Name: Genotipizzazione di campioni di piante e degli animali, senza purificazione del DNA Prima (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Impara la genotipizzazione diretta di campioni vegetali e animali senza purificazione del DNA. Questo metodo di PCR diretta riduce tempi e costi, semplificando l'analisi genetica in biologia molecolare.

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Per i campioni di Arabidopsis e gli interessati primer PCR ringraziamo il professor Jaakko Kangasjärvi e il suo gruppo, il gruppo lo stress delle piante, Biologia Vegetale, Dipartimento di Bioscienze, Università di Helsinki. Gli esperimenti con il metodo tradizionale sono state condotte dalla signora Airi Lamminmäki. Campioni di topo transgenico sono stati forniti dal Dr. Jaana Vesterinen, Istituto di Biomedicina / Biochimica, Università di Helsinki. Harris Uni-Core e Tappetino da taglio Harris sono marchi di Shunderson Communications Inc. Tutti gli altri marchi sono di proprietà di Thermo Fisher Scientific Inc. e delle sue controllate.

1. Genotipizzazione delle persone pianta di Arabidopsis con protocollo diretto <ol><li> Per iniziare la genotipizzazione dCAPS dosaggio direttamente sulla foglia pianta Arabidopsis, prima formulare 20 o 50 ul reazioni PCR utilizzando l&#39;impianto Phire diretto PCR Kit come descritto in Tabella 1. </li><li> Quindi, tagliare da 0,50 mm da un pugno foglia della pianta Arabidopsis con il Harris Uni-Core e Tappetino da taglio Harris. Tenendo il nemico con forza, premere il all&#39;avanguardia nel tessuto e ruotare il nemico avanti e indietro. </li><li> Premere lo stantuffo per espellere il disco pugno in una miscela di reazione PCR. Assicurarsi che il campione cade nella soluzione di PCR e non aderisce alle pareti del tubo. </li><li> Pulire il bordo tagliente del perforatore tra ciascun campione per evitare la contaminazione incrociata immergendolo in soluzione al 2% NaClO. Premere lo stantuffo su e giù un paio di volte e pulire il bordo di taglio con un tovagliolo di carta pulito. Il tappeto di taglio dovrebbe esseresciacquati tra i campioni. </li><li> Successivamente, impiegano un Thermo Scientific Piko 24 ben Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko piastra PCR effettuare le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte nella Tabella 2. Le reazioni di PCR può essere eseguita anche in termociclatori convenzionali PCR termici. </li><li> Dopo la PCR, centrifugare il materiale vegetale. Trasferire 5 ml di surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 4 ml di acqua e 1 ml di enzima di restrizione, SspI. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. Incubare la miscela di reazione per un&#39;ora a 37 ° C. Inattivare l&#39;enzima di restrizione incubando a 65 ° C per 20 min. </li><li> Quando amplificazione del DNA direttamente dai tessuti vegetali, i prodotti di PCR sono componenti di impianti e PCR-derivata che possono interferire con la digestione con enzimi di restrizione. Pertanto, potrebbe essere necessario diluire o (ad esempio 1:2 o 1:3 in acqua) o purificare il prodotto PCR prima tegli digestione successiva, ad esempio utilizzando un apposito kit commerciale come Thermo Scientific Purification Kit GeneJET PCR. </li><li> Seguendo enzimi di restrizione, analizzare i frammenti risultanti su un gel di agarosio. Aggiungere 2,5 ml di tampone di caricamento 5x alla reazione ed eseguire elettroforesi su gel di agarosio con 10 microlitri della miscela risultante. </li></ol> 2. Amplificare frammenti specifici di DNA da Oak 15 anni, lascia utilizzando il protocollo di diluizione <ol><li> Per cominciare, tagliare un pugno 2 mm di foglia di quercia. </li><li> Mettere il campione in 20 ml di tampone di diluizione fornito con il kit di Phire impianto diretto PCR. Pulire la punta di diamante del perforatore e taglio tappetino come prima. </li><li> Macinare il campione in foglia con una punta di 100 microlitri pipetta premendo brevemente contro la parete del tubo. A seconda del materiale vegetale, il protocollo di diluizione volte funziona meglio senza schiacciare il campione. </li><li> Spin i campioni brevemente in una microcentrifuga fino a tegli reazioni sono in fondo dei tubi. </li><li> Il supernatante può essere utilizzato direttamente nel PCR, oppure può essere diluito 1:10 o 1:100 in acqua sterile a seconda del tipo di campione. Usare 0,5 microlitri a 1 microlitri di supernatante