Name: Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) per High-throughput screening farmaco antifungino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Scopri il metodo Ca BChip per lo screening ad alto rendimento di farmaci antifungini contro biofilm di Candida albicans. Questa piattaforma microarray offre profili di suscettibilità confrontabili con i metodi convenzionali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato in parte da finanziamenti della Texas South Management Technology (POCrr 2009,041), l&#39;Istituto per l&#39;integrazione di Medicina e Scienza dal Centro Risorse Nazionale per la Ricerca (UL 1RR025767), e dal National Institute of Dental Research &amp; craniofacciale ( 5R21DE017294).

1. Preparazione dei vetrini funzionalizzati <ol><li> Collocare i vetrini in un rack scorrevole estraibile, e lavare due volte immergendolo in una vaschetta di colorazione contenente 99% di etanolo (grado istologico). Pulire le diapositive pulire con tovaglioli di carta (assicurando di non generare polvere di carta), e asciugare con un getto di gas azoto compresso. </li></ol> NOTA: non utilizzare Kim-Wipes per pulire le diapositive in quanto genererebbe polveri sottili di carta. <ol start="2"><li> Immergere il rack diapositiva contenente i vetrini in una vaschetta di colorazione piena di acido solforico concentrato e incubare a temperatura ambiente per una notte. </li></ol> NOTA: per evitare il contatto con la pelle, usare guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali protettivi mentre si lavora con acidi concentrati e prodotti chimici tossici e corrosivi. <ol start="3"><li> Sonicare i vetrini per 30 min e lavare con Milli-Q (18 mQ) acqua per 30 minuti, seguite con un altro lavaggio in unoCetona per 5 min. Questo trattamento espone i gruppi silanolici sulla superficie del vetro. </li><li> Ricoprire i vetrini puliti con 2,5% (vol / vol in acqua) di 3-amminopropiltrietossisilano (APTES) soluzione, immergendo il portavetrini in APTES per 30 minuti, lavando 3 volte in acqua Milli-Q per 15 minuti ogni lavaggio, e cottura i vetrini in un forno a 110 ° C per 15 min. Cottura consente reticolazione delle APTES, con conseguente-NH2-funzionalizzazione della superficie. </li></ol> NOTA: la soluzione APTES in un contenitore di plastica in quanto i depositi APTES preferenzialmente sulle pareti del contenitore in vetro. <ol start="5"><li> Utilizzando un rivestitore a rotazione, rivestimento i vetrini con 1% (peso / volume in toluene) Polistirene-co-anidride maleica (MA-PS) (Sigma) per ottenere un mono-strato di rivestimento idrofobo 6. Aggiungere 2,0 ml di PS-MA su un vetrino pulito montato su un rivestitore a rotazione e mantello a 3.000 rpm per 30 s. Queste condizioni possono variare a seconda dei parametri di spin di rivestimento come rivestimento cosìluzione, substrato, spessore del rivestimento e governata dalla seguente equazione 7 </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> dove h è lo spessore della pellicola di rivestimento, e è il tasso di evaporazione, η, C e ρ sono viscosità, la concentrazione e la densità della soluzione di rivestimento, rispettivamente, ed ω è la velocità angolare. NOTA: toluene è nocive per inalazione per lungo tempo e l&#39;uso di una cappa aspirante è raccomandato. <ol start="6"><li> Le slide possono essere memorizzati in un rack scorrevole fino ad un mese secco, privo di polvere condizioni a 2 - 8 ° C. </li></ol> 2. Preparazione degli inoculi Lievito e Encapsulation Collagene <ol><li> Preparare una coltura di una notte di C. albicans ceppo SC5314, in lievito Peptone destrosio [YPD; 10 g / L di estratto di lievito, 20 g / L e peptone 20 g / L destrosio] mezzo liquido inoculando una singola colonia di C. albicans in 10 - 20 mL di YPD 8. Incubare cultura in un agitatore orbitale (circa 150 - 200 rpm) a 30 ° C per una notte. Harvest 1 mL Candida albicans cellule di lievito da overnight colture YPD (per centrifugazione a 5.000 rpm per 5-10 minuti) e si lavano due volte per 10 min in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS; tampone fosfato 10 mM, 2,7 mM di cloruro di potassio, cloruro di sodio 137 mM, pH 7,4) (Sigma) per lavaggio. Harvest lavato anche cellule per centrifugazione a 1900 rpm per 10 minuti. Risospendere le cellule lavate in 1 mL di tampone di ricostruzione (0,2 N NaOH con soluzione di bicarbonato di sodio 2,2% (peso / vol) e 4,8% (peso / vol) HEPES, pH 7,2). </li></ol> NOTE: C. albicans è un microrganismo Group Risk 1/BSL1. Ricordate sempre di usare buone tecniche asettiche / sterile per il lavoro con questo microrganismo e seguire le procedure istituzionali per il corretto smaltimento dei materiali a rischio biologico. <ol start="2"><li> Contare le cellule utilizzando un hemocytOmeter su un microscopio a campo chiaro e regolare ad una densità cellulare di 5 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Ulteriori diluire la sospensione dieci volte mediante aggiunta di 10 × RPMI-1640 integrato con L-glutammina e tamponata con morpholinepropanesulfonic (MOPS) acido (pH 7,2). </li><li> Incapsulare le cellule di lievito in collagene mescolando la sospensione cellulare in