Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare le distinte sottopopolazioni di cellule specializzate che si differenziano nei biofilm dell'organismo modello, Bacillus subtilis. Questo risultato si ottiene innanzitutto inserendo dei reporter trascrizionali nel cromosoma di B. subtilis. Questi reporter verranno espressi esclusivamente nella sottopopolazione di cellule in studio.

Il passaggio successivo consiste nel favorire lo sviluppo di un biofilm coltivando B. subtiles nel mezzo induttore di biofilm, Ms GG gg. Dopo la formazione del biofilm, le cellule provenienti dal biofilm vengono disperse e fissate con paraformaldeide. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel rilevare il segnale di fluorescenza emesso dalle singole cellule della comunità microbica mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso.

In definitiva, i risultati mostrano come le cellule specializzate nella produzione e nella secrezione della matrice extracellulare che costituisce il biofilm rappresentino una sottopopolazione diversa rispetto alle cellule che secernono il surfattante, la molecola segnale responsabile della differenziazione della sottopopolazione di produttori della matrice. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la quantificazione dell'espressione trascrizionale mediante saggi di vitalità o analisi con micromatrici, è che consente di monitorare l'espressione genica a livello di singola cellula e di visualizzare popolazioni cellulari particolarmente piccole specializzate nell'esprimere un gene specifico.

Queste espressioni geniche non verranno rilevate durante l'analisi dell'intera popolazione. I plasmidi integrativi vengono utilizzati per etichettare B. subtiles e qui viene mostrato un esempio. PTAA, il promotore dei geni responsabili della produzione di tass.

Una proteina matriciale viene clonata nel vettore utilizzando i siti di restrizione ECO R uno e Hindi tre. L'espressione del gene reporter CFP è ora sotto il controllo di ptap A. Per iniziare la procedura di marcatura di B, linearizzare il plasmide integrativo mediante digestione enzimatica. L'enzima di restrizione raccomandato è XH oh uno. Quando il plasmide integrativo è pronto, indurre la competenza naturale nel ceppo B subtiles 1 68 coltivando le cellule in mezzo induttore di competenza per cinque ore a 37 gradi Celsius.

Aggiungere il plasmide linearizzato alla coltura di cellule competenti di B. subtiles e incubare per due ore a 37 gradi Celsius; trascorse due ore, piastrare le cellule su agar con spettinomicina e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius. Il cromosoma di B. subtiles presenta due loci neutri, AmyE e LAC A, che possono essere utilizzati per integrare fusioni reporter senza influenzare lo sviluppo del biofilm. Il plasmide PKM008 linearizzato si integra nel genoma di B. subtiles mediante doppia ricombinazione.

Il passaggio successivo consiste nel trasferire il reporter dal ceppo marcato a un ceppo in grado di formare biofilm, utilizzando il protocollo di trasduzione con fago SPP1. Ai fini di questo video, vengono mostrati soltanto i passaggi importanti del protocollo. Coltivare il ceppo donatore 1 68, che ospita la fusione con il reporter, in mezzo TY a 37 gradi Celsius fino a quando la coltura raggiunge la fase stazionaria iniziale, aggiungendo 200 microlitri di cellule a 100 microlitri di soluzione diluita di fago in un tubo di vetro.

E lasciamo in incubazione a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, pipettare l'agar TY caldo nel tubo e mescolare accuratamente mediante vortex. Distribuire delicatamente su una piastra TY fresca e incubare a 37 gradi Celsius per otto-sedici ore per permettere la formazione di aloni fagici.

Per raccogliere gli aloni fagici, aggiungere tre millilitri di mezzo TY alla piastra e utilizzare la pipetta di vetro per rompere l'agar sopra. Trasferire la sospensione di agar in un tubo falcon da 15 millilitri. Vortexare delicatamente per rompere l'agar e quindi centrifugare a 1000 G per 15 minuti.

Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Far passare il soprannatante attraverso un filtro da siringa da 22 micron. Utilizzare questo soprannatante per infettare una coltura del ceppo ricevente coltivato in mezzo TY.

