Name: La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Impara a coltivare cellule progenitrici neurali umane in un idrogel peptidico tridimensionale auto-assemblante. Questo metodo consente l'analisi rapida della differenziazione neuronale mediante citometria a flusso.

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Gli autori desiderano ringraziare Norman Krüger per il suo eccellente supporto tecnico.

1. Parte 1: Cultura della hNPCs in PuraMatrix <ol><li> In anticipo per la generazione di un ponteggio con una concentrazione PuraMatrix del 0,25% senza laminina si ha la necessità di preparare le seguenti soluzioni </li><li> Preparare una soluzione contenente 20% di saccarosio e una soluzione contenente il 10% di saccarosio disciolto in acqua distillata sterile. </li><li> Per la soluzione 1 mix 120 ml di soluzione di saccarosio al 20% con 120 ml di acqua distillata in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Per la soluzione 2 mescolare 60 ml di soluzione PuraMatrix con 60 ml di soluzione di saccarosio al 20% in un tubo di 1,5 ml. </li></ol> Per la preparazione di un ponteggio con una concentrazione di 0,25% PuraMatrix integrato con laminina (8 mg per 100 microlitri Matrix) si ha la necessità di preparare le seguenti soluzioni. <ol class="lroman"><li> Per la soluzione 1 miscelare 72 ml di acqua distillata con 120 ml di soluzione di saccarosio al 20% e 48 microlitri laminina in un tubo di 1,5 ml. </li><li>Per la soluzione 2 mescolare 60 microlitri PuraMatrix soluzione con 60 ml di soluzione di saccarosio al 20% in una provetta da 1,5 ml. </li></ol><ol start="5"><li> Per il radicamento di cellule nel PuraMatrix preparare un 4-ben piastra di coltura cellulare e mettere un coperchio di vetro sterilizzati antiscivolo (diametro 13 mm) in due pozzi. Conservare la piastrina in panchina pulita per l&#39;uso in seguito. Scivola copertura in vetro vengono utilizzati solo per gli studi di immunocitochimica. Se non colorazioni immunocitochimiche sono destinati, il passo può essere saltato. </li></ol> Per preparare il hNPCs per l&#39;incapsulamento in 3D uno ponteggi deve preparare le seguenti soluzioni. Diluire il benzonasi nel tripsina / EDTA soluzione, utilizzando un fattore di diluizione di 1:10.000. Per un mix soluzione Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + benzonasi 25U/μl + 1% + Tripsina HSA-inibitore (0.5mg/ml). <ol start="6"><li> Staccare le cellule aggiungendo 500 microlitri tripsina / benzonasi soluzione e incubare per 5 minuti in un incubatore (37 ° C, 5% di CO 2). Arrestare la reazione con la soluzione Trypsin-Inhibitor/Benzonase. Successivamente le cellule centrifuga staccato per 5 min a 3000 x g. Lavare le cellule con 5 ml di soluzione di saccarosio al 10% e centrifugare nuovamente. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in soluzione di saccarosio al 10%, la soluzione finale deve contenere cellule 1x10 6 cellule / ml. </li></ol> I prossimi passi, da 1,8 a 1,11, dovrebbe essere fatto il più velocemente possibile, a causa del basso pH della soluzione PuraMatrix, che potrebbe essere dannosa per le cellule. <ol start="8"><li> Mescolare 60 ml di sospensione cellulare con la soluzione 1. </li><li> Aggiungere 120 ml di soluzione 1, contenente le cellule, per il tubo conico con la soluzione 2 e mescolare con cura. </li><li> Posto 100 ul della miscela immediatamente su ogni copertina scivola risiedeva nel 4-pozzetti. </li><li> Aggiungere lentamente 200 ul terreno di coltura cellulare per bene e dopo 2-3 minuti, un altro 200 ul. Questo avvierà l&#39;auto-assemblaggio della matrice. </li><li> Incubare cells a 37 ° C, per 1 ora in panchina pulita su una piastra di riscaldamento o l&#39;area riscaldata del banco pulito. Per quanto possibile, non si muovono la piastra in quanto ciò potrebbe danneggiare l&#39;assemblaggio delle matrici. </li><li> Rimuovere la maggior parte del mezzo, ma non tutti, per evitare le matrici cadere a secco, con una pipetta 1000 ml. Aggiungere 500 l di media a lavare matrici per 10 minuti. Infine rimuovere il supporto e aggiungere 500 microlitri di medie posto fresco e la piastra di coltura in un incubatore (37 ° C CO, 5% 2). Poiché le matrici sono sensibili agli urti i piatti dovrebbe essere spostato il meno possibile e conservarli, se possibile, in un apposito incubatore. </li><li> Il hNPCs qui utilizzate sono state moltiplicate per 7 giorni nel 3D-scaffold e la differenziazione è stata