La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di accelerare l'analisi del differenziamento neuronale di cellule progenitrici neurali umane coltivate in un ambiente tridimensionale. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule nella matrice pura di idrogel autoassemblante a base di peptidi. Successivamente, le cellule vengono rilasciate dagli scaffold tridimensionali.

Nella terza fase, nella fase finale viene eseguita la colorazione immunofitochimica delle cellule. Le cellule vengono enumerate mediante analisi citofluorimetrica. In definitiva, il tasso di differenziazione neuronale o il tasso di apoptosi possono essere determinati attraverso l'analisi citofluorimetrica rispettivamente per marcatori neuronali o apoptotici.

Con questa tecnica, la quantificazione della differenziazione neurale è molto più veloce e i dati di Optane salgono verso l'alto in una base più ampia e tecniche di microfotografia Per l'inclusione delle cellule nella matrice pura, in primo luogo un coperchio di vetro sterilizzato di 13 millimetri di diametro scivola in ciascuno dei due pozzetti di una piastra di coltura cellulare a quattro pozzetti. Quindi riporre la piastra su un banco pulito per un uso successivo. Quindi, staccare le cellule progenitrici neurali umane o NPC H aggiungendo 2,5 millilitri di tripsina appena preparata.

Benzon una soluzione per la piastra di coltura e incubazione della sospensione cellulare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo cinque minuti, interrompere la reazione con l'inibitore della tripsina benzon una soluzione. Quindi, dopo aver centrifugato le cellule staccate a 3000 volte G a temperatura ambiente per cinque minuti, sospendere nuovamente il pellet risultante con cinque millilitri di una soluzione di saccarosio al 10%, quindi lavare la sospensione cellulare nelle stesse condizioni di centrifuga.

Dopo aver scartato la trappola Resus, sospendere il pellet nella soluzione di saccarosio fino a una concentrazione finale di una volta per 10 per la sesta cellula per millilitro. Ora, il più rapidamente possibile, miscelare 60 microlitri di sospensione cellulare con la soluzione uno, trasferire 120 microlitri di questa sospensione nel tubo conico con la soluzione due e mescolare accuratamente, quindi sovrapporre immediatamente 100 microlitri di miscela su ciascuno dei vetrini di copertura nella piastra a quattro pozzetti. Infine, aggiungere lentamente 200 microlitri di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto.

Dopo due o tre minuti, aggiungere altri 200 microlitri di terreno di coltura cellulare ai pozzetti avviando l'autoassemblaggio della matrice. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un'ora sull'area riscaldata del banco pulito. Evitando il più possibile di spostare la piastra di coltura cellulare dopo che le matrici sono state assemblate, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per rimuovere la maggior parte ma non tutto il terreno per evitare che le matrici si secchino.

Quindi lavare le matrici con 500 microlitri di terreno fresco per 10 minuti. Infine, rimuovere il mezzo di lavaggio. Aggiungere altri 500 microlitri di terreno e posizionare la piastra di coltura in un'incubatrice.

Se possibile. Conservare le matrici nella propria incubatrice per evitare scuotimenti accidentali delle strutture il primo giorno dell'esperimento di colorazione. Rimuovere il terreno dalle matrici con una pipetta da 1000 microlitri e quindi lavare gli scaffold con PBS una volta per cinque minuti.

Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 400 microlitri di paraldeide a ciascun pozzetto per fissare le matrici e incubarle per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo che le impalcature sono state fissate, lavarle con 500 microlitri di PBS per cinque minuti. Quindi incubare le strutture e il tampone di blocco per sei-nove ore, cambiando il tampone una volta ogni due o tre ore con un'ultima incubazione notturna in tampone di blocco fresco a quattro gradi Celsius il giorno successivo, rimuovere il tampone di blocco.

Aggiungere la soluzione di anticorpi ai pozzetti e incubare nuovamente le matrici a quattro gradi Celsius durante la notte. Ora, rimuovere la soluzione di anticorpi primari e lavare gli scaffold in 500 microlitri di PBS per otto ore, cambiando il PBS ogni due ore e poi successivamente durante la notte a quattro gradi Celsius con PBS fresco. Dopo il lavaggio notturno, rimuovere il PBS e incubare gli scaffold con la soluzione di anticorpi secondari per quattro ore a temperatura ambiente al buio.

Quindi lavare i campioni con PBS da quattro a sei volte per un'ora ogni volta, quindi incubare le strutture con PBS fresco a quattro gradi Celsius al buio durante la notte. Ora aggiungere 50 microlitri di MOE all dab co sui vetrini del microscopio per prepararli al montaggio delle matrici. Quindi montare con cura un vetrino coprioggetti su ogni vetrino.

