Name: Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Scopri l'analisi a singola cella nei biofilm di Bacillus subtilis utilizzando microscopia a fluorescenza e citometria a flusso. Questo metodo consente di visualizzare e quantificare le sottopopolazioni cellulari specializzate.

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Questo lavoro è finanziato dal programma Young Investigator Research, dal Centro di ricerca sulle malattie infettive (ZINF) presso l&#39;Università di Würzburg. Juan Garcia-C Betancur è un collega dottorato di ricerca presso la Graduate School of Life Sciences (GSLS) dell&#39;Università di Würzburg.

1. Etichettatura B. subtilis e formazione di analisi Biofilm <ol><li> Amplificazione PCR dalla regione del promotore del gene di interesse. Si mostra come esempio la clonazione di P tapa, il promotore dei geni responsabili per la produzione di proteina Tasa matrice 26. Clone P tapa in pkm008 vettore (creato dal laboratorio di Rudner, Harvard Medical School. Boston, USA) (Fig. 2). </li><li> Linearizzare i plasmidi per digestione enzimatica (Enzyme consigliato, XhoI). </li><li> Indurre la competenza naturale in B. subtilis ceppo 168 seguendo il one-step protocollo precedentemente descritto da Harwood e Taglio 27. </li><li> Aggiungere i plasmidi linearizzate nella cultura di cellule competenti e selezionate per la resistenza spectinomicina dopo due ore di incubazione. </li><li> I ceppi ottenuti hanno inserito il costrutto nel locus amyE neutro di B. subtilis di ricombinazione doppia (Fig. 4). Per creareun ceppo a doppia etichetta, integrare il secondo reporter nel Laca locus neutro utilizzando il plasmide pDR183 vi presentiamo nella figura 3. Inserire questo reporter utilizzando la stessa tecnica sopra descritta per l&#39;inserimento di reporter clonato in pKM008. </li><li> Trasferire la reporter del ceppo 168 di NCIB3610 che è in grado di formare biofilm. Utilizzare il protocollo di trasduzione del fago SPP1 28,29. Crescere ceppo donatore in TY medio (LB +10 mm MgSO 4 +10 pM MnSO 4). Mescolare 200 microlitri della cultura con 100 microlitri di diluizione magazzino fago. Aggiungere 3 ml di agar morbido dopo 30 minuti di incubazione e permettono aloni fago sorgere a 37 ° C. </li><li> Raccogliere l&#39;agar molle. Centrifugare e passare il surnatante pensato che una siringa da 0,22 micron filtro. Utilizzare questo surnatante per infettare una cultura del ceppo ricevente coltivate in terreno TY. Aggiungere 30 microlitri a 10 ml di 1:10 coltura diluita. Incubare per 30 minuti e selezionare per la resistenza antibiotica dopo 24 h di incubazione. </li><li> Sezionare una colonia e crescere durante la notte il LB a 37 ° C. </li><li> Spot 3 pl della cultura durante la notte su una solida biofilm che induce medie MSgg 1,5% agar 30. Permettere alle cellule di crescere durante 72 ore a 30 ° C (Figura 3). Dopo tre giorni di crescita, biofilm formate sulla superficie di agar MSgg sviluppato un&#39;architettura complessa morfologica nella superficie del agar. </li></ol> 2. Biofilm Dispersione e fissazione cellulare <ol><li> Rimuovere il modulo di biofilm sulla superficie del agar MSgg con uno stuzzicadenti o una pinzetta. La consistenza del biofilm dovrebbe consentire di staccatelo dalla superficie di agar in un unico pezzo. </li><li> Posizionare il biofilm in 3 ml di tampone PBS e disperdere il biofilm da ripetitivo passaggio attraverso una pipetta o un ago. In alternativa, la dispersione biofilm può essere fatto utilizzando sonicazione lieve. Sonicazione Mild richiede 12 impulsi con una potenza di 3 e ampiezza di 0,7 secondi. </li><li> Fissare i campioni prima cella singola analisi. Resuspend 300 microlitri della sospensione di cellule in 1 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% ed incubare a temperatura ambiente per sette minuti. Composizione della soluzione di paraformaldeide al 4%: 2 g di paraformaldeide 50 ml di tampone PBS 4 microlitri 10 N NaOH Filtrare la soluzione attraverso un filtro a 0,22 um e aliquota </li><li> Lavare le cellule dopo fissazione in tampone PBS tre volte e risospendere in 300 ul di tampone PBS. </li></ol> 3. Microscopia a fluorescenza <ol><li> Versare 200 microlitri di 0.8% agarosio su un vetrino da microscopio e con attenzione coprire con un&#39;altra diapositiva. Rimuovere la slitta superiore dolcemente dopo 2 minuti per ottenere uno strato di agarosio attaccato alla slitta del fondo. </li><li> Spot 2 microlitri di cellule fissate sulla superficie dello strato di agarosio e coprire con un vetro di copertura microscopio. </li><li> Porre il campione nel microscopio a fluorescenza. Usiamo un microscopio a fluorescenza Leica