Aggiungere 30 microlitri di sopranatante a 10 millilitri di coltura diluita uno a 10 e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, centrifugare a 5.000 giri al minuto per sette minuti, risospendere il pellet in 200 microlitri di mezzo TY e seminare su una piastra contenente spectinomicina più 10 millimolari di citrato di sodio.

Incubare a 37 gradi Celsius per 12-36 ore. Selezionare una colonia e coltivarla per tutta la notte in LB liquido a 37 gradi Celsius. Infine, depositare tre microlitri della coltura notturna su un mezzo solido induttore di biofilm.

Lasciare crescere le cellule per 72 ore a 30 gradi Celsius. Dopo tre giorni di crescita, i biofilm formati sulla superficie dell'agar Ms.GG svilupperanno un'architettura morfologica complessa sulla superficie dell'agar. Per iniziare questa procedura, utilizzare uno stecchino o delle pinzette per rimuovere il biofilm dalla superficie dell'agar MSGG.

La consistenza del biofilm dovrebbe permettere di staccarlo dalla superficie dell'agar. Prelevare il biofilm in un unico pezzo e posizionarlo in tre millilitri di tampone PBS, quindi disperdere il biofilm delicatamente. Eseguire 12 impulsi con un'uscita di tre e un'ampiezza di 0,7 secondi per fissare i campioni prima dell'analisi singola cellulare.

Risospendere 300 microlitri della sospensione cellulare in un millilitro di soluzione al 4% di paraformaldeide e incubare a temperatura ambiente esattamente per sette minuti. Al termine della fissazione di sette minuti, lavare le cellule tre volte con tampone PBS. Infine, risospendere le cellule in 300 microlitri di tampone PBS prima della microscopia a fluorescenza.

Preparare un vetrino microscopico pipettando 200 microlitri di agarosio allo 0,8% sul vetrino e coprendolo con attenzione con un altro vetrino. Dopo due minuti, rimuovere delicatamente il vetrino superiore per ottenere uno strato di agarosio aderente al vetrino nella posizione inferiore. Aggiungere 2 microlitri di cellule fissate sulla superficie dello strato di agarosio e coprire con un coprioggetto per microscopio.

Posizionare il campione sul piatto del microscopio a fluorescenza. Impostare il periodo di eccitazione in base a un controllo negativo che non mostra fluorescenza nelle condizioni selezionate per l'esperimento. L'esposizione deve essere compresa tra 50 e 200 millisecondi.

Acquisire un'immagine a fluorescenza e un'immagine in campo chiaro per ogni campo visivo. Per preparare le cellule per l'analisi mediante citometria a flusso, disperdere il campione di cellule fissate mediante sonica leggera. Eseguire due serie di 12 impulsi con un'uscita di cinque e un'ampiezza di 0,7 secondi per disperdere gli aggregati in cellule singole senza causare la lisi cellulare.

Verificare l'efficienza della dispersione cellulare mediante microscopia ottica. Successivamente, diluire il campione di uno a 100 in tampone PBS. Per questa analisi, verrà utilizzato un citometro a flusso BD FACS Canto II per la fluorescenza di YFP.

Si utilizza un'eccitazione laser a 488 nanometri abbinata a un filtro 5 30 30 per la fluorescenza di CFP. Si utilizza un'eccitazione laser a 405 nanometri abbinata a un filtro 4 0 8 40 e si calibra il citofluorimetro con due controlli negativi. Un campione di tampone PBS senza cellule in sospensione deve fungere da controllo negativo per la dimensione della particella rilevata dal citofluorimetro.

Un campione senza un marcatore fluorescente deve fungere da controllo negativo per la sensibilità fluorescente del flusso. Dopo la calibrazione, posizionare il campione marcato con un marcatore fluorescente nel citometro a flusso per ogni campione ed analizzare almeno 50.000 eventi con una velocità di flusso compresa tra 303.000 eventi al secondo. Quando B. subtilis cresce su una piastra contenente il mezzo induttore di biofilm, la formazione di biofilm MSGG viene osservata dopo tre giorni di incubazione a 30 gradi Celsius.

