso testato che determina dopo 14 giorni un tasso di mortalità più elevato rispetto a quello del controllo negativo. Per eseguire i test, abbiamo richiesto al nostro team larve francescane di età inferiore a 48 ore allo stadio due o tre ottenute da uova appena schiuse. È possibile utilizzare acqua salata sintetica come acqua di diluizione, preparandola sciogliendo reagenti di qualità analitica riconosciuta o una formulazione disponibile in commercio in acqua distillata o deionizzata.

Dopo una variazione di 48 ore e la filtrazione in filtri con porosità di almeno 0,45, è possibile conservare la diluizione per un massimo di 30 giorni al buio. A una temperatura di zero quattro gradi, è necessario nutrire gli organismi di prova Ella Ter microalghe, che cresce esponenzialmente con densità comprese tra 1,3 moltiplicato per 10 elevato alla potenza di sei e 2,0 moltiplicato per 10 elevato alla potenza di sei millilitri di cellule. La sostanza di riferimento in questo test è il dosel solfato di sodio.

Oltre alle consuete attrezzature di laboratorio, avrai anche bisogno dei seguenti contenitori di prova, tra cui becher di vetro silicato da 100 millimetri, palloni da 500 millimetri per preparare la soluzione standard, fiasche da sei a cento millimetri per preparare le soluzioni di prova, piastre di Petri in vetro o poli di cinque centimetri di diametro con coperchi rimovibili da utilizzare per attivare le cisti e trasferire l'artia dalla capsula di schiusa ai contenitori di prova. Pipette poster in vetro, con punte arrotondate a fiamma per il trasferimento del vetro noli in cannelly o oltre tre millilitri di pipette in plastica monouso da tagliare per il trasferimento delle micropipette artia e pipette graduate per preparare le soluzioni di test. Sei cilindri graduati da 50 millilitri per il trasferimento delle soluzioni di prova dai palloni ai contenitori di prova Per generare organismi di prova.

Mettere 20 milligrammi di cisti in una capsula di Petri contenente 12 millilitri di acqua di diluizione 48 ore prima del test. Mantenere la parabola a 25 gradi e a un'intensità luminosa di 4.000 lumen per metro quadrato per un'ora. Dopo 24 ore, trasferire le larve da cova in una nuova capsula di Petri riempita con acqua artificiale.

Eseguire il trasferimento con il microscopio utilizzando una fonte di luce in modo che le larve fototropiche in cova migrino verso il fagiolo luminoso. Utilizzare una pipetta di vetro per effettuare il trasferimento, assicurandosi di trasferire solo le larve nascenti e non le cisti stesse o le larve ancora nelle membrane. Mettere la capsula contenente le larve in una camera termostatica buia per altre 24 ore a 25 gradi.

La soluzione standard per la sostanza in esame deve essere preparata sciogliendo mezzo grammo della sostanza in un pallone da 500 millilitri. Riempirlo con acqua deionizzata o distillata e mescolare fino a completa dissoluzione. Le soluzioni devono essere preparate al momento dell'uso, a meno che non si sappia se la sostanza è stabile in soluzione.

In tal caso, è possibile preparare la soluzione standard fino a due giorni prima del test. Si deve preparare il controllo negativo in un pallone da 200 millilitri aggiungendo all'acqua di diluizione una quantità adeguata di una sospensione algale tale da ottenere una densità di 10 elevata alla potenza di cinque cellule. Le soluzioni di test da millilitri devono essere preparate in fiasche da cinque a cento millilitri aggiungendo la soluzione standard all'acqua di diluizione nella quantità specificata in modo da ottenere le concentrazioni desiderate per il test.

Per nutrire gli organismi, è necessario utilizzare quis di sospensione di microalghe duna teta, aggiungendoli quando si preparano le soluzioni di test fino a raggiungere una densità di 10 elevata alla potenza di cinque millilitri di cellule. Ma prima di iniziare, ti consigliamo di seguire questo ordine di diluizione per aggiunta, sospensione di alghe acquose, quindi soluzione standard. Introdurre quantità uguali, 50 millilitri di soluzioni di prova nei contenitori di prova utilizzando il cilindro graduato.

Effettuare tre repliche per ogni concentrazione per ogni serie di test. Preparare un contenitore di controllo con una quantità di acqua di diluizione pari al volume delle soluzioni di prova. Introdurre volumi uguali di circa 12 millilitri di soluzioni di prova nelle piastre di Petri.

Per ogni serie di test, fare una capsula di Petri di controllo. 48 ore dopo l'attivazione della cisti, solo le cisti raggiungeranno il secondo, terzo stadio larvale e sono ora utilizzabili per i test. Togli la capsula di Petri che hai usato per l'attivazione delle cisti dalla camera termostatica.

Trasferire una piccola quantità di larve nelle piastre di Petri contenenti le soluzioni di controllo e di test. In questa fase del test, è possibile eseguire il trasferimento con un tubo di vetro, la cui punta è arrotondata dalla fiamma e da una fonte di luce posizionata lateralmente che favorisce l'aggregazione dell'artia. Trasferire 10 larve dalle soluzioni di test.

Piastre di Petri ai contenitori di prova. Eseguire anche questa operazione utilizzando la pipetta passata e coprire al microscopio i becher di prova con la parafilia, lasciando uno spazio per il passaggio dell'aria, mantenendoli ad una temperatura di 25 gradi per tutta la durata del test. E ad un'illuminazione di 900 lumen per metro quadrato con quel rapporto fotocopiato di 14 ore di luce per 10 ore di buio dopo due giorni dall'inizio dei test.

E poi, dopo 5, 7, 9 e 12 giorni, osserva gli artia al microscopio e verifica il loro tasso di sopravvivenza. Sostituzione del mezzo e degli organismi dell'integratore alimentare che non mostrano un certo movimento per circa 10 secondi devono essere considerati morti durante il test, è necessario sostituire periodicamente le soluzioni di test, preparandole lo stesso giorno in cui devono essere utilizzate durante il test. È necessario sostituire periodicamente le soluzioni di test, preparandole il giorno stesso in cui devono essere utilizzate.

Componi le soluzioni di test dalla soluzione standard che hai preparato in precedenza. Eseguire il trasferimento ARTIA utilizzando EPI PET con un diametro sufficientemente ampio da non danneggiare gli organismi durante questa fase. È possibile utilizzare un tubo poster in plastica da tre millimetri da tagliare dopo 14 giorni di esposizione.

Al termine del test, conta il numero di larve sopravvissute e riporta il risultato sul tuo foglio di lavoro. Calcolare lc 50 e/o lc 20 NOEC e LOEC a 14 giorni e riportare i loro valori. I limiti di confidenza al 95% erano appropriati e i metodi di calcolo.

Se al termine del test sono state soddisfatte le seguenti condizioni, il tasso medio di mortalità dei controlli è inferiore o uguale al 20% (se si utilizzava solfato di doda cellulica di sodio). La lc 50 a 14 giorni è inclusa nell'intervallo di 8,0 milligrammi di litri. Se le condizioni del procedimento non sono state soddisfatte, tutti i dati ottenuti con lo stesso lotto di organismi devono essere considerati non validi e i test ripetuti.