Metodi per test Drosophila Comportamento

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare metodi per esaminare i comportamenti motori, sensoriali e di coordinazione di Drosophila. Questo viene raggiunto valutando innanzitutto la funzione motoria delle larve mediante il test di strisciamento, analizzando la funzione motoria degli adulti attraverso il test dell'anello e valutando le capacità di coordinazione e sensoriali degli adulti con il test del corteggiamento. In definitiva, questo insieme di test comportamentali può mostrare come fattori genetici ed esterni, come trattamenti farmacologici, possano influenzare l'attività e la coordinazione.

All'interno di sophala. Il principale vantaggio di questo saggio rispetto ai metodi esistenti, come l'asse geo negativo, è che il saggio ad anello consente un throughput maggiore ed è più sensibile. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle malattie neurodegenerative, come la rilevazione in fase precoce di difetti locomotori.

A dimostrare questo saggio sarà la dottoressa Jamie Becknell, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio. Il saggio di strisciamento larvale viene utilizzato per misurare l'effetto di fattori genetici e ambientali sulla motilità; per iniziare, effettuare un incrocio di 10-15 maschi e 10-15 femmine vergini in una bottiglia standard. Dopo 24 ore, gli adulti sani avranno deposto abbastanza uova da popolare la bottiglia, mantenendo la popolazione sincronizzata in un intervallo di 24 ore.

Rimuovere gli adulti e trasferirli in un nuovo flacone, quindi ripetere il processo. Incubare ora il flacone fino a quando si osservano larve di terzo stadio nel mezzo di coltura del flacone. Aggiungere da 50 a 100 millilitri di saccarosio al 20% e lasciare in posa per 20 minuti.

Le larve risaliranno in superficie; raccoglierle utilizzando una pipetta sierologica da 25 millilitri con la punta tagliata e trasferirle in un cestello a maglie. Lavare le larve nel cestello a maglie due volte con acqua deionizzata. A questo punto possono essere utilizzate per gli esperimenti.

Per trattare le larve con un farmaco, utilizzare un pennello per trasferire il numero desiderato di larve in un becher da cinque millilitri contenente una soluzione di saccarosio al 5% e il farmaco di interesse. Lasciarle nutrire della soluzione zuccherina drogata per 15 minuti, quindi versarle nuovamente attraverso il cestello a maglie fini, risciacquarle e procedere con la misurazione dell'effetto del farmaco sulla motilità. Utilizzare un pennello per trasferire una singola larva in una piastra di Petri da 15 centimetri contenente 2%aros.

Posizionare su un foglio di carta millimetrata. Ora raccogliere i dati. Contare semplicemente il numero di linee della griglia che la lava attraversa in un minuto.

Successivamente, utilizzare il pennello per trasferire la lava in una pozzetta di una piastra di vetro per dissezione contenente una soluzione diluita di pasta di lievito, sotto un microscopio stereoscopico, per un periodo di un minuto, contando le contrazioni di Percy. Una singola contrazione corrisponde a un movimento completo da posteriore ad anteriore. Ripetere fino a quando non si è raggiunto il numero desiderato di larve contate.

Il protocollo ad anello misura la velocità locomotoria di animali adulti. Raccogliere moscerini maschi adulti appena emersi sotto anestesia leggera e trasferirli in una provetta standard contenente cibo normale o drogato. Mettere circa 25 moscerini per provetta. Mantenere i moscerini a temperatura ambiente per due o tre giorni per consentire un completo recupero dall'anestesia e l'accumulo di livelli stazionari del farmaco.

Trasferire quindi circa 25 moscerini senza anestesia in provette di polistirene con tappi modellati e assemblare le provette in uno o più apparati ad anello. Lasciare riposare i moscerini per 15-20 minuti, nel frattempo posizionare una fotocamera digitale per scattare foto delle provette in vista laterale, tenere un timer a portata di mano e impostarlo sulla durata desiderata del saggio. Tipicamente tre secondi per eseguire il saggio.