o diluizione come modello per una reazione di 20 microlitri PCR. Preparare la reazione, come descritto in Tabella 1. </li><li> Una volta che le reazioni sono preparati, impiegano un Thermo Scientific Piko 24 ben Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko piastra PCR effettuare le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte nella Tabella 2. Le reazioni di PCR può essere eseguita anche in termociclatori convenzionali PCR termici. </li><li> Dopo la PCR, aggiungere 5 ml di tampone di caricamento 5x alla reazione ed eseguire elettroforesi su gel di agarosio con 15 microlitri della miscela risultante. </li></ol> 3. Genotipizzazione di topi transgenici che utilizzano il protocollo di diluizione <ol><li> Iniziare il protocollo di diluizione su topi transgenici ponendo un punzone 2 mm del morecchio Ouse in 20 ml di tampone di diluizione contenente 0,5 ml di additivo DNARelease fornito con il tessuto degli animali diretta Kit PCR Phire. </li><li> Incubare i campioni a temperatura ambiente per 2 min, seguito da 2 minuti di incubazione a 98 ° C. </li><li> Centrifugare i campioni brevemente in una microcentrifuga finché le reazioni sono in fondo dei tubi. </li><li> Usare 1 ml di surnatante come modello per una reazione di 20 microlitri PCR, preparato come descritto in Tabella 3. Qualsiasi supernatante che non deve essere utilizzato subito può essere trasferito in una nuova provetta e conservati a -20 ° C. </li><li> Successivamente, impiegano un Thermo Scientific Piko 24 ben Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko piastra PCR effettuare le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di ciclo descritte in Tabella 4. Ancora una volta, le reazioni di PCR può essere eseguita anche in termociclatori convenzionali PCR. </li><li> Seguendo PCR, aggiungere 5 ml di tampone di caricamento 5x alla reazione ed eseguire l&#39;elettroforesi su gel di agarosio with 15 microlitri della miscela risultante. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Nella tecnica dCAPS il sito di restrizione all&#39;interno del SNP di interesse o è introdotto o distrutto usando un primer PCR con uno o più mismatch al DNA bersaglio. Genotipizzazione di individui pianta di Arabidopsis è stata effettuata con la tecnica dCAPS direttamente dai punzoni foglia. I prodotti amplificati sono stati digeriti ed i frammenti risultanti rivelano il genotipo di ciascun individuo sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel (Figura 2). In questo esempio, i prodotti di PCR 160 bp contenente il sito SNP di interesse (G o A allele) nel genoma Arabidopsis sono stati amplificati dai punzoni pianta a foglia con il Kit Phire impianto diretto PCR. Il primer forward conteneva Uno alla estremità 3 &#39;, creando un SspI specifico sito di restrizione del DNA bersaglio, che comprendeva l&#39;SNP di interesse (allele A) ma nonin altri allele del SNP (Figura 2B). Protocolli di diluizione sono necessari per il materiale vegetale impegnativi, come la foglia di quercia, grazie alla sua elevata concentrazione di composti fenolici. Utilizzando il protocollo di diluizione qui descritto, il frammento di 297 bp di DNA è stato amplificato utilizzando cloroplastica il 3-step protocollo. Campioni foglia di quercia con diluizioni diverse sono mostrati in figura 3, in aggiunta ai controlli positivi e negativi. L&#39;animale Phire Tissue diretto PCR Kit è stato impiegato con un protocollo impegnativo dove è stato usato un solo set di primer per l&#39;amplificazione di due frammenti con una differenza di grandi dimensioni, con conseguente raccolti abbondanti di entrambi i prodotti correttamente dimensionati di 1500 bp per topi transgenici e 200 bp per sorci di tipo selvatico (Figura 4). La fascia più debole superiore con topi eterozigoti è a causa della concorrenza di entrambi i modelli (alleli) per la coppia di primer stesso, tuttavia, la Genotypzione i risultati sono inequivocabili. La stabilità dei campioni preparati utilizzando il protocollo di diluizione è stato anche testato. I risultati mostrano che i campioni di diluizione possono essere conservati a -20 ° C per almeno un anno. Inoltre, i ripetuti cicli gelo / disgelo non ha influenzato significativamente la reazione (Figura 5). È anche illustrato l&#39;amplificazione robusta da campioni di tessuto dell&#39;orecchio di topo usando DNA polimerasi Phire e il metodo diretto PCR rispetto a Taq polimerasi hot start e DNA purificato (Figura 6). <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componenti </td><td fo:width=".75in"> Reazione di 20 microlitri </td><td fo:width=".75in"> Reazione di 50 microlitri </td><td fo:width=".75in"> Conc. finale. