La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

L'obiettivo generale di questa procedura è accelerare l'analisi della differenziazione neuronale di cellule progenitrici neurali umane coltivate in un ambiente tridimensionale. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando le cellule nel gel idrico puro a base di peptidi autoassemblanti. Successivamente, le cellule vengono rilasciate dagli scaffold tridimensionali.

Nel terzo passaggio, viene eseguita la colorazione fitochimica immuno delle cellule nell'ultima fase. Le cellule vengono enumerate mediante analisi citofluorimetrica. Infine, il tasso di differenziamento neuronale o il tasso di apoptosi possono essere determinati attraverso l'analisi citofluorimetrica rispettivamente per marcatori neuronali o apoptotici.

Con questa tecnica, la quantificazione della differenziazione neurale è molto più rapida e i dati Optane vengono elaborati con tecniche più ampie e di microfotografia. Per l'inclusione delle cellule nella matrice pura, posizionare innanzitutto un'ansa di vetro sterile del diametro di 13 millimetri in ciascuna di due pozzette di una piastra per colture cellulari a quattro pozzette. Successivamente, conservare la piastra su un banco pulito per un uso successivo. Poi, staccare le cellule progenitrici neurali umane o H NPCs aggiungendo 2,5 millilitri di tripsina appena preparata.

Aggiungere la soluzione di benzon alla piastra di coltura e incubare la sospensione cellulare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo cinque minuti, arrestare la reazione con l'inibitore della tripsina benzon a soluzione. Successivamente, dopo aver centrifugato le cellule staccate a 3000 ×g a temperatura ambiente per cinque minuti, risospendere il pellet risultante con cinque millilitri di una soluzione di saccarosio al 10% e quindi lavare la sospensione cellulare nelle stesse condizioni di centrifugazione.

Dopo aver scartato il surnatante Resus, sospendere il pellet nella soluzione di saccarosio fino a raggiungere una concentrazione cellulare finale di 1 × 10⁶ cellule per millilitro. Ora, il più rapidamente possibile, mescolare 60 µL di sospensione cellulare con la soluzione uno, trasferire 120 µL di questa sospensione nel tubo conico contenente la soluzione due e mescolare delicatamente; quindi, immediatamente, stratificare 100 µL della miscela su ciascun coverslip nella piastra a quattro pozzetti. Infine, aggiungere lentamente 200 µL di mezzo di coltura cellulare in ciascun pozzetto.

Dopo due o tre minuti, aggiungere altri 200 microlitri di mezzo di coltura cellulare nei pozzetti, avviando l'autoassemblaggio della matrice. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un'ora sulla zona riscaldata del bancone pulito. Senza spostare il piatto di coltura cellulare il più possibile dopo che le matrici si sono assemblate, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per rimuovere la maggior parte, ma non tutta, del mezzo, al fine di evitare che le matrici si secchino.

Quindi lavare le matrici con 500 microlitri di mezzo fresco per 10 minuti. Infine, rimuovere il mezzo di lavaggio. Aggiungere altri 500 microlitri di mezzo e posizionare la piastra di coltura in un incubatore.

Se possibile, conservare le matrici in un proprio incubatore per evitare scosse accidentali delle strutture durante il primo giorno dell'esperimento di colorazione. Rimuovere il mezzo dalle matrici con una pipetta da 1000 microlitri e quindi lavare gli scaffold con PBS una volta per cinque minuti.

Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 400 microlitri di paraformaldeide in ogni pozzetto per fissare le matrici e incubarle per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo che gli scaffold sono stati fissati, lavarli con 500 microlitri di PBS per cinque minuti. Successivamente, incubare le strutture nel buffer di blocco per sei-nove ore, cambiando il buffer ogni due-tre ore, con un'incubazione finale notturna in buffer di blocco fresco a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere il buffer di blocco.

Aggiungere la soluzione di anticorpi nei pozzetti e incubare nuovamente le matrici a quattro gradi Celsius durante la notte. A questo punto, rimuovere la soluzione di anticorpo primario e lavare le impalcature in 500 microlitri di PBS per otto ore, cambiando il PBS ogni due ore e successivamente durante la notte a quattro gradi Celsius con PBS fresco. Dopo il lavaggio notturno, rimuovere il PBS e incubare le impalcature con la soluzione di anticorpo secondario per quattro ore a temperatura ambiente al buio.

Quindi lavare i campioni con PBS da quattro a sei volte, per un'ora ogni volta, e successivamente incubare le strutture con PBS fresco a quattro gradi Celsius al buio durante la notte. Aggiungere ora 50 microlitri di MOE all dab co su ogni vetrino per prepararli al montaggio delle matrici. Quindi montare con attenzione un coprioggetto su ciascun vetrino.