Infine, utilizzare un microscopio a fluorescenza per ottenere singole micrografie e Zacks simili alle NPC H che si colorano di verde per l'espressione del marcatore neuronale beta tre tubulina mostrata qui. Dopo aver lavato gli scaffold con 500 microlitri di HBSS per un minuto, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per trasferire gli scaffold in un tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, risospendere più volte la soluzione cellulare con una pipetta da 1000 microlitri per disgregare meccanicamente le matrici e successivamente centrifugare la soluzione di scaffold a 3000 volte G a temperatura ambiente per cinque minuti, rimuovere il surnatante con una pipetta e quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di soluzione di tripsina benzina pipettando su e giù più volte.

Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Interrompere la reazione dopo cinque minuti con un millilitro di inibitore della tripsina. Benza naso soluzione pipettando su e giù più volte dopo aver fatto girare la sospensione cellulare nelle stesse condizioni di centrifuga.

Rimuovere eventuali detriti della matrice lavando le celle con due millilitri di tampone HBSS due volte. Infine, rimuovere gli aggregati facendo passare la soluzione di sospensione cellulare attraverso una centrifuga filtrante da 70 micron nelle stesse condizioni e raccogliere le cellule nel terreno di coltura cellulare. Iniziare fissando le cellule disaggregate in paraldeide paraforme all'1% per 15 minuti a temperatura ambiente su uno shaker.

Quindi, dopo aver centrifugato le celle reus, sospendere il pellet nel tampone di lavaggio. Ora, dopo aver centrifugato le cellule per 10 minuti a 350 volte G a quattro gradi Celsius reus, sospendere il pellet risultante in 25 microlitri della soluzione anticorpale. Incubare la sospensione cellulare per due ore a temperatura ambiente su un agitatore.

Quindi aggiungere 300 microlitri di tampone pon direttamente ai campioni, quindi lavare le sospensioni cellulari due volte nelle stesse condizioni di centrifuga. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 25 microlitri di anticorpo secondario e quindi incubare le cellule per un'ora a temperatura ambiente al buio. Quindi, dopo aver lavato le cellule altre due volte con un tampone saponina, sospendere nuovamente il pellet e 500 microlitri di tampone di lavaggio per l'analisi citofluorimetrica.

In questa figura vengono mostrate le NPC H incapsulate e la matrice pura, le cellule crescono in sfere, strutture densamente impacchettate dove il diametro delle sfere può arrivare fino a diverse centinaia di micron tra le sfere. I fasci di processi accumulati dalle cellule possono essere osservati come indicato dalle frecce bianche. Sebbene le singole cellule possano essere difficilmente riconosciute, le cellule incapsulate in matrice pura integrata con laminina crescono in strutture meno dense e sono distribuite in modo più omogeneo come si vede in questa figura, le singole cellule possono anche essere riconosciute in aree meno dense come indicato dalle frecce nere Qui, le NPC H si sono differenziate per quattro giorni in laminato integrato con colorazione verde pur Matrixx per l'espressione del marcatore neuronale.

È dimostrato che la beta tre tubulina valuta la percentuale di cellule positive. Il numero totale di cellule può essere determinato enumerando i nuclei cellulari colorati qui in blu con dappy. Questa micro fotografia rappresenta la proiezione completa di una pila Z di immagini scattate con un microscopio a fluorescenza.

Le cellule rilasciate dalla matrice possono essere nuovamente posizionate, ad esempio, sui vetrini coprioggetti come mostrato in questa figura per ulteriori studi funzionali. Questa micro fotografia mostra le cellule coltivate in 3D dopo essere state sottoposte alla procedura di rilascio precedentemente menzionata e coltivate per tre giorni. La colorazione per la tubulina beta tre in rosso rivela una morfologia paragonabile alle cellule ospitate nello scaffold 3D utilizzando cellule non colorate come controllo negativo.

Il GA qui rappresentato come il riquadro nero è stato impostato per la successiva analisi delle cellule positive alla tubulina beta tre in questo diagramma a punti, le cellule positive appaiono all'interno del riquadro nero nella parte destra dell'asse x e la popolazione intermedia nel riquadro tratteggiato e molto probabilmente rappresentano anche detriti cellulari. In questa figura finale viene mostrato un confronto tra il conteggio manuale delle cellule e l'enumerazione mediante citometria a flusso. Una percentuale molto più elevata di cellule positive può essere rilevata mediante analisi citofluorimetrica, come indicato dai quadrati neri aperti, quindi può essere tipicamente enumerata mediante conteggio manuale, come indicato dai triangoli neri solidi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare metriche scadenti per la coltivazione di MPC edge in scaffold 3D e come rilasciare le cellule dallo scaffold per gli analizzatori citometrici a flusso.