DMI6000B dotato di un CRT6000 Leica iIluminatione sistema. I filtri per YFP sono Ex: BP500/20, Em: BP535/30 e per CFP sono Ex: BP426/20, Em: 480/40 </li><li> Esporre il campione un fluorescenza eccitazione tra 50-200 ms. Impostare il periodo di eccitazione in base a un controllo negativo che non mostra fluorescenza nelle condizioni selezionate per l&#39;esperimento. </li><li> Vedere l&#39;immagine di fluorescenza alla stessa immagine ottenuta con campo chiaro. Unire le due immagini in un&#39;unica immagine. I risultati ottenuti dal flusso microscopia a fluorescenza utilizzando un unico ceppo marcato ospitante il reporter sono rappresentati P tapa-YFP in figura 6. </li></ol> 4. La quantificazione delle singole cellule in citometria a flusso <ol><li> Disperdere il campione di cellule fissate con sonicazione mite. Sonicare il campione eseguendo 2 serie di impulsi 12 con una potenza di 5 e ampiezza di 0,7 secondi, per disperdere aggregati nelle cellule singole senza causare la lisi cellulare. Verificare l&#39;efficienza di dispersione cellulare mediante microscopia ottica. </li&gt; <li> Diluire il campione 1:100 in tampone PBS prima dell&#39;analisi in citometria a flusso. Usiamo un citometro a flusso BD FACS Canto II. Per YFP fluorescenza, utilizzare un laser di eccitazione a 488 nm accoppiato con un 530/30 del filtro. Per CFP fluorescenza, utilizzare l&#39;eccitazione laser a 405 nm accoppiato con un 408/40 filtro. </li><li> Calibrare la macchina citometro a flusso con due controlli negativi. Un campione di tampone PBS privo di cellule in sospensione dovrebbe servire come controllo negativo per la dimensione delle particelle rilevata dal citometro a flusso. Un campione marcato con nessun reporter fluorescenza deve essere servire come controllo negativo per la sensibilità fluorescenza del citometro a flusso. </li><li> Collocare il campione etichettato con il reporter fluorescente nel citometro a flusso. Per ciascun campione, analizzare almeno 50.000 eventi con una portata tra 300 e 3000 eventi al secondo. </li><li> Acquisizione dati utilizzando FACS Diva software (BD Biosciences) e analizzare utilizzando FlowJo 8.5.2 del software. Vedere segnali di fluorescenza al controllo che mostranos no fluorescenza. </li><li> Presentare i dati del monitoraggio del segnale di fluorescenza di un singolo ceppo marcato in uno dei due assi grafica. Tracciare il segnale di fluorescenza rilevato l&#39;asse X e il numero di cellule che esprimono i diversi livelli di fluorescenza sull&#39;asse Y. I risultati ottenuti dall&#39;analisi citometria a flusso utilizzando un unico ceppo marcato ospitante il reporter sono rappresentati P tapa-YFP in figura 8. </li><li> Presentare i dati del monitoraggio del segnale di fluorescenza di un ceppo doppio etichettati in tre assi grafica. Tracciare il segnale di fluorescenza di ciascuno dei canali monitorati in assi X e Y (per esempio, GFP potrebbe essere misurato l&#39;asse X e PCP nel asse Y). Plot in asse Z il numero di cellule che esprimono ciascuna reporter e presentano come isolines contorno che sarebbero perpendicolare al piano del foglio (Fig. 9 e 10). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Quando B. subtilis cresce su un piatto della biofilm che induce MSgg mezzo, la formazione di biofilm si osserva dopo tre giorni di incubazione a 30 ° C 30. Il biofilm mostra consistenza forte e può essere staccata dalla superficie di agar in un unico pezzo. Inoltre, il biofilm mostra un&#39;architettura complessa morfologica che è indicativo delle sottopopolazioni di cellule aderenti distinti (Fig. 5). Ad esempio, la produzione della matrice extracellulare in biofilm risultato la formazione di rughe sulla superficie della colonia. Questa funzione può essere correlata con la differenziazione della sottopopolazione di produttori matrice 19. Analogamente, l&#39;aumento di strutture aeree sulla superficie del biofilm è indicativa della presenza di una sottopopolazione di cellule sporulanti, poiché le spore localizzato nella zona apicale di queste strutture 30. Esempi di visualizzazione del differenziamento cellulare in un unico marcato e un ceppo doppio marcato utilizzando microscopia a fluorescenza sono represented in figura 6 e 7, rispettivamente. L&#39;unico ceppo marcato ospita la reporter fluorescente P tapa-CFP, che si esprime nella sottopopolazione di cellule produttrici di matrice. Questa sottopopolazione è responsabile di produrre e secernere la matrice extracellulare che costituisce il biofilm (Fig. 6). Il ceppo doppio etichettato ospita il giornalista P tapa CFP-26 e il giornalista ulteriori P srfAA YFP-31. Questo secondo reporter permette di monitorare la