Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e quantificare le distinte sottopopolazioni di cellule specializzate che si differenziano nei biofilm dell'organismo modello, bacillus subtles. Ciò si ottiene inserendo prima i reporter trascrizionali nel cromosoma dei sottili B. Questi reporter saranno espressi esclusivamente nella sottopopolazione di cellule oggetto di studio.

Il passo successivo è quello di promuovere lo sviluppo di un biofilm facendo crescere sottili B sottili nel mezzo che induce il biofilm, Ms GG gg. Dopo la formazione del biofilm, le cellule del biofilm vengono disperse e fissate con para formaldeide. La fase finale della procedura consiste nel rilevare il segnale di fluorescenza emesso dalle singole cellule della comunità microbica utilizzando la fluorescenza, la microscopia e la citometria a flusso.

In definitiva, i risultati mostrano come le cellule si siano specializzate per produrre e secernere. Le matrici extracellulari che costituiscono il biofilm sono una sottopopolazione diversa dalle cellule che secernono il tensioattivo, la molecola di segnalazione responsabile del differenziamento della sottopopolazione dei produttori di matrice. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la quantificazione dell'espressione trascrizionale utilizzando i saggi Vita Ities di analisi a raggi microraggi, è che ci permette di monitorare l'espressione genica a livello di singola cellula e visualizzare popolazioni cellulari particolarmente piccole di cellule specializzate per esprimere un gene specifico.

Queste espressioni geniche non saranno rilevate durante l'analisi della popolazione complessiva. I plasmidi integrativi sono utilizzati per etichettare i sottili B e un esempio è mostrato qui. PTAA, il promotore dei geni responsabili della produzione di tass.

Una proteina della matrice viene clonata nel vettore utilizzando i siti di restrizione ECO R one e Hindi three. L'espressione del gene reporter CFP è ora sotto il controllo di ptap A per iniziare la procedura di marcatura B, linearizzare sottilmente il plasmide integrativo mediante digestione enzimatica. L'enzima di restrizione raccomandato è XH oh uno quando il plasmide integrativo è pronto, indurre la competenza naturale nel ceppo B più sottile 1 68 facendo crescere le cellule nel mezzo di induzione della competenza per cinque ore a 37 gradi Celsius.

Aggiungere il plasmide linearizzato alla coltura di cellule B più sottili e incubare per due ore a 37 gradi Celsius dopo due ore, placcare le cellule su agar con micina spect e incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Il cromosoma B sottile ha due loci neutri, Amy, E, E e LAC A, che possono essere utilizzati per integrare le fusioni reporter senza influenzare lo sviluppo del biofilm. Il plasmide linearizzato PKM 0 0 8 si integra nel genoma dei sottili B mediante doppia ricombinazione.

Il passo successivo consiste nel trasferire il reporter dal ceppo marcato a un ceppo in grado di formare biofilm utilizzando il protocollo di trasduzione dei fagi SPP one. Ai fini di questo video, vengono mostrati solo i passaggi importanti del protocollo. Coltivare il ceppo donatore 1 68, ospitando la fusione reporter in terreno TY a 37 gradi Celsius fino a quando la coltura raggiunge la fase stazionaria precoce a 200 microlitri di cellule per 100 microlitri di stock fagico diluito in una provetta di vetro.

E fermiamoci a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, pipettare l'agar TY soft caldo nella provetta e mescolare accuratamente a vortici. Stendere delicatamente su una piastra TY fresca e incubare a 37 gradi Celsius per otto-16 ore per consentire la formazione di aloni fagici.

Per raccogliere gli aloni fagici, aggiungere tre millilitri di terreno TY alla piastra e utilizzare la pipetta di vetro per rompere l'agar superiore. Trasferire la sospensione di agar in una provetta di falco da 15 millilitri. Agitare delicatamente per rompere l'agar e poi centrifugare a 1000 G per 15 minuti.

Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Passare il surnatante attraverso un filtro per siringa puntiforme da 22 micron. Usa questo surnatante per infettare una coltura del ceppo ricevente coltivato in terreno TY.