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Aggiungi a 20 pl </td><td> aggiungere a 50 microlitri </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Impianto PCR Buffer </td><td> 10 pl </td><td> 25 pl </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A </td><td> X pl </td><td> X pl </td><td> 0,5 micron </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> X pl </td><td> X pl </td><td> 0,5 micron </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA polimerasi </td><td> 0,4 pl </td><td> 1 ml </td><td></td></tr><tr><td> Campione / Direct Protocol </td><td></td><td> 0,50 millimetri pugno </td><td></td></tr><tr><td> Campione / diluizione protocollo </td><td> 0,5-1 pl </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1.<html> Le condizioni di reazione per PCR pianta utilizzata in questo protocollo. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Fase del ciclo di </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tempo </td><td fo:width=".4in"> Cicli </td></tr><tr><td> Denaturazione iniziale </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturazione Ricottura * Estensione </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Estensione finale </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min tenere </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Condizioni bicicletta relativi alle centrali di PCR utilizzato in questo protocollo. * Il calcolatore di Tmoscientific.com / pcrwebtools &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools è consigliato quando la determinazione del Tm per primer da utilizzare con Phire DNA polimerasi Hot Start II. La temperatura consigliata ricottura per primer ≤ 20 nt è pari a inferiore alla Tm proposta dal WebTool. Per primer&gt; 20 nt, utilizzare una temperatura di ricottura 3 ° C superiore alla Tm inferiore in WebTool. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componenti </td><td fo:width=".75in"> Reazione di 20 microlitri </td><td fo:width=".75in"> Conc. finale. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Aggiungi a 20 pl </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Animal Tissue PCR Buffer </td><td> 10 pl </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A </td><td> X pl </td><td> 0,5 micron </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> X pl </td><td> 0,5 micron </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA polimerasi </td><td> 0,4 pl </td><td></td></tr><tr><td> Campione / diluizione protocollo </td><td> 1 ml </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Condizioni di reazione per PCR tessuti animali utilizzati in questo protocollo. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Fase del ciclo di </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tempo </td><td fo:width=".4in"> Cicli </td></tr><tr><td> Denaturazione iniziale </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturazione Ricottura * Estensione </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Estensione finale </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min Tenere </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Condizioni in bicicletta per il tessuto PCR animale utilizzati in questo protocollo. * Il calcolatore Tm a <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> è consigliato quando la determinazione del Tm per primer da utilizzare con Phire DNA polimerasi Hot Start II. La temperatura consigliata ricottura per primer ≤ 20 nt è pari alla minore Tm in WebTool. Per primer&gt; 20 nt, utilizzare una temperatura di ricottura 3 ° C superiore alla Tm inferiore in WebTool. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. PCR diretta workflow. Diretto PCR può essere effettuata utilizzando due protocolli alternativi. Nel protocollo diretto una piccola quantità di campione viene aggiunto direttamente al PCR reazione. Il protocollo di diluizione impiega una breve fase di pre-incubazione prima della PCR per rilasciare DNA dal materiale campione. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Genotipizzazione di individui di piante di Arabidopsis con tecnica dCAPS direttamente dai punzoni foglia. A) La figura 2A mostra il principio del dosaggio dCAPS eseguita. Il sito di restrizione all&#39;interno del SNP di interesse o è introdotto o rimosso mediante PCR usando un primer con uno o più mismatch al DNA bersaglio. I prodotti di PCR vengono digeriti e i frammenti risultanti rivelano il genotipo di ciascun individuo se analizzato mediante elettroforesi. B) 0.50 punzoni mm a partire da foglie delle piante sono state poste direttamente in 50 pl reazioni PCR. I prodotti di PCR 160 bp contenente il sito SNP (G o A allele) sono state amplificate con primer introdurre un sito unico SspI A-allele. I prodotti PCR erano purificati digestioneta con l&#39;enzima di restrizione SspI. Frammenti risultanti sono stati analizzati su un gel di agarosio al 3%. Corsia M è il marcatore di formato; corsie A e G corrispondono alle alleli SNP di ciascun campione. I risultati ottenuti sono stati confermati mediante analisi convenzionale di estrazione di DNA seguita da PCR e digestione di restrizione (dati non mostrati). Le reazioni di controllo negativo senza DNA stampo sono stati inclusi nella prova impostare ed eseguire su un gel di agarosio separata in parallelo con le reazioni reali PCR prima di eseguire le digestioni (dati non mostrati). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Figura 3. Protocollo di diluizione usando campioni di foglie di quercia. Il protocollo di diluizione è stato usato per amplificare il frammento di 297 bp di DNA cloroplastica in campioni di foglie di quercia (3-step protocollo, annealing a 62 ° C) a varie diluizioni (1:100, 1:10, 1 : 1 e 2:1) e con positivo e negativotrolli [C +: controllo positivo da DNA purificato (Arabidopsis),-C: controllo negativo senza DNA template]. La nomenclatura campione rappresenta il sito di raccolta del campione (città in Finlandia) e il campione di numerazione. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Genotipizzazione di topi transgenici con una coppia di primer utilizzando il protocollo di diluizione. Tessuti dell&#39;orecchio di nove singoli topi (corsie 1-9) sono stati posti in 20 ml di tampone di diluizione compresi Additivo DNARelease. Dopo incubazione a temperatura ambiente e 98 ° C, 1 ml di surnatante è stato utilizzato come stampo nella reazione di 20 microlitri PCR. Frammento dimensioni: 1,500 bp (transgenici) e 200 bp (tipo selvatico). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Campioni preparati secondo il protocollo di diluizione sono stabili allo stoccaggio a lungo termine. Campioni di tessuti dell&#39;orecchio topo erano inc<html> ubated in 20 pl di tampone di diluizione compresi Additivo DNARelease e sottoposto a ripetuti di congelamento / scongelamento (corsia 1), conservato a -20 ° C per un anno (corsia 2), o usato immediatamente per PCR (corsia 3). Le dimensioni dei frammenti amplificati sono stati 900 bp, 1500 bp e 3200 bp. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Phire Animal Tissue PCR diretta Kit supera un sistema commerciale di purificazione del DNA combinato con un caldo inizio Taq DNA polimerasi. Quattro ampliconi (0,5-1,5 kb) sono stati amplificati da tessuti dell&#39;orecchio del mouse utilizzando il protocollo di diluizione di Animal Tissue Phire Kit Direct PCR. Per confronto, il DNA è stato purificato usando un kit commerciale di estrazione del DNA e gli stessi frammenti sono stati amplificati usando un hot start Taq DNA polimerasi secondo le raccomandazioni del produttore. Solo con l&#39;animale Phire Tissue diretto PCR Kit sono stati tutti e quattro gli ampliconi con successo amplificati. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Confronto universale del flusso di lavoro con stima dei tempi / reagenti consumati. Thermo Scientific diretto approccio PCR è rispetto all&#39;approccio isolamento del DNA, l&#39;approccio tampone di estrazione, e l&#39;approccio tampone PCR. Il tempo previsto per ogni approccio prima della fase di PCR è elencato in rosso. Il Thermo Scientific diretto approccio PCR richiede solo 0-4 min per la preparazione del campione prima della PCR. Sotto ogni metodo, i reagenti consumati sono elencati. Il Thermo Scientific diretto approccio PCR utilizza la minor quantità di reagenti rispetto agli altri metodi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

<ol><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li>
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Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Thermo Fisher Scientific, Inc.