Infine, utilizzare un microscopio a fluorescenza per ottenere microfotografie singole e Zacks simili alla colorazione verde degli H NPCs per l'espressione del marcatore neuronale beta tre tubulina mostrata qui. Dopo aver lavato gli scaffold con 500 microlitri di HBSS per un minuto, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per trasferire gli scaffold in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, risospendere la soluzione cellulare più volte con una pipetta da 1000 microlitri per interrompere meccanicamente le matrici e quindi centrifugare la soluzione degli scaffold a 3000 ×g a temperatura ambiente per cinque minuti, rimuovere il soprannatante con una pipetta e quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di soluzione di tripsina benzina pipettando su e giù più volte.

Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Arrestare la reazione dopo cinque minuti aggiungendo un millilitro di inibitore della tripsina. Pipettare su e giù diverse volte la soluzione di benzonasi dopo aver centrifugato la sospensione cellulare nelle stesse condizioni di centrifugazione.

Rimuovere eventuali detriti della matrice lavando le cellule due volte con due millilitri di tampone HBSS. Infine, rimuovere gli aggregati passando la soluzione di sospensione cellulare attraverso un centrifugo con filtro cellulare da 70 micron nelle stesse condizioni e raccogliere le cellule in mezzo di coltura cellulare. Iniziare fissando le cellule disaggregate in paraformaldeide al 1% per 15 minuti a temperatura ambiente su un agitatore.

Successivamente, dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet nel buffer di lavaggio. Dopo aver centrifugato le cellule per 10 minuti a 350 ×g a quattro gradi Celsius, risospendere il pellet risultante in 25 microlitri di soluzione di anticorpo. Incubare la sospensione cellulare per due ore a temperatura ambiente su un agitatore.

Quindi aggiungere 300 microlitri di buffer pon direttamente ai campioni, quindi lavare le sospensioni cellulari due volte nelle stesse condizioni di centrifugazione. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 25 microlitri dell'anticorpo secondario e quindi incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente al buio. Successivamente al lavaggio delle cellule altre due volte con buffer saponina, risospendere il pellet in 500 microlitri di buffer di lavaggio per l'analisi citofluorimetrica.

In questa figura, H NPCs incapsulati e matrice pura mostrano cellule che crescono in strutture sferiche, densamente impacchettate, in cui il diametro delle sfere può raggiungere alcune centinaia di micron tra le sfere. Si possono osservare fasci di prolungamenti formati dalle cellule, come indicato dalle frecce bianche. Sebbene le singole cellule siano difficilmente riconoscibili, le cellule incapsulate nella matrice pura supplementata con laminina crescono in strutture meno dense e sono distribuite in modo più omogeneo, come mostrato in questa figura; singole cellule possono persino essere riconosciute in aree meno dense, come indicato dalle frecce nere. Qui, H NPCs differenziati per quattro giorni in matrice pura supplementata con laminina, colorati in verde per l'espressione del marcatore neuronale.

La beta tre tubulina è mostrata per valutare la percentuale di cellule positive. Il numero totale di cellule può essere determinato enumerando i nuclei cellulari colorati qui in blu con DAPI. Questa microfotografia rappresenta la proiezione completa di uno stack Z di immagini acquisite con un microscopio a fluorescenza.

Le cellule rilasciate dalla matrice possono essere ri-seminate, ad esempio su coprioggetti come mostrato in questa figura, per ulteriori studi funzionali. Questa microfotografia mostra cellule coltivate in 3D dopo essere state sottoposte alla procedura di rilascio precedentemente descritta e coltivate per tre giorni. La colorazione per la tubulina beta tre in rosso rivela una morfologia paragonabile a quella delle cellule ospitate nello scaffold 3D, utilizzando cellule non colorate come controllo negativo.

Il GA rappresentato come riquadro nero è stato impostato per l'analisi successiva delle cellule positive per la beta tre tubulina in questo diagramma a dispersione, le cellule positive appaiono all'interno del riquadro nero nella parte destra dell'asse x e una popolazione intermedia nel riquadro tratteggiato, che molto probabilmente rappresenta detriti cellulari, può essere osservata. Un confronto tra il conteggio cellulare manuale e la conta mediante citometria a flusso è mostrato in quest'ultima figura. Una proporzione molto maggiore di cellule positive può essere rilevata mediante analisi citofluorimetrica, come indicato dai quadrati neri vuoti, rispetto a quanto possa essere tipicamente enumerato mediante conteggio manuale, come indicato dai triangoli neri pieni.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare metriche inadeguate per la coltivazione di MPC periferici in uno scaffold 3D e di come rilasciare le cellule dallo scaffold per analizzatori citometrici a flusso.