avviata con il ritiro dei fattori di crescita 13. Medio è stato cambiato ogni 2-3 giorni. </li></ol> 2. Parte 2: colorazione immunocitochimica delle matrici intere <ol><li> In anticipo per la procedura di colorazione bisogna preparare: abSoluzione tampone di bloccaggio composto da 5% di siero normale di capra e lo 0,3% di Triton X-100 (sciolto in PBS, una soluzione di paraformaldeide al 4% sulla base di 0,1 M PBS e se aveva bisogno di una soluzione con 4 &#39;,6-Diamidin-2&#39;-phenylindoldihydrochlorid DAPI) per la colorazione dei nuclei DAPI contenente 100 ng / ml sciolto in PBS. I campioni sono stati montati con un misto di Mowiol e DABCO. </li><li> Per lavare le matrici di rimuovere il terreno con una pipetta 1000 ml e lavare i ponteggi una volta con PBS per 5 minuti. </li><li> Per fissare i ponteggi togliere il PBS e aggiungere 400 ml di paraformaldeide (4% di 0,1 M PBS) in ogni pozzetto e incubare le matrici per 30 minuti a temperatura ambiente. Ponteggi fissi possono essere memorizzati in PBS integrato con 0,02% NaN 3 a 4 ° C per diverse settimane fino a diversi mesi. </li><li> Prima di una colorazione lavare i ponteggi con PBS per 5 minuti. </li><li> Incubare i ponteggi in blocco soluzione tampone. Soluzione bloccante è stata cambiata tre volte ogni 2-3 ore ed esercizi successividipendentemente ponteggi sono stati incubati in soluzione il blocco durante la notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione tampone di bloccaggio e aggiungere l&#39;anticorpo primario sciolto in PBS integrato con 1% di siero normale di capra e incubare le matrici per tutta la notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e lavare ponteggi 4 volte per 2 ore e successivamente per tutta la notte a 4 ° C con PBS. </li><li> Rimuovere la PBS e aggiungere la soluzione con l&#39;anticorpo secondario, sciolto in PBS integrato con 1% di siero di capra normale, per 4 ore a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare i campioni con PBS 4-6 volte per 1 ora e successivamente per tutta la notte a 4 ° C al buio. </li><li> Per una colorazione nuclei si possono aggiungere 400 microlitri della soluzione DAPI per 30 min. </li><li> Per montare i campioni si ha la necessità vetrini da microscopio. Aggiungere 50 microlitri Mowiol / DABCO sui vetrini da microscopio. Togliere il coperchio scivola dal 4-pozzetti e metterli attenzione sul supporto di montaggio. </li><li> Qui abbiamo usato un 8000 Biozeromicroscopio (Keyence, Germania, Karlsruhe) per ottenere micrografie singolo e z-stack. Ogni stack contiene 30 singole immagini con una distanza di 1-2 micron. Utilizzando il software corrispondente analizzatore la sfocatura inerente alla fluorescenza è stato rimosso prima proiezione completa del z-stack sono stati prodotti. </li></ol> 3. Parte 3: Rilascio di hNPCs dalle impalcature per l&#39;analisi di citometria a flusso <ol><li> In anticipo per il rilascio delle cellule dal ponteggi lavare i ponteggi HBSS con 500 microlitri. </li><li> Trasferire i ponteggi per mezzo di una pipetta 1000 ml in una provetta da 15 ml contenenti terreno di coltura cellulare. </li><li> Per disturbare i ponteggi meccanicamente risospendere la soluzione delle cellule più volte con una pipetta 1000 ml e, successivamente, centrifugare la soluzione a 3000 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante con una pipetta, aggiungere 500 ml di tripsina / benzonasi soluzione e risospendere il pellet di cellule diverse volte. </li><li> Incubare le cellule per 5 minutia 37 ° C in tripsina / benzonasi soluzione. Per fermare la reazione aggiungere 1 ml di soluzione Trypsin-inhibitor/Benzonase e pipettare su e giù diverse volte. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare 5 min a 3000 xg, rimuovere il surnatante e lavare le cellule con 2 ml di tampone HBSS. Ripetere questa operazione due volte. Questa procedura rimuovere i detriti matrice. </li><li> Passare attraverso la sospensione di cellule soluzione un filtro cella (dimensione dei pori 70 micron) per rimuovere inerti e raccogliere le cellule in terreno di coltura cellulare. Le cellule ottenute possono essere seminati di nuovo ad esempio su vetrini coprioggetto per studi funzionali come patch clamp o misure fluometric. Per elaborare le cellule per citometria a flusso, fissare le cellule immediatamente (vedi 4.1). </li></ol> 4. Parte 4: Quantificazione βIII-tubulina cellule positive mediante citometria di flusso <ol><li> Fissare