L&#39;approccio diretto PCR ha dimostrato qui permette l&#39;amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di campioni non purificati, riducendo il tempo necessario e la semplificazione del flusso di lavoro per piante e animali genotipizzazione (Figura 7). Dimostrato anche qui è l&#39;uso del protocollo di diluizione in combinazione con l&#39;approccio diretto PCR (Figura 3). Il protocollo di diluizione è raccomandato con campioni difficili (ad esempio foglie delle piante di età, specie di piante che contengono composti interferenti) o lunghi (o GC-ricchi) ampliconi. Questo protocollo è particolarmente utile quando si inizia un nuovo esperimento diretto PCR, consentendo l&#39;ottimizzazione della reazione. Il protocollo può servire come strumento per risolvere le difficoltà occasionali come basse rese di prodotto a causa di differenze di materiale tissutale e / o primer utilizzati. Inoltre, durante l&#39;esecuzione di reazioni multiple dallo stesso campione, l&#39;utilizzo del protocollo di diluizione assicura l&#39;intero campione non è consumata in unoreazione. Per purificare il DNA dalle piante per PCR, la convenzione era effettuare la lisi cellulare seguito da isolamento del DNA utilizzando vari componenti che potrebbero interferire con l&#39;analisi PCR 8. Per impianti particolarmente impegnative, con elevato contenuto fenolico, aggiunta di polivinilpirrolidone è stata tradizionalmente utilizzata per rimuovere i composti che si legano al DNA dopo lisi cellulare 2,5. Come evidente qui, questi complicati e intensità passi possono essere evitati mediante utilizzo dell&#39;impianto Phire diretto PCR Kit per rilevare il DNA bersaglio. Lisi cellulare e la procedura di isolamento del DNA può essere omesso utilizzando le tecniche dCAPS sensibili direttamente da foglie di piante di Arabidopsis (Figura 2). Come dimostrato qui, il protocollo di diluizione gestisce efficacemente la presenza di componenti problematici che possono interferire con PCR (Figura 3). Tradizionalmente, un prerequisito per gli animali genotipizzazione era isolatisu di DNA genomico da tessuti animali attraverso un tossico, lungo processo caratterizzato da una lunga incubazione con proteinasi K per digerire tessuto cutaneo e connettivo, seguita da estrazione con solvente organico, precipitazione alcol, e le fasi di centrifugazione 6,9,10. Come dimostrato qui, la semplificazione di questo processo è realizzato attraverso l&#39;uso del Animal Phire Tissue diretto PCR Kit, permettendo topi transgenici da genotipizzare senza purificazione DNA prima (Figura 4). L&#39;esempio illustrato in questo articolo è particolarmente importante in quanto solo una serie di primer è stata usata per l&#39;amplificazione dei due frammenti con una differenza di grandi dimensioni. Nonostante difficoltà innata del protocollo, l&#39;uso del metodo diretto PCR in combinazione con il protocollo semplice diluizione provocato alte rese dei due prodotti di PCR (Figura 4). PCR-based rilevazione del DNA bersaglio ha molte applicazioni nel campo della ricerca, tra cui analisi del genotipo per identificareil ruolo dei geni nello sviluppo, fisiologia e patologia. A causa della tolleranza inibitore delle DNA polimerasi specializzate, i protocolli possono essere completata in un tempo minimo senza purificazione DNA prima.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Phire Pianta diretto PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 reazioni (50 microlitri ciascuna) </td></tr><tr><td> Phire Animal Tissue PCR diretta Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 microlitri ciascuno) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,35 mm (rosa) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180S / L </td><td> Qtà: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0.50 mm (blu) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Qtà: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris taglio Mat 6,4 × 7,6 centimetri </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Qtà: 5 </td></tr><tr><td> SspI </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 pl (100 reazioni) </td></tr><tr><td> Piko 24 Well termociclatore </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24 pozzetti Piko Piastre PCR </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Purification Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 prep 250 prep </td></tr></tbody></table>