sottopopolazione di cellule responsabili di secernere la surfattina molecola di segnalazione, che innesca la cascata di segnalazione per la differenziazione dei produttori matrice (Fig. 7). Sottopopolazione dei produttori di matrice sono false colorati in blu, mentre la sottopopolazione di produttori surfattina è falso colorata in giallo. Analisi di citometria a flusso utilizzando un unico ceppo marcato ospitare il reporter P tapa-YFP è presentato in figura 8. Ceppo di controllo non trattato non ospitarei geni delle proteine ​​fluorescenti ha mostrato una singola fluorescenza popolazione relativamente basso. Cellule che ospitano P tapa-YFP non in biofilm che inducono condizioni di non differenziare la sottopopolazione di matrice produttori e l&#39;intera popolazione ha mostrato un basso fluorescenza relativa. In biofilm che inducono condizione, una sottopopolazione di cellule con alta fluorescenza relativa è verificato, osservato come una spalla destra del picco relativa bassa fluorescenza 23. I risultati ottenuti dall&#39;analisi citometria a flusso utilizzando un ceppo doppio marcato sono rappresentati in figura 9 e 10. Figura 9 monitorato le sottopopolazioni di matrice produttori e dei produttori surfattina utilizzando il doppio etichettato strain P tapa-PCP, P srfAA-YFP. Poiché il controllo di fluorescenza di fondo è stato utilizzato un ceppo non nutrire alcun geni delle proteine ​​fluorescenti. Successivamente, abbiamo rilevato di ciascuna delle sottopopolazioni di produttori della matrice e produttori surfattina in ogni canale di fluorescenza, utilizzando unico ceppo marcato<html> s come controlli. Il doppio etichettato strain P tapa-PCP, P srfAA-YFP ha mostrato due sottopopolazioni di cellule che esprimono alti livelli di i giornalisti fluorescenti. Ogni popolazione è incorniciato, dimostrando che non vi è alcuna sovrapposizione nella espressione dei giornalisti tra le due sottopopolazioni di cellule specializzate 15. Analogamente, l&#39;analisi mediante citometria a flusso doppio marcato ceppo P SKF-YFP, P-tapa YFP è presentato in figura 10. Il reporter per la SKF gene controlla la differenziazione della sottopopolazione di cannibali 32, che è stato descritto per differenziare coordinatamente con la sottopopolazione di produttori di matrice 24. In questo caso, il ceppo doppio marcato mostrato un&#39;unica sottopopolazione di cellule fluorescenti che esprimono sia YFP e PCP. Ciò indica che entrambe le vie della differenziazione delle cellule vengono attivate in modo coordinato sottopopolazione stessa. 1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema generale della Experiment. Il protocollo è diviso in tre fasi principali. La prima fase prevede l&#39;etichettatura il ceppo di B. subtilis con la fusione giornalista che controlla la sottopopolazione di interesse. In secondo luogo, crescere i ceppi identificati in biofilm che inducono condizioni. In terzo luogo, disperdere il biofilm ed effettuare singola cella di analisi della popolazione con microscopio a fluorescenza e citometria a flusso. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica del vettore pKM008 integrazione. Questo vettore integra la fusione giornalista di interesse nel amyE locus neutro dalla ricombinazione doppio. Il promotore di interesse (P tapa) viene clonato nel vettore utilizzando siti di restrizione EcoRI e HindIII. Quindi, l&#39;espressione del gene PCP è sotto il controllo del promotore P tapa. L&#39;Orientationione dei geni nel plasmide è rappresentato come una freccia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentazione schematica del vettore di integrazione pDR183. Questo vettore integra la fusione giornalista di interesse nel locus neutro Laca mediante ricombinazione doppio. La fusione di interesse (P tapa - PCP) è clonato nel vettore utilizzando la restrizione siti EcoRI e BamHI. L&#39;orientamento dei geni del plasmide è rappresentato come una freccia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig4.jpg" /> Figura 4. Schema di integrazione dei reporter nel cromosoma di B. subtilis di ricombinazione doppia. (A) B. cromosoma subtilis ha due loci neutrali, amyE e Laca, per integrare fusioni reporter senza compromettere lo sviluppo del biofilm. (B) B. subtilis di ricombinazione doppia. La fusione giornalista integra nel locus neutro in modo stabile. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig5.jpg" /> Figura 5. Formazione di biofilm di B. subtilis NCIB3610. processo di formazione bioflm del ceppo B. subtilis NCIB 3610 quando cresce il biofilm che induce MSgg medium nel corso di tre giorni a 30 ° C. Immagini sequenziali di sviluppo del biofilm sono stati prelevati ogni 12 ore. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig6.jpg" /> Figura 6. Visualizzazione della sottopopolazione di produttori matrice al microscopio a fluorescenza. Un campione di un biofilm di B. subtilis P tapa - cfp è stato fissato ed esaminato al microscopio a fluorescenza. 200 ms di fluorescenzaeccitazione evidenziato una sottopopolazione di cellule che emettono fluorescenza superiore rispetto al resto delle cellule. Abbiamo considerato questa sottopopolazione come la sottopopolazione di cellule produttrici di matrice. Barra della scala è di 3 micron. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig7.jpg" /> Figura 7. Visualizzazione della sottopopolazione di matrice produttori e produttori surfattina sotto il microscopio a fluorescenza. Campione da un biofilm della B. subtilis P tapa-cfp, P srfAA-YFP ceppo doppio marcato è stato fissato ed esaminato al microscopio a fluorescenza. Tempo di esposizione di 250 ms evidenziato due sottopopolazioni di cellule che emettono fluorescenza superiore rispetto al resto delle cellule. Una sottopopolazione espresso YFP ed è stato rilevato utilizzando esclusivamente il canale YFP (false colorata in giallo). Questa è la sottopopolazione di produttori di surfattina. Un&#39;altra sottopopolazione espresso CFP ed è stato rilevato utilizzando esclusivamente la Chann PCP<html> el. Questa è la sottopopolazione di produttori matrice. Barra della scala è di 3 micron. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig8.jpg" /> Figura 8. Quantificazione della sottopopolazione di produttori matrice 2-D usando citometria di flusso. Dispersed cellule di un biofilm di B. subtilis P tapa-YFP sono stati monitorati in citometria a flusso. Il citometro a flusso contato 50.000 eventi e il segnale di fluorescenza per ogni evento è stato monitorato. Numero di cellule contate è tracciata in asse Y, mentre l&#39;intensità del segnale YFP viene tracciata sull&#39;asse X. Le cellule sono state coltivate in terreno LB per ottenere non biofilm condizioni che inducono. Le cellule sono state coltivate in mezzo MSgg per ottenere biofilm che inducono condizioni. La sottopopolazione dei produttori matrice differenzia solo nel biofilm che inducono condizioni. Questo dato è stato adattato da López et al., PNAS (2009) 106 :280-285. s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9. Quantificazione della sottopopolazione di produttori matrice e dei produttori surfattina utilizzando 3-D citometria a flusso. Segnale di fluorescenza dei canali monitorati sono presentati nell&#39;asse X (per YFP) e l&#39;asse Y (per PCP). L&#39;asse Z misura il numero di cellule che esprimono ciascuna reporter e viene quantificata come isolines contorno perpendicolari al piano della carta. Il numero di eventi monitorati in questo esperimento era 50.000 eventi. Sinistra pannello superiore presenta un controllo di fluorescenza di fondo non ospitare geni delle proteine ​​fluorescenti. Diritto pannello superiore rileva la sottopopolazione di produttori surfattina in fluorescenza YFP canale (incorniciata in giallo) utilizzando un unico marcato ceppo P srfAA-YFP. Pannello in basso a sinistra rileva la sottopopolazione di produttori di matrice politica comune della pesca nel canale di fluorescenza (incorniciato in blu) utilizzando un unico ceppo marcato P tapa-CFP. Il doppio etichettato strain tapa P &lt;/ Em&gt;-PCP, P srfAA-YFP è monitorata nel pannello in basso a destra. Ha dimostrato due sottopopolazioni che sono incorniciate in giallo e blu. Questo dato è stato adattato da López et al., Geni e lo sviluppo (2009) 23 :1631-1638. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig10.jpg" /> Figura 10. Quantificazione della sottopopolazione di produttori matrice e cannibali utilizzando 3-D citometria a flusso. Segnale di fluorescenza dei canali monitorati sono presentati nell&#39;asse X (per YFP) e l&#39;asse Y (per PCP). Il numero di eventi monitorati in questo esperimento era 50,000. Diritto pannello superiore rileva la sottopopolazione di cannibali in fluorescenza YFP canale (incorniciata in giallo) in un unico marcato ceppo P SKF-YFP. Pannello in basso a sinistra rileva la sottopopolazione di produttori di matrice politica comune della pesca nel canale di fluorescenza (incorniciato in blu) in un unico ceppo marcato P tapa-CFP. Il double marcato ceppo P tapa-PCP, P SKF-YFP ha mostrato solo una sottopopolazione di cellule in diagonale per gli assi X e Y (incorniciato in verde). Questa sottopopolazione viene rilevato nel canale YFP e CFP, perché esprime i due reporter contemporaneamente. López et al. Geni e sviluppo (2009) 23 :1631-1638.