Aggiungere 30 microlitri di surnatante a 10 millilitri di coltura diluiti da uno a 10 e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo di che centrifugare a 5.000 RPM per sette minuti, sospendere nuovamente il pellet in 200 microlitri di terreno TY e stenderlo su una piastra contenente SPECT micina più 10 millimolari. Citrato di sodio.

Incubare a 37 gradi Celsius per 12-36 ore. Seleziona una colonia e coltivala durante la notte in LB liquido a 37 gradi Celsius. Infine, individuare tre microlitri di coltura notturna su terreno solido che induce il biofilm.

Lascia che le cellule crescano per 72 ore a 30 gradi Celsius. Dopo tre giorni di crescita, i biofilm formati sulla superficie dell'agar Ms.GG svilupperanno un'architettura morfologica complessa sulla superficie dell'agar. Per iniziare questa procedura, utilizzare uno stuzzicadenti o una pinzetta per rimuovere il biofilm dalla superficie dell'agar MSGG.

La consistenza del biofilm deve consentire di staccarlo dalla superficie dell'agar. In un unico pezzo, posizionare il biofilm in tre millilitri di tampone PBS, disperdere il biofilm con delicatezza. Eseguire 12 impulsi con un'uscita di tre e un'ampiezza di 0,7 secondi per fissare i campioni prima dell'analisi di una singola cellula.

Sospendere 300 microlitri di sospensione cellulare in un millilitro, una soluzione di aldeide paraforme al 4%, e incubare a temperatura ambiente per esattamente sette minuti. Dopo la fissazione di sette minuti, lavare le cellule nel tampone PBS tre volte. Infine, risospendere le cellule in 300 microlitri di tampone PBS prima della microscopia a fluorescenza.

Preparare un vetrino da microscopio pipettando 200 microlitri di agro allo 0,8% sul vetrino e coprendolo accuratamente con un altro vetrino. Dopo due minuti, rimuovere delicatamente il vetrino superiore per ottenere uno strato di agro attaccato al vetrino sul punto inferiore. Due microlitri di cellule fissate sulla superficie dello strato di agros e coprirlo con un vetro di copertura per microscopio.

Posizionare il campione sul tavolino del microscopio a fluorescenza. Impostare il periodo di eccitazione in base a un controllo negativo che non mostri fluorescenza nelle condizioni selezionate per l'esperimento. L'esposizione dovrebbe essere compresa tra 50 e 200 millisecondi.

Acquisisci un'immagine a fluorescenza e un'immagine a campo chiaro per ogni campo visivo. Per preparare le cellule per l'analisi della citometria a flusso, disperdere il campione di cellule fissate mediante sonicazione blanda. Eseguire due serie di 12 impulsi con un'uscita di cinque e un'ampiezza di 0,7 secondi per disperdere i grumi in singole cellule senza causare lisi cellulare.

Confermare l'efficienza della dispersione cellulare mediante microscopia ottica. Quindi, diluire il campione da uno a 100 in tampone PBS. Per questa analisi per la fluorescenza YFP verrà utilizzato un citometro a flusso BD fax canto two.

Per la fluorescenza CFP viene utilizzata un'eccitazione laser a 488 nanometri accoppiata con un filtro 5 30 30. Viene utilizzata un'eccitazione laser a 405 nanometri accoppiata con un filtro 4 0 8 40, calibrare il citometro a flusso con due controlli negativi. Un campione di tampone PBS senza cellule in sospensione dovrebbe fungere da controllo negativo per la dimensione della particella rilevata dal citometro a flusso.

Un campione senza un reporter fluorescente dovrebbe fungere da controllo negativo per la sensibilità fluorescente del flusso. Citometro dopo la calibrazione, posizionare il campione etichettato con un reporter fluorescente nel citometro a flusso per ogni campione, analizzare almeno 50.000 eventi con una velocità di flusso compresa tra 303.000 eventi al secondo. Quando B Subtles cresce su una piastra del mezzo che induce il biofilm, si osserva la formazione di biofilm MSGG dopo tre giorni di incubazione a 30 gradi Celsius.