le cellule rilasciato ottenuto nel passaggio 3,7% PFA con 1 per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 3000 xg di age il surnatante. Se necessario, le cellule possono essere preparato per essere conservato a 4 ° C per la successiva analisi. Quindi risospendere le cellule in tampone di lavaggio (PBS integrata con 0,5% di BSA e 0,02% Na-azide). </li><li> Per procedere con la preparazione per la citometria a flusso, centrifugare la sospensione cellulare per 10 minuti a 350 xg, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 25 microlitri della soluzione di anticorpi. Pertanto il primo anticorpo è mescolato con tampone saponina ad una concentrazione 1:100 per esempio βIII-tubulina. Il buffer è costituito da saponina PBS con una concentrazione di saponina dello 0,5%, una concentrazione di BSA 0,5% e una Na-azide concentrazione del 0,02%. </li><li> Incubare la sospensione cellulare con il primo anticorpo per 2 ore a temperatura ambiente su un agitatore. Come controllo negativo preparare un campione senza il primo anticorpo. </li><li> Per la prima fase di lavaggio aggiungere 300 microlitri di buffer saponina direttamente alle cellule. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. Per la fase di lavaggio secondo, scartareil surnatante, aggiungere 300 microlitri di buffer e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 25 ul di soluzione contenente l&#39;anticorpo secondario (per esempio Alexa Fluor 647, 1:1000, disciolto in tampone saponina). Incubare le cellule con l&#39;anticorpo secondario 1h a temperatura ambiente, al buio. </li><li> Per la prima fase di lavaggio aggiungere 300 microlitri di buffer saponina direttamente alle cellule. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. Per la fase di lavaggio secondo, scartare il surnatante, aggiungere 300 microlitri di buffer e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 350 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di lavaggio per l&#39;analisi di citometria a flusso. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Un esempio di hNPCs coltivate in auto-assemblaggio idrogel impalcatura PuraMatrix è mostrato in figura 1. Il hNPCs crescere in strutture sferica come in PM non modificato. In questa condizione la culturas, le cellule possono difficilmente essere riconosciuta in una trasmissione della luce, anche se fasci di processi tra le sfere sono visibili (fig. 1A). A seconda delle condizioni di coltura del tipo di cellule, la matrice può essere modificato ad esempio con l&#39;aggiunta di laminina. Per la linea cellulare hNPC ReNcell VM (Millipore) laminina è necessario per indurre un modello di crescita con aggregati meno denso, ma una distribuzione più omogenea delle cellule (fig 1B). Indipendente di modifiche, la matrice può essere utilizzato per studiare ad esempio la differenziazione neuronale. Figura 1C presenta una colorazione della hNPCs per il marcatore neuronale βIII-tubulina. In questo esempio, le cellule sono state coltivate per 7 giorni nella matrice e successivamente differenziati per 4 giorni, in cui è stata indotta la differenziazione con il ritiro dei fattori di crescita EGF e bFGF. 13 corpi cellulari e una fitta rete di processi costruiti dalle cellule possono essere riconosciuto facilmente. Tuttavia, è evidente che una quantificazione del numero delle cellule è molto tempo, come un gran numero dile immagini di diverse regioni della matrice deve essere analizzato, per ottenere una base di dati affidabile per una analisi statistica. In 1D fico si può vedere un esempio di cellule rilasciati dalla matrice e successivamente intrecciata su coprioggetto. Queste cellule potrebbero essere utilizzate per studi funzionali. Il rilascio delle cellule dal 3D-scaffold offre la possibilità di analizzare diversi parametri come espressione di proteine ​​marker o il tasso di sopravvivenza delle cellule da parte AnnexinV / PI colorazione o un saggio TUNEL. La Figura 2 mostra un esempio di analisi di citometria a flusso della percentuale di βIII-tubulina cellule +. Il controllo negativo (cellule non contrassegnati per βIII-tubulina) è mostrato in figura 2A. Questi controlli vengono utilizzati per determinare la porta per la rilevazione successiva βIII-tubulina + cellule (Fig. 2b). Un confronto di un conteggio manuale delle cellule e l&#39;analisi in citometria a flusso è mostrato nella figura 2C. La percentuale di βIII-tubulina cellule + è stato determINED contando il numero totale di cellule (per mezzo di una colorazione nucleare DAPI) e il numero di cellule tubulina βIII-+ nelle immagini a fluorescenza. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> Figura 1. hNPCs coltivate in auto-assemblaggio PuraMatrix peptide idrogel. A) hNPCs incapsulati in PuraMatrix (PM) crescono in sferica, strutture dense confezionato, in cui il diametro delle sfere può arrivare a diverse centinaia di micron. Tra le sfere si può riconoscere fasci di processi costruiti dalle cellule (frecce). B) Le cellule incapsulate in PuraMatrix integrato con laminina (PML) crescono in strutture meno denso, più omogeneamente distribuita. Nel laminina integrata matrice si può riconoscere singole cellule in aree meno dense (frecce), tuttavia è quasi impossibile quantificare il numero di cellule. C) hNPCs differenziato per 4 giorni in contrassegno PML esprimere neuronali come βIII-tubulina (verde). Di valutazionete la percentuale di cellule positive si deve determinare il numero totale delle cellule da una colorazione nuclei come DAPI (blu). Il Microfotografia presenta la proiezione completa di un z-pila di foto scattate con Biozero-8000 microscopio. D) Le cellule rilasciati dalla matrice possono essere seminati su vetrini coprioggetto per esempio per ulteriori studi funzionali. Il Microfotografia mostra cellule in coltura per il 3D, successivamente alla procedura di rilascio. La colorazione per βIII-tubulina (rosso) rivela una morfologia comparabile alle cellule ospitato nel patibolo 3D. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi di citometria a flusso delle cellule liberato dalla PuraMatrix. Per superare la quantificazione in termini di tempo di microfotografie abbiamo utilizzato un protocollo di rilasciare cellule in coltura in PuraMatrix che danno accesso alle più veloce analisi di citometria a flusso. A) le cellule non colorati sono state usate come controllo negativo, per impostare la porta (cornice nera) per la successiva analisiper esempio di βIII-tubulina cellule. B) Per quantificare la percentuale di βIII-tubulina + cellule è stata utilizzata la porta stessa, ambientato nel controllo negativo,. Cellule positive appaiono nella parte destra l&#39;asse x, dove inoltre è stata osservata una popolazione intermedia (telaio tratteggiata), molto probabilmente detriti cellulari che rappresentano. C) Il confronto del manuale cellule contate e le cellule contate mediante citometria a flusso ha evidenziato una più alta proporzione di cellule positive, dove la dipendenza dal tempo del numero di βIII-tubulina + era paragonabile, indicando l&#39;affidabilità del protocollo di citometria a flusso.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;uso del 3D-scaffold offre l&#39;opportunità di studiare lo sviluppo di diversi tipi di cellule in una situazione di coltura cellulare più vicino alla situazione in vivo. Per quanto riguarda invece l&#39;analisi di esempio differenziamento neuronale o studi funzionali si deve superare alcuni ostacoli per ottenere dati affidabili per la quantificazione esempio di tipi di cellule. Qui abbiamo descritto la cultura del hNPCs in idrogel a base di peptidi patibolo PuraMatrix e il con...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> PuraMatrix peptide idrogel </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> I mouse laminina </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Sale Hanks &#39;soluzione equilibrata 1X </td></tr><tr><td&gt; ΒIII-tubulina di anticorpi </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Mouse, monoclonale, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11029 </td><td> Capra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11031 </td><td> Capra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21235 </td><td> Capra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 reagente </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> DABCO </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabiciclo [2.2.2] ottano 98% </td></tr><tr><td> Cellulare filtro </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 micron dimensione dei pori </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonasi 250 U / mL </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Inibitore della tripsina </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% di HSA </td><td> Octapharma </td><td> Albumina umana Kabi-20% </td><td></td></tr></tbody></table>

la coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio peptide hydrogel

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

L&#39;influenza di 3 dimensioni (3D) ponteggi sulla differenziazione della crescita, la proliferazione neuronale e, infine, è di grande interesse al fine di trovare nuovi metodi per le terapie basate sulle cellule e standardizzati a disturbi neurologici o malattie neurodegenerative. Strutture 3D sono tenuti a fornire un ambiente molto più vicino alla situazione in vivo di culture 2D. Nel contesto della medicina rigenerativa, la combinazione di ponteggi biomateriale con staminali neurali e cellule progenitrici promette grandi come strumento terapeutico. 1-5 sistemi di cultura che emula un ambiente di tre dimensioni hanno dimostrato di influenzare la proliferazione e la differenziazione in diversi tipi di staminali e cellule progenitrici. Qui, la formazione e la funzionalizzazione del 3D-microenviroment è importante determinare la sopravvivenza e il destino delle cellule incorporato. 6-8 Qui abbiamo usato PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), un peptide idrogel a base patibolo,che è ben descritto e usato per studiare l&#39;influenza di un ambiente 3D su diversi tipi di cellule. 7,11-14 PuraMatrix possono essere personalizzati in modo semplice e sintetico la realizzazione di nano-fibre fornisce una 3D-cultura sistema di alta affidabilità, che in aggiunta xeno-free. Recentemente abbiamo studiato l&#39;influenza della concentrazione di PM-sulla formazione del patibolo. 13 In questo studio le concentrazioni di PM utilizzato ha avuto un impatto diretto sulla formazione della struttura 3D, che è stato dimostrato dalla microscopia a forza atomica. Una successiva analisi della sopravvivenza e della differenziazione dei hNPCs rivelato un&#39;influenza delle concentrazioni di PM utilizzate sul destino delle cellule incorporato. Tuttavia, l&#39;analisi di sopravvivenza o la differenziazione neuronale mediante tecniche di immunofluorescenza possiede alcuni ostacoli. Per ottenere dati attendibili, si deve determinare il numero totale di celle all&#39;interno di una matrice per ottenere il numero relativo di esempio. cellule neuronali segnato da βIII-tubulina. Questi prerequisiti di una tecnica per analizzare i ponteggi in tutte le 3-Dimensioni da un microscopio confocale o una tecnica paragonabile come microscopi a fluorescenza in grado di prendere z-stack del campione. Inoltre questo tipo di analisi è estremamente tempo. Qui mostriamo un metodo per rilasciare le cellule dal 3D-scaffold per l&#39;esempio, una successiva analisi in citometria a flusso. In questo protocollo umani le cellule progenitrici neurali (hNPCs) della linea cellulare ReNcell VM (Millipore USA) sono state coltivate e differenziati in 3D ponteggi costituito da PuraMatrix (PM) o PuraMatrix integrato con laminina (PML). Nelle nostre mani un PM concentrazione dello 0,25% è stato ottimale per la coltivazione delle cellule 13, tuttavia la concentrazione potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule. 12 Le cellule rilasciato può essere utilizzato ad esempio per studi immunocitochimiche e successivamente analizzate mediante citometria a flusso. Questo accelera l&#39;analisi e more oltre, il resto i dati ottenuti su una base più larga, migliorando l&#39;affidabilità dei dati.

Qui si descrive l&#39;uso di un auto-assemblaggio 3-dimensionale patibolo alla cultura cellule umane progenitrici neurali. Vi presentiamo un protocollo per liberare le cellule dai ponteggi da analizzare successivamente, ad esempio mediante citometria di flusso. Questo protocollo potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule per effettuare studi dettagliati meccanicisticamente.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

L'influenza di scaffold tridimensionali (3D) sulla crescita, la proliferazione e, infine, la differenziazione neuronale è di grande interesse al fine di trovare nuovi...