Il biofilm mostra un'architettura morfologica complessa che indica le distinte sottopopolazioni cellulari partecipanti. Ad esempio, la produzione della matrice extracellulare e dei biofilm porta alla formazione di pieghe sulla superficie della colonia. Questa figura mostra un esempio di visualizzazione della differenziazione cellulare in un ceppo marcato singolo mediante microscopia a fluorescenza.

Questo ceppo contiene il reporter fluorescente Ptap, una CFP espressa nella sottopopolazione di cellule produttrici di matrice, colorata in blu. Questa sottopopolazione produce e secerne la matrice extracellulare che costituisce il biofilm. Questa immagine successiva è il risultato della visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza di un ceppo doppio marcato che contiene il reporter Ptap, una CFP, e il reporter aggiuntivo P Surfactin YFP.

Questo secondo reporter consente il monitoraggio della sottopopolazione di cellule responsabili della secrezione della molecola segnale surfactina, che attiva la cascata di segnalazione per la differenziazione dei produttori di matrice. Qui, i produttori di matrice sono colorati artificialmente in blu, mentre i produttori di surfattante sono colorati artificialmente in giallo, risultati ottenuti mediante citometria a flusso 2D utilizzando un ceppo singolo marcato contenente il reporter ptap. Viene presentato qui un YFB.

Il ceppo di controllo non trattato, privo di geni per proteine fluorescenti, ha mostrato una singola popolazione con cellule a bassa fluorescenza relativa che ospitavano ptap. Una YFP in condizioni non induttive per il biofilm non ha differenziato la sottopopolazione di produttori di matrice, e l'intera popolazione ha mostrato anch'essa una bassa fluorescenza relativa. Al contrario, in condizioni induttive per il biofilm, è stata rilevata una sottopopolazione di cellule con elevata fluorescenza relativa, visibile come una spalla a destra della popolazione a bassa fluorescenza relativa.

I risultati di picco ottenuti dalla citometria a flusso 3D sono mostrati qui. I segnali di fluorescenza dei canali monitorati sono riportati sull'asse X per YFP e sull'asse Y per CFP; il pannello in alto a sinistra mostra una ceppa priva di geni per proteine fluorescenti, utilizzata come controllo per la fluorescenza di fondo. Nel pannello superiore destro, è stata utilizzata una ceppa singolarmente marcata per rilevare la sottopopolazione di produttori di surfattina nel canale di fluorescenza YFP evidenziato in giallo.

Nel riquadro in basso a sinistra, è stato utilizzato un diverso ceppo singolo marcato per rilevare la sottopopolazione di produttori di matrice. Nel canale di fluorescenza CFP delimitato in blu, le sottopopolazioni di produttori di matrice e di produttori di surfattante sono monitorate mediante il ceppo doppio marcato e vengono presentati i risultati. In questo riquadro in basso a destra.

Vengono rilevate due sottopopolazioni di cellule che esprimono alti livelli dei reporter fluorescenti. Ogni popolazione è delimitata per mostrare l'assenza di sovrapposizione nell'espressione dei reporter tra le due sottopopolazioni di cellule specializzate. Questa figura finale mostra la quantificazione delle sottopopolazioni di produttori di matrice e cannibali mediante citometria a flusso 3D.

Nel riquadro in alto a destra, un ceppo marcato singolo è stato utilizzato per rilevare la sottopopolazione di cannibali. Nel canale di fluorescenza YFP delimitato in giallo, è stato descritto che questa sottopopolazione di cannibali si differenzia in modo coordinato con la sottopopolazione di produttori di matrice. Nel riquadro in basso a sinistra, la sottopopolazione di produttori di matrice è rilevata in un altro ceppo marcato singolo nel canale di fluorescenza CFP.

Delimitati in blu, i risultati della doppia marcatura nel pannello in basso a destra hanno mostrato una singola sottopopolazione di cellule fluorescenti che esprimono sia YFP che CFP, delimitati in verde. L'espressione simultanea dei due reporter indica che entrambi i percorsi di differenziazione cellulare sono attivati in modo coordinato nella stessa sottopopolazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare e quantificare le distinte sottopopolazioni cellulari che costituiscono un biofilm microbico mediante l'analisi cellulare della popolazione, come la microscopia fluorescente o la citometria a flusso.