Il biofilm mostra un'architettura morfologica complessa che è indicativa delle distinte sottopopolazioni cellulari partecipanti. Ad esempio, la produzione della matrice extracellulare e dei biofilm provoca la formazione di rughe sulla superficie della colonia. Questa figura mostra un esempio di visualizzazione della differenziazione cellulare in un singolo ceppo marcato utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Questo ceppo ospita il reporter fluorescente Ptap, una CFP che è espressa nella sottopopolazione di cellule produttrici di matrice colorate in blu. Questa sottopopolazione produce e secerne la matrice extracellulare che costituisce il biofilm. La prossima immagine è il risultato della visualizzazione mediante microscopia a fluorescenza di un ceppo a doppia marcatura che ospita il reporter Ptap, A CFP e il reporter aggiuntivo P Surfactin YFP.

Questo secondo reporter consente il monitoraggio della sottopopolazione di cellule responsabili della secrezione della molecola di segnalazione surfactina, che innesca la cascata di segnalazione per il differenziamento dei produttori di matrice. Qui, i produttori di matrici sono di colore falso in blu, mentre i produttori di tensioattivi sono di colore falso in giallo, i risultati della citometria a flusso 2D utilizzano un singolo ceppo marcato che ospita il ptap reporter. Qui viene presentato un YFB.

Il ceppo di controllo non trattato senza geni proteici fluorescenti ha mostrato una singola popolazione con cellule a bassa fluorescenza relativa che ospitano ptap. Un YFP in condizioni non induttive di biofilm non ha differenziato la sottopopolazione dei produttori di matrici, e l'intera popolazione ha anche mostrato una bassa fluorescenza relativa. Al contrario, in condizioni di induzione del biofilm, una sottopopolazione di cellule con un'elevata fluorescenza relativa è stata rilevata come una spalla a destra della bassa fluorescenza relativa.

Di seguito sono riportati i risultati di picco ottenuti dalla citometria a flusso 3D. I segnali di fluorescenza dei canali monitorati sono presentati nell'asse X per YFP e nell'asse Y Per la CFP, il pannello in alto a sinistra mostra un ceppo senza geni proteici fluorescenti come controllo per la fluorescenza di fondo. Nel pannello superiore destro, un singolo ceppo marcato è stato utilizzato per rilevare la sottopopolazione di produttori di surfactina nel canale di fluorescenza YFP incorniciato in giallo.

Nel pannello in basso a sinistra, è stato utilizzato un diverso ceppo etichettato per rilevare la sottopopolazione dei produttori di matrici. Nel canale di fluorescenza CFP incorniciato in blu, le sottopopolazioni di produttori di matrici e produttori di tensioattivi vengono monitorate utilizzando il ceppo a doppia marcatura e i risultati vengono presentati. In questo pannello in basso a destra.

Vengono rilevate due sottopopolazioni di cellule che esprimono alti livelli di reporter fluorescenti. Ogni popolazione è inquadrata mostrando che non c'è sovrapposizione nell'espressione dei reporter tra le due sottopopolazioni di cellule specializzate. Questa figura finale mostra la quantificazione delle sottopopolazioni di produttori di matrici e cannibali mediante citometria a flusso 3D.

Nel pannello in alto a destra, un singolo ceppo marcato è stato utilizzato per rilevare la sottopopolazione di cannibali. Nel canale di fluorescenza YFP inquadrato in giallo, questa sottopopolazione di cannibali è stata descritta per differenziarsi in modo coordinato con la sottopopolazione dei produttori di matrice. Nel pannello in basso a sinistra, la sottopopolazione dei produttori di matrici è rilevata in un altro singolo ceppo marcato nel canale di fluorescenza CFP.

Inquadrati in blu, i risultati del ceppo a doppia marcatura nel pannello in basso a destra hanno mostrato una singola sottopopolazione di cellule fluorescenti che esprimono sia YFP che CFP incorniciati in verde. L'espressione simultanea dei due reporter indica che entrambe le vie di differenziazione cellulare sono coordinate attivate nella stessa sottopopolazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare e quantificare le distinte sottopopolazioni di cellule che costituiscono un biofilm microbico utilizzando l'analisi cellulare della popolazione cellulare come la microscopia fluorescente o la citometria a flusso.