L'obiettivo generale di questa procedura è accelerare l'analisi della differenziazione neuronale di cellule progenitrici neurali umane coltivate in un ambiente tridimensionale. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando le cellule nel gel idrico puro a base di peptidi autoassemblanti. Successivamente, le cellule vengono rilasciate dagli scaffold tridimensionali.Nel terzo passaggio, viene eseguita la colorazione fitochimica immuno delle cellule nell'ultima fase. Le cellule vengono enumerate mediante analisi citofluorimetrica. Infine, il tasso di differenziamento neuronale o il tasso di apoptosi possono essere determinati attraverso l'analisi citofluorimetrica rispettivamente per marcatori neuronali o apoptotici.Con questa tecnica, la quantificazione della differenziazione neurale è molto più rapida e i dati Optane vengono elaborati con tecniche più ampie e di microfotografia. Per l'inclusione delle cellule nella matrice pura, posizionare innanzitutto un'ansa di vetro sterile del diametro di 13 millimetri in ciascuna di due pozzette di una piastra per colture cellulari a quattro pozzette. Successivamente, conservare la piastra su un banco pulito per un uso successivo. Poi, s

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Bioingegneria

Semplici tecniche sono descritte per la produzione rapida di microfabbricazione sistemi di coltura neurali utilizzando un dispositivo digitale micromirror per litografia dinamica proiezione maschera su substrati regolari colture cellulari. Questi sistemi di coltura possono essere più rappresentativo dell'architettura naturale biologico, e le tecniche descritte potrebbe essere adattato per numerose applicazioni.

Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

Questo protocollo vengono utilizzati dei metodi utilizzati per stabilire gli ambienti 2D e 3D in custom-designed camere electrotactic, che permette di monitorare le...

Di campo elettrico controllato migrazione diretta di cellule progenitrici neurali in ambienti 2D e 3D

Questo video mostra lo sviluppo e la differenziazione delle cellule staminali neurali umane all'interno di un'impalcatura tridimensionale. Un rivestimento di laminina sull'impalcatura favorisce l'adesione cellulare, mentre un mezzo neurale privo di fattore di crescita induce la differenziazione cellulare in cellule progenitrici neurali, che estendono i loro processi all'interno di un'architettura porosa in più direzioni, formando una coltura...

Differenziazione delle cellule staminali neuronali umane in colture 3D utilizzando un'impalcatura porosa

Questo video dimostra una tecnica per stabilire una coltura tridimensionale di cellule gliali. Le cellule gliali derivate dal cervello di ratto sono incapsulate all'interno di una matrice polimerica fotocrosslinkabile contenente componenti della matrice extracellulare. Dopo l'incubazione in un mezzo di crescita, le cellule gliali proliferano all'interno della matrice di supporto per creare una coltura tridimensionale.

Stabilire una coltura tridimensionale di cellule gliali derivate dal cervello di ratto

Presenteremo lo sviluppo di auto-assemblati, tridimensionale fasci di somata astrocytic allineati longitudinalmente e processi all'interno di un encasement romanzo biomateriale. Questi ingegnerizzato "ponteggi vivente", che esibiscono micron-scala diametro ancora estendere centimetri di lunghezza, può servire come banchi di prova per lo studio dei meccanismi dello sviluppo neurologico o facilitare la neurorigenerazione di regia della migrazione neuronale e/o assonale path-finding.

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Qui, presentiamo un protocollo per la cultura 3D del ratto cellule di glia cervello-derivato, tra cui gli astrociti, microglia ed oligodendrociti. Dimostriamo che la cellula primaria cultura, sintesi di idrogel di acido ialuronico methacrylated (HAMA), incapsulamento delle cellule e HAMAphoto-polimerizzazione e campione di elaborazione per l'imaging al microscopio confocale e scansione elettrone.

Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

In questo protocollo, ci proponiamo di descrivere un metodo riproducibile per combinare dissociato pluripotenti umane su cellule staminali neuroni e astrociti insieme in 3D sfera cocultures, mantenendo queste sfere in condizioni galleggiante libera e successivamente misurazione dell'attività sinaptica circuito delle sfere con immunoanalysis e registrazioni di matrice multielettrodo.

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

Qui, forniamo un metodo per analizzare il comportamento degli assoni in crescita in matrici 3D, imitando il loro sviluppo naturale.

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

Qui, presentiamo un protocollo per produrre cocolture biostampate in 3D di neuroni e astrociti derivati da iPSC. Questo modello di cocoltura, generato all'interno di un'impalcatura di idrogel in formati a 96 o 384 pozzetti, dimostra un'elevata vitalità post-stampa e la crescita dei neuriti entro 7 giorni e mostra l'espressione di marcatori di maturità per entrambi i tipi di cellule.

Bioprinting tridimensionale di cocolture neurone-astrociti derivate da iPSC umane per applicazioni di screening

Impara a coltivare cellule progenitrici neurali umane in un idrogel peptidico tridimensionale auto-assemblante. Questo metodo consente l'analisi rapida della differenziazione neuronale mediante citometria a flusso.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

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