genotipizzazione di campioni di piante e degli animali, senza purificazione del dna prima

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

L&#39;approccio diretto PCR facilita amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di campioni non purificati, ed è dimostrata qui per i diversi impianti e tessuti animali (Figura 1). Diretto PCR si basa sulla appositamente progettato Thermo Scientific Phusion e DNA polimerasi Phire, che includono un doppio filamento dominio di legame del DNA che conferisce loro proprietà uniche come alta tolleranza di inibitori. PCR-based rilevazione del DNA di destinazione dispone di numerose applicazioni nella ricerca sulle piante, tra cui l&#39;analisi e la verifica dell&#39;impianto genotipo dei transgeni. PCR dai tessuti vegetali comporta tradizionalmente una prima fase di isolamento del DNA, che può richiedere reagenti costosi o tossici. Il processo richiede tempo e aumenta il rischio di contaminazione incrociata 1, 2. Al contrario, utilizzando Thermo Scientific Phire Pianta diretto PCR Kit DNA bersaglio può essere facilmente rilevato, senza previa estrazione del DNA. Nel modello mostrato qui, unesempio di derivato spaccati analisi di sequenza polimorfico amplificato (dCAPS) 3,4 è effettuata direttamente da foglie delle piante di Arabidopsis. dCAPS saggi di genotipizzazione può essere utilizzato per identificare polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) da SNP allele-specifica digestione con endonucleasi di restrizione 3. Alcuni campioni vegetali tendono ad essere più difficile quando si utilizzano metodi diretti PCR quanto contengono componenti che interferiscono con PCR, come composti fenolici. In questi casi, un ulteriore passaggio per rimuovere i composti è sempre richiesto 2,5. Qui, questo problema viene superato usando un protocollo di diluizione semplice e veloce seguita da Direct amplificazione PCR (Figura 1). Quindici anni foglie di quercia sono utilizzati come modello per le piante impegnative come il campione contiene elevate quantità di composti fenolici tra cui tannini. Trasferimento genico in topi è ampiamente utilizzato per studiare il ruolo dei geni in development, fisiologia e patologia umana. L&#39;uso di questi animali richiede screening per la presenza del transgene, di solito con PCR. Tradizionalmente, questo comporta un dispendio di tempo passo isolamento del DNA, in cui il DNA per l&#39;analisi PCR è purificata da tessuti orecchio, coda o punta 6,7. Tuttavia, con il Thermo Scientific Tissue Phire animali diretti PCR Kit topi transgenici possono essere genotipizzati senza previa purificazione del DNA. In questo protocollo topo transgenico genotipizzazione è ottenuta direttamente da tessuti dell&#39;orecchio topo, come dimostrato qui per un esempio impegnativo dove viene utilizzato un solo set di primer per l&#39;amplificazione di due frammenti di dimensioni notevolmente differenti.

L&#39;approccio qui presentato PCR diretta facilita amplificazione PCR direttamente da piccole quantità di piante non purificato e tessuto animale.

Genotipizzazione di campioni di piante e degli animali, senza purificazione del DNA Prima

L'approccio della PCR diretta facilita l'amplificazione tramite PCR direttamente da piccole quantità di campioni non purificati, e viene qui dimostrato per diverse piante e ...