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il fatto che le comunità batteriche mostrano sottopopolazioni di cellule che esprimono set specifico di geni evidenzia la complessità delle comunità microbiche 33,34. Questo protocollo dovrebbe aiutare a determinare se l&#39;espressione di un gene di interesse viene limitata a un particolare sottopopolazione di cellule specializzate nella comunità microbica. Visualizzazione di tali sottopopolazioni richiede lo sviluppo di nuove tecniche, perché i metodi tradizionali per monitorare l&#39;espressione genica o a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Tecnica </td><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg composizione </td><td> fosfato di potassio 5mM </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> 100 mM MOPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio 2 mM </td><td> Roth </td><td> 2.189,1 </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio 700μM </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> 50 micron cloruro ferrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> Cloruro di zinco 1 pm </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Tiamina 2μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> Glicerolo 0,5% </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Glutacompagno di 0,5% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Triptofano 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Fenilalanina 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> Cella di fissaggio </td><td> Paraformaldeide </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Sonicazione </td><td> Cella Sonicator </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> Microscopia a fluorescenza </td><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Nome del software </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Microscopia a fluorescenza </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Citometria a flusso </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Citometria a flusso </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

singola cella analisi bacillus subtilis i biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Formazione di biofilm è un attributo per quasi tutti i batteri 1-6. Quando batteri formano biofilm, le cellule sono racchiusi nella matrice extracellulare che è prevalentemente costituito da proteine ​​e esopolisaccaridi, tra gli altri fattori 7-10. La comunità microbica racchiuso all&#39;interno del biofilm spesso mostra la differenziazione della distinta sottopopolazione di cellule specializzate 11-17. Queste sottopopolazioni coesistono e spesso mostrano organizzazione spaziale e temporale all&#39;interno del biofilm 18-21. Formazione di biofilm nel modello Bacillus subtilis richiede la differenziazione delle sottopopolazioni di cellule specializzate distinte. Tra questi, la sottopopolazione di produttori matrice, responsabili di produrre e secernere la matrice extracellulare del biofilm è essenziale per la formazione di biofilm 11,19. Pertanto, la differenziazione dei produttori matrice è una caratteristica della formazione di biofilm in B. subtilis. Abbiamo usato giornalisti fluorescenti per visualizzare e quantificare la sottopopolazione di produttori matrice in biofilm di B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, abbiamo osservato che la sottopopolazione di produttori matrice differenzia in risposta alla presenza di autoprodotto segnale extracellulare surfattina 25. È interessante notare, surfattina è prodotto da una sottopopolazione di cellule specializzate diverse dalla sottopopolazione di produttori matrice 15. Abbiamo riportato in questa relazione l&#39;approccio tecnico necessario per visualizzare e quantificare la sottopopolazione dei produttori e dei produttori matrice surfattina nei biofilm di B. subtilis. Per fare questo, reporter fluorescenti di geni necessari per la produzione di matrice e di produzione di surfattina sono inseriti nel cromosoma di B. subtilis. Reporter sono espressi solo in una sottopopolazione di cellule specializzate. Quindi, le sottopopolazioni possono esseremonitorata utilizzando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso (Fig. 1). Il fatto che diverse sottopopolazioni di cellule specializzate coesistono all&#39;interno delle comunità multicellulari di batteri ci dà una prospettiva diversa sulla regolazione dell&#39;espressione genica nei procarioti. Questo protocollo affronta questo fenomeno sperimentalmente e può essere facilmente adattato a qualsiasi modello di altre lavorazioni, per chiarire i meccanismi molecolari alla base eterogeneità fenotipica all&#39;interno di una comunità microbica.

Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l&#39;uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi subpopulationswithin<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilm mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso.

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

La formazione di biofilm è una caratteristica comune a quasi tutti i batteri 1-6. Quando i batteri formano biofilm, le cellule sono racchiuse in una matrice extracellulare composta principalmente da...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare le distinte sottopopolazioni di cellule specializzate che si differenziano nei biofilm dell'organismo modello, Bacillus subtilis. Questo risultato si ottiene innanzitutto inserendo dei reporter trascrizionali nel cromosoma di B. subtilis. Questi reporter verranno espressi esclusivamente nella sottopopolazione di cellule in studio.Il passaggio successivo consiste nel favorire lo sviluppo di un biofilm coltivando B. subtiles nel mezzo induttore di biofilm, Ms GG gg. Dopo la formazione del biofilm, le cellule provenienti dal biofilm vengono disperse e fissate con paraformaldeide. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel rilevare il segnale di fluorescenza emesso dalle singole cellule della comunità microbica mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso.In definitiva, i risultati mostrano come le cellule specializzate nella produzione e nella secrezione della matrice extracellulare che costituisce il biofilm rappresentino una sottopopolazione diversa rispetto alle cellule che secernono il surfattante, la molecola segnale responsabile della differenziazione della sottopopolazione di produttori della matrice. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la quantificazione dell'espressione trascrizionale mediante saggi di vitalità o analisi con micromatrici, è che consente di monitorare l'espressione genica a livello di singola cellula e di visualizzare popolazioni cellulari particolarmente piccole specializzate nell'esprimere un gene specifico.Queste espressioni geniche non verranno rilevate durante l'analisi dell'intera popolazione. I plasmidi integrativi vengono utilizzati per etichettare B. subtiles e qui viene mostrato un esempio. PTAA, il promotore dei geni responsabili della produzione di tass.Una proteina matriciale viene clonata nel vettore utilizzando i siti di restrizione ECO R uno e Hindi tre. L'espressione del gene reporter CFP è ora sotto il controllo di ptap A. Per iniziare la procedura di marcatura di B, linearizzare il plasmide integrativo mediante digestione enzimatica. L'enzima di restrizione raccomandato è XH oh uno. Quando il plasmide integrativo è pronto, indurre la competenza naturale nel ceppo B subtiles 1 68 coltivando le cellule in mezzo induttore di competenza per cinque ore a 37 gradi Celsius.Aggiungere il plasmide linearizzato alla coltura di cellule competenti di B. subtiles e incubare per due ore a 37 gradi Celsius; trascorse due ore, piastrare le cellule su agar con spettinomicina e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius. Il cromosoma di B. subtiles presenta due loci neutri, AmyE e LAC A, che possono essere utilizzati per integrare fusioni reporter senza influenzare lo sviluppo del biofilm. Il plasmide PKM008 linearizzato si integra nel genoma di B. subtiles mediante doppia ricombinazione.Il passaggio successivo consiste nel trasferire il reporter dal ceppo marcato a un ceppo in grado di formare biofilm, utilizzando il protocollo di trasduzione con fago SPP1. Ai fini di questo video, vengono mostrati soltanto i passaggi importanti del protocollo. Coltivare il ceppo donatore 1 68, che ospita la fusione con il reporter, in mezzo TY a 37 gradi Celsius fino a quando la coltura raggiunge la fase stazionaria iniziale, aggiungendo 200 microlitri di cellule a 100 microlitri di soluzione diluita di fago in un tubo di vetro.E lasciamo in incubazione a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, pipettare l'agar TY caldo nel tubo e mescolare accuratamente mediante vortex. Distribuire delicatamente su una piastra TY fresca e incubare a 37 gradi Celsius per otto-sedici ore per permettere la formazione di aloni fagici.Per raccogliere gli aloni fagici, aggiungere tre millilitri di mezzo TY alla piastra e utilizzare la pipetta di vetro per rompere l'agar sopra. Trasferire la sospensione di agar in un tubo falcon da 15 millilitri. Vortexare delicatamente per rompere l'agar e quindi centrifugare a 1000 G per 15 minuti.Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Far passare il soprannatante attraverso un filtro da siringa da 22 micron. Utilizzare questo soprannatante per infettare una coltura del ceppo ricevente coltivato in mezzo TY.Aggiungere 30 microlitri di sopranatante a 10 millilitri di coltura diluita uno a 10 e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, centrifugare a 5.000 giri al minuto per sette minuti, risospendere il pellet in 200 microlitri di mezzo TY e seminare su una piastra contenente spectinomicina più 10 millimolari di citrato di sodio.Incubare a 37 gradi Celsius per 12-36 ore. Selezionare una colonia e coltivarla per tutta la notte in LB liquido a 37 gradi Celsius. Infine, depositare tre microlitri della coltura notturna su un mezzo solido induttore di biofilm.Lasciare crescere le cellule per 72 ore a 30 gradi Celsius. Dopo tre giorni di crescita, i biofilm formati sulla superficie dell'agar Ms.GG svilupperanno un'architettura morfologica complessa sulla superficie dell'agar. Per iniziare questa procedura, utilizzare uno stecchino o delle pinzette per rimuovere il biofilm dalla superficie dell'agar MSGG.La consistenza del biofilm dovrebbe permettere di staccarlo dalla superficie dell'agar. Prelevare il biofilm in un unico pezzo e posizionarlo in tre millilitri di tampone PBS, quindi disperdere il biofilm delicatamente. Eseguire 12 impulsi con un'uscita di tre e un'ampiezza di 0,7 secondi per fissare i campioni prima dell'analisi singola cellulare.Risospendere 300 microlitri della sospensione cellulare in un millilitro di soluzione al 4% di paraformaldeide e incubare a temperatura ambiente esattamente per sette minuti. Al termine della fissazione di sette minuti, lavare le cellule tre volte con tampone PBS. Infine, risospendere le cellule in 300 microlitri di tampone PBS prima della microscopia a fluorescenza.Preparare un vetrino microscopico pipettando 200 microlitri di agarosio allo 0,8% sul vetrino e coprendolo con attenzione con un altro vetrino. Dopo due minuti, rimuovere delicatamente il vetrino superiore per ottenere uno strato di agarosio aderente al vetrino nella posizione inferiore. Aggiungere 2 microlitri di cellule fissate sulla superficie dello strato di agarosio e coprire con un coprioggetto per microscopio.Posizionare il campione sul piatto del microscopio a fluorescenza. Impostare il periodo di eccitazione in base a un controllo negativo che non mostra fluorescenza nelle condizioni selezionate per l'esperimento. L'esposizione deve essere compresa tra 50 e 200 millisecondi.Acquisire un'immagine a fluorescenza e un'immagine in campo chiaro per ogni campo visivo. Per preparare le cellule per l'analisi mediante citometria a flusso, disperdere il campione di cellule fissate mediante sonica leggera. Eseguire due serie di 12 impulsi con un'uscita di cinque e un'ampiezza di 0,7 secondi per disperdere gli aggregati in cellule singole senza causare la lisi cellulare.Verificare l'efficienza della dispersione cellulare mediante microscopia ottica. Successivamente, diluire il campione di uno a 100 in tampone PBS. Per questa analisi, verrà utilizzato un citometro a flusso BD FACS Canto II per la fluorescenza di YFP.Si utilizza un'eccitazione laser a 488 nanometri abbinata a un filtro 5 30 30 per la fluorescenza di CFP. Si utilizza un'eccitazione laser a 405 nanometri abbinata a un filtro 4 0 8 40 e si calibra il citofluorimetro con due controlli negativi. Un campione di tampone PBS senza cellule in sospensione deve fungere da controllo negativo per la dimensione della particella rilevata dal citofluorimetro.Un campione senza un marcatore fluorescente deve fungere da controllo negativo per la sensibilità fluorescente del flusso. Dopo la calibrazione, posizionare il campione marcato con un marcatore fluorescente nel citometro a flusso per ogni campione ed analizzare almeno 50.000 eventi con una velocità di flusso compresa tra 303.000 eventi al secondo. Quando B. subtilis cresce su una piastra contenente il mezzo induttore di biofilm, la formazione di biofilm MSGG viene osservata dopo tre giorni di incubazione a 30 gradi Celsius.Il biofilm mostra un'architettura morfologica complessa che indica le distinte sottopopolazioni