Tenere l'apparato ad anello in una mano senza disturbare le mosche e tenere l'interruttore della fotocamera nell'altra mano con precisione. Picchiettare l'apparato sul banco tre volte per far cadere le mosche e contemporaneamente avviare il timer di conteggio alla rovescia della fotocamera. Ripetere il test una volta al minuto fino a quando non sono stati effettuati cinque o sei tentativi.

È fondamentale non riutilizzare le provette di polistirene per i test dopo aver raccolto i primi set di dati. Poiché le nuove mosche collocate in provette usate non saliranno allo stesso modo rispetto a quelle collocate in provette nuove. Per raccogliere i dati, utilizzando un visualizzatore di immagini, valutare l'altezza media raggiunta dalla risalita dei diversi gruppi.

Questo saggio richiede incroci genetici preparati in bottiglie che producono abbondante progenie, necessaria per raccogliere le mosche per il saggio. Entro un paio di ore dall'alba soggettiva dell'animale, svuotare le bottiglie per raccogliere tutti gli adulti a intervalli di tre o quattro ore. Raccogliere maschi e femmine appena emersi e sessualmente naïve; mantenere i maschi singolarmente in provette o tubi con cibo, e le femmine in gruppi di cinque o sei.

In contenitori analoghi, sono necessari numeri uguali di maschi e femmine per il saggio. Dopo aver isolato le mosche raccolte per cinque giorni, prepararsi a caricarle su una ruota di accoppiamento ed eseguire il saggio. Successivamente, trasferire con attenzione una femmina e un maschio nella camera della ruota di accoppiamento sotto un microscopio stereoscopico.

Osservare la coppia per 10 minuti o fino a quando si accoppiano con successo entro tale periodo. Registrare il momento in cui ciascuno dei diversi comportamenti viene osservato per la prima volta. Registrare il momento in cui il maschio si gira per la prima volta verso la femmina.

Quando il maschio tocca per la prima volta la femmina con la zampa, registrare il momento in cui il maschio estende e vibra un'ala; registrare quando il maschio lecca per la prima volta le genitali della femmina; registrare quando il maschio arrotola per la prima volta l'addome sotto di sé. Registrare quando il maschio tenta per la prima volta di montare la femmina. Infine, registrare il tempo totale dedicato al comportamento di corteggiamento fino al verificarsi dell'accoppiamento.

Per animali di tipo selvatico, ciò avviene quasi sempre entro cinque-dieci minuti; raccogliere i dati mediante tre parametri diversi. In primo luogo, la latenza di un comportamento corrisponde al tempo necessario prima che esso venga osservato per la prima volta. In secondo luogo, la frequenza di un comportamento indica se esso viene o meno osservato.

E in terzo luogo, l'indice di corteggiamento è il tempo trascorso in corteggiamento diviso per il tempo totale fino alla copulazione in un esperimento con animali. Portatori di mutazioni nel gene F-U-S-T-L-S associate alla sclerosi laterale amiotrofica. I mutanti genetici con un'inserzione centrale mostravano metà dell'abilità di strisciamento rispetto ai controlli di tipo selvaggio a sinistra, e una mutazione missenso R 5 21 C riduceva la velocità di strisciamento a soli circa un centimetro al minuto.

Il test dell'anello su giovani moscerini adulti di tipo selvatico ha prodotto un'altezza media percorsa compresa tra tre e cinque centimetri in un periodo di tre secondi. In questo saggio, nessuna desensibilizzazione è stata osservata durante fino a cinque prove consecutive distanziate di un minuto mentre si eseguiva il test dell'anello. È importante ricordare di essere il più preciso possibile per quanto riguarda i tempi.

Una volta padroneggiato, il saggio di affollamento larvale può essere eseguito in 30-40 minuti per osservare 10 prove per un genotipo, se effettuato correttamente. Dopo aver visto questo video, dovreste avere anche una buona comprensione di come osservare e valutare i comportamenti di corteggiamento nella mosca.