L'obiettivo generale di questo video è dimostrare tre esempi di amplificazione mediante PCR direttamente da piccole quantità di campioni non purificati, inclusi tessuti vegetali e animali. La PCR diretta può essere eseguita utilizzando due protocolli alternativi. Nel protocollo diretto, una minima quantità di campione non purificato viene aggiunta direttamente alla reazione di PCR, mentre il protocollo di diluizione richiede un breve passaggio di pre-incubazione prima della PCR per rilasciare il DNA dal materiale campione.Nel primo esempio, il genotipaggio di arabidopsis viene effettuato utilizzando il protocollo diretto. Un sito di restrizione specifico per un allele viene introdotto nel DNA bersaglio, quindi vengono identificati polimorfismi del singolo nucleotide specifici per l'allele a seguito della digestione con endonucleasi di restrizione. Successivamente, il protocollo di diluizione viene impiegato per amplificare inizialmente frammenti specifici di DNA da foglie di quercia di 15 anni, e quindi per eseguire direttamente il genotipaggio di topi transgenici a partire dal tessuto auricolare murino.In tutti e tre gli esempi, l'amplificazione del DNA viene ottenuta senza alcun passaggio di purificazione del campione prima della PCR, grazie al metodo della PCR diretta. Il principale vantaggio della PCR diretta rispetto ai metodi tradizionali consiste nell'assenza della necessità di estrazione o purificazione del DNA. Ciò si traduce in un risparmio sia di tempo che di costi.Iniziare l'analisi delle sequenze polimorfiche amplificate e clivate derivate o il saggio di genotipizzazione decaps formulando prima reazioni PCR da 20 o 50 microlitri utilizzando il kit PCR diretto per piante come descritto nel protocollo scritto. Successivamente, tagliare un campione di 0,50 millimetri da una foglia di pianta di Arabidopsis utilizzando il puncher Harris Uni unicorn e il tappetino da taglio, tenendo saldamente il puncher. Premere il bordo tagliente nel tessuto e ruotare il puncher avanti e indietro.Premere lo stantuffo per espellere il disco perforato in una miscela di reazione PCR. Assicurarsi che il campione cada nella soluzione PCR e non aderisca alle due pareti. Per evitare contaminazioni incrociate nel protocollo diretto, è fondamentale utilizzare il metodo corretto per la pulizia dello strumento di campionamento.Pulire il bordo tagliente dello puncher tra ogni campione immergendolo in una soluzione di ipoclorito di sodio al 2%. Premere l'asticella su e gi&ugrave; alcune volte e asciugare il bordo tagliente con un tovagliolo di carta pulito. Anche il tappetino da taglio deve essere risciacquato tra un campione e l'altro.Successivamente, utilizzare un termociclatore Pico da 24 pozzetti e una piastra PCR per eseguire le reazioni di PCR utilizzando le condizioni di termociclaggio descritte nel testo accompagnatorio a questo video. Dopo la PCR, centrifugare il materiale vegetale. Trasferire cinque microlitri del soprannatante in un nuovo tubo da microcentrifuga dopo l'aggiunta di quattro microlitri di acqua. Aggiungere un microlitro dell'endonucleasi di restrizione SSP1, mescolare delicatamente e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto sul fondo del tubo.Incubare la miscela di reazione per un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente, inattivare l'enzima di restrizione incubando a 65 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo la digestione con l'enzima di restrizione, aggiungere 2,5 microlitri di buffer di caricamento 5x alla reazione.Eseguire un'analisi mediante elettroforesi su gel di aros caricando 10 microlitri della miscela ottenuta nel gel. Per iniziare, tagliare un campione di due millimetri di foglia di quercia. Posizionare il campione in 20 microlitri di tampone di diluizione fornito con il kit di PCR diretta per piante.Pulire il bordo tagliente della punzonatrice e del tappetino di taglio come in precedenza, quindi schiacciare il campione di foglia con la punta di una pipetta da 100 microlitri premendola brevemente contro la parete del tubo. Centrifugare brevemente i campioni in un microcentrifugatore fino a far scendere le reazioni in fondo ai tubi. Il soprannatante può essere utilizzato direttamente nella PCR oppure può essere diluito da uno a 10 o da uno a 100 in acqua sterile.A seconda del tipo di campione, utilizzare da 0,5 a 1 microlitro di soprannatante o diluizione come stampo per una reazione PCR da 20 microlitri. Impostare le reazioni come descritto nel protocollo scritto. Una volta preparate le reazioni, utilizzare il termociclatore PICO a 24 pozzetti e la piastra PCR per eseguire le reazioni PCR usando le condizioni di termociclaggio descritte nel testo.Dopo la