cellulari partecipanti. Ad esempio, la produzione della matrice extracellulare e dei biofilm porta alla formazione di pieghe sulla superficie della colonia. Questa figura mostra un esempio di visualizzazione della differenziazione cellulare in un ceppo marcato singolo mediante microscopia a fluorescenza.Questo ceppo contiene il reporter fluorescente Ptap, una CFP espressa nella sottopopolazione di cellule produttrici di matrice, colorata in blu. Questa sottopopolazione produce e secerne la matrice extracellulare che costituisce il biofilm. Questa immagine successiva è il risultato della visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza di un ceppo doppio marcato che contiene il reporter Ptap, una CFP, e il reporter aggiuntivo P Surfactin YFP.Questo secondo reporter consente il monitoraggio della sottopopolazione di cellule responsabili della secrezione della molecola segnale surfactina, che attiva la cascata di segnalazione per la differenziazione dei produttori di matrice. Qui, i produttori di matrice sono colorati artificialmente in blu, mentre i produttori di surfattante sono colorati artificialmente in giallo, risultati ottenuti mediante citometria a flusso 2D utilizzando un ceppo singolo marcato contenente il reporter ptap. Viene presentato qui un YFB.Il ceppo di controllo non trattato, privo di geni per proteine fluorescenti, ha mostrato una singola popolazione con cellule a bassa fluorescenza relativa che ospitavano ptap. Una YFP in condizioni non induttive per il biofilm non ha differenziato la sottopopolazione di produttori di matrice, e l'intera popolazione ha mostrato anch'essa una bassa fluorescenza relativa. Al contrario, in condizioni induttive per il biofilm, è stata rilevata una sottopopolazione di cellule con elevata fluorescenza relativa, visibile come una spalla a destra della popolazione a bassa fluorescenza relativa.I risultati di picco ottenuti dalla citometria a flusso 3D sono mostrati qui. I segnali di fluorescenza dei canali monitorati sono riportati sull'asse X per YFP e sull'asse Y per CFP; il pannello in alto a sinistra mostra una ceppa priva di geni per proteine fluorescenti, utilizzata come controllo per la fluorescenza di fondo. Nel pannello superiore destro, è stata utilizzata una ceppa singolarmente marcata per rilevare la sottopopolazione di produttori di surfattina nel canale di fluorescenza YFP evidenziato in giallo.Nel riquadro in basso a sinistra, è stato utilizzato un diverso ceppo singolo marcato per rilevare la sottopopolazione di produttori di matrice. Nel canale di fluorescenza CFP delimitato in blu, le sottopopolazioni di produttori di matrice e di produttori di surfattante sono monitorate mediante il ceppo doppio marcato e vengono presentati i risultati. In questo riquadro in basso a destra.Vengono rilevate due sottopopolazioni di cellule che esprimono alti livelli dei reporter fluorescenti. Ogni popolazione è delimitata per mostrare l'assenza di sovrapposizione nell'espressione dei reporter tra le due sottopopolazioni di cellule specializzate. Questa figura finale mostra la quantificazione delle sottopopolazioni di produttori di matrice e cannibali mediante citometria a flusso 3D.Nel riquadro in alto a destra, un ceppo marcato singolo &egrave; stato utilizzato per rilevare la sottopopolazione di cannibali. Nel canale di fluorescenza YFP delimitato in giallo, &egrave; stato descritto che questa sottopopolazione di cannibali si differenzia in modo coordinato con la sottopopolazione di produttori di matrice. Nel riquadro in basso a sinistra, la sottopopolazione di produttori di matrice &egrave; rilevata in un altro ceppo marcato singolo nel canale di fluorescenza CFP.Delimitati in blu, i risultati della doppia marcatura nel pannello in basso a destra hanno mostrato una singola sottopopolazione di cellule fluorescenti che esprimono sia YFP che CFP, delimitati in verde. L'espressione simultanea dei due reporter indica che entrambi i percorsi di differenziazione cellulare sono attivati in modo coordinato nella stessa sottopopolazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare e quantificare le distinte sottopopolazioni cellulari che costituiscono un biofilm microbico mediante l'analisi cellulare della popolazione, come la microscopia fluorescente o la citometria a flusso.

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