PCR, aggiungere cinque microlitri di buffer di carico 5x alla reazione ed eseguire un'elettroforesi su gel agarosio con 15 microlitri della miscela ottenuta. Iniziare il protocollo di diluizione per il genotipaggio dei topi transgenici posizionando un punch di due millimetri di tessuto auricolare del topo in 20 microlitri di buffer di diluizione contenente 0,5 microlitri di additivo per il rilascio del DNA fornito insieme al kit per tessuto animale. Incubare i campioni con il kit Direct PCR a temperatura ambiente per due minuti, seguiti da un'incubazione di due minuti a 98 gradi Celsius.Dopo aver centrifugato i campioni, utilizzare un microlitro di sopranatante come stampo per una reazione PCR da 20 microlitri. Eventuali quantitativi di sopranatante non utilizzati immediatamente possono essere trasferiti in una nuova provetta e conservati a meno 20 gradi Celsius. Come passaggio finale, si utilizza un termociclatore a 24 pozzetti e una piastra PCR per eseguire le reazioni PCR secondo le condizioni di termociclaggio indicate nella procedura scritta. Dopo la PCR, aggiungere cinque microlitri di buffer di carico 5x alla reazione ed eseguire un’elettroforesi su gel aros con 15 microlitri della miscela ottenuta nella tecnica D caps. Il sito di restrizione all’interno del polimorfismo a singolo nucleotide di interesse viene introdotto o eliminato mediante un primer PCR contenente uno o più appaiamenti non corrispondenti al DNA bersaglio.In questo esempio, i prodotti di PCR di 160 paia di basi contenenti il sito di snip di interesse dell'allele g o a nel genoma di arabidopsis sono stati amplificati da campioni di foglie vegetali utilizzando il kit di PCR diretta per piante FirePlant. Il primer diretto presentava un mismatch all'estremità 3' che creava un sito di restrizione specifico per l'enzima SS P uno nel DNA bersaglio, sito presente nell'allele A ma non nell'altro allele del snip. I prodotti di PCR non purificati sono stati digeriti con l'enzima di restrizione SS P uno e i frammenti risultanti sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel agarosio; le corsie g e a corrispondono agli alleli di snip di ciascun campione.In questa immagine, i prodotti PCR integri si trovano a sinistra mentre i frammenti digeriti sono a destra. I protocolli di diluizione sono necessari per materiali vegetali difficili, come la foglia di quercia, a causa della loro elevata concentrazione di composti fenolici, utilizzando il protocollo di diluizione qui descritto. Il frammento di 297 paia di basi di DNA del cloroplasto è stato amplificato mediante un protocollo in tre fasi.Vengono mostrati campioni di foglie di quercia con diverse diluizioni, oltre ai controlli positivi e negativi. Il kit di PCR diretta da tessuto animale per incendio &egrave; stato utilizzato per l'amplificazione di due frammenti con una notevole differenza di dimensione, impiegando un solo set di primer, ottenendo rese abbondanti di entrambi i prodotti della dimensione corretta: 1500 paia di basi per i topi transgenici e 200 paia di basi per i topi di tipo selvatico. La banda superiore pi&ugrave; debole nei topi eterozigoti &egrave; dovuta alla competizione tra i due templati per lo stesso ripristino del primer.Tuttavia, i risultati del genotipaggio sono inequivocabili. È stata inoltre testata la stabilità dei campioni preparati utilizzando il protocollo di diluizione. I risultati mostrano che i campioni diluiti sottoposti a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento e quelli conservati a meno 20 gradi Celsius per almeno un anno erano paragonabili ai campioni utilizzati immediatamente per la PCR. Per testare ulteriormente le prestazioni di questa procedura, quattro ampliconi sono stati amplificati a partire da tessuti auricolari di topo utilizzando il protocollo di diluizione del kit di PCR diretta da tessuti animali freschi.A scopo di confronto, il DNA è stato inizialmente purificato utilizzando un kit commerciale di estrazione del DNA e gli stessi frammenti sono stati amplificati mediante una DNA polimerasi hot start tac secondo le raccomandazioni del produttore; solo con il kit di PCR diretta per tessuti di animali da fuoco, tuttavia, tutti e quattro gli ampliconi sono stati amplificati con successo. La PCR diretta è particolarmente utile negli studi di genotipizzazione che richiedono l'amplificazione di un elevato numero di campioni. L'omissione del passaggio di purificazione del DNA può ridurre significativamente il tempo necessario per eseguire l'esperimento. Questa tecnica offre inoltre vantaggi aggiuntivi, riducendo il rischio di contaminazione e preservando materiale campione prezioso.

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