RPMI-1640 con collagene (1,8 mg / mL) (tipo 1 di coda di ratto, BD Biosciences, Bedford, MA), per ottenere una concentrazione finale di 4 x 10 6 cellule / mL. Mantenere il collagene-sospensione cellulare su ghiaccio per impedire la gelificazione del collagene prima della stampa. </li></ol> 3. Preparazione di Ca BChip <ol><li> Pulire e disinfettare tutte le superfici di micro-distributore, tra cui la fonte piastra stazione di lavaggio e la stazione di vuoto, slide piatto vuoto e camera di stampa, pulendo con isopropanolo al 70%. </li><li> Posizionare e tenere sotto vuoto il numero desiderato di PS-MA-rivestite vetrini sul ponte scorrevole del microfonoroarrayer. </li><li> Vortex la sospensione cellulare in collagene vigorosamente e aspirare 100 pl di ben miscelato sospensione in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, appena prima della stampa. Posizionare questa piastra fonte nella stazione di carico. </li><li> Accendere l&#39;umidificatore per mantenere una umidità relativa del 100% nella camera microarray durante il processo di stampa. </li><li> Stampa 50 nL di sospensione di cellule in una matrice di 48 righe e 16 colonne con punti distanziati di 1,2 mm di distanza utilizzando un microarray spotter (Omnigrid Micro, Inc. Digilab, Holliston, MA) da parte di non-contatto con la deposizione conica coniche 190 consigli orifizio ceramica micron (Digilab). </li><li> Prime, risciacquare e asciugare, aspirare le punte per due volte dopo ogni ciclo di stampa. </li><li> Subito dopo la stampa, posizionare il vetrino in un a tenuta d&#39;aria, camera umidificata (cassette ibridazione, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) e incubare a 37 ° C per 24 ore per consentire la formazione di biofilm. </li></ol> 4. Test di sensibilità di PrI biofilm eformed a Ca BChip contro gli agenti antifungini <ol><li> Dalle soluzioni di borsa o polvere di farmaci antifungini, preparare una soluzione di lavoro in RPMI-1640. Tipiche concentrazioni massime della soluzione di lavoro sono 1.024 ug / mL per il fluconazolo e 16 ug / mL per amfotericina B 5. Altre concentrazioni possono essere utilizzati per diversi agenti. </li><li> Preparare otto differenti concentrazioni del composto diluendo la soluzione madre in due diluizioni, coprono una gamma con la stima IC 50 del composto nel mezzo. </li><li> Dopo 24 ore di crescita biofilm, utilizzare il micro-distributore per stampare 50 nL di otto differenti concentrazioni dei farmaci, insieme positivo (cioè senza cellule farmaci nei mezzi solo) e negativo (trattato con ipoclorito di sodio per 20 min) controlli, in almeno sei repliche in cima alle biofilm. </li></ol> NOTA: Mantenere una umidità relativa del 100% per impedire l&#39;essiccamento delle macchie mentre addMOZIONE farmaci. <ol start="4"><li> Subito dopo l&#39;aggiunta dei farmaci, incubare il chip con i farmaci in una camera umidificata a 37 ° C per 24 ore. </li><li> Lavare i farmaci fuori dal dunking il CaBChip 3-5 volte per 2 minuti ogni volta in PBS e macchia incubando il BChip Ca con 0,5 pM FUN1 a 37 ° C per 30 min 9. </li><li> Lavare la macchia da inzuppare il BChip Ca 3-5 volte in PBS per 1-3 min ogni dunk, e asciugare la BChip Ca utilizzando un flusso di azoto. Per saperne di intensità di fluorescenza utilizzando uno scanner microarray (GenePix 4100A, Axon Instruments, CA) ad una lunghezza d&#39;onda di 532 nm con un guadagno di 380 PMT. </li><li> Impostare l&#39;intensità di fluorescenza del controllo positivo (nessun farmaco) e morti (candeggina trattati) macchie biofilm al 100% e 0%, rispettivamente. </li><li> Determinare l&#39;inibizione percentuale di riduzione della intensità di fluorescenza (F) rispetto alla media dei punti di controllo utilizzando la seguente equazione </li></ol><img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> dove F, F e F max o sono prime intensità di fluorescenza di farmaco-trattato, no-farmaco di controllo e trattati con macchie di candeggina, rispettivamente. Le impostazioni dello scanner sono stati adeguati per ottenere C max e F o di 30000 e 4000 RFU, rispettivamente. <ol start="9"><li> Calcolare la concentrazione inibitoria del 50% o IC 50 inserendo la variabile dell&#39;equazione Hill pendenza utilizzando software Prism GraphPad (La Jolla, CA). </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Un rappresentante Ca BChip, costituito da una matrice 48 × 16 di nano-biofilm di C. albicans, è mostrato in Figura 2. La microscopia in campo chiaro mostra una caratteristica architettonica complessiva del nano-biofilm. La digitalizzazione delle immagini al microscopio elettronico della mostra biofilm che le ife fungine sono incorporati nella matrice difibre collagene, che sono circa 2 um e 100 nm di diametro, rispettivamente. Le FUN1 macchiate di immagini di microarray scanner mostrano il lievito e le forme ife, che sono caratteristiche dei biofilm fungine. Le immagini 2D-e 3D-fluorescenza confocale di FUN1 macchiate biofilm può essere visto nelle eterogeneità spaziale, con regioni di cellule metabolicamente attive intercalati nella matrice extracellulare (composto di collagene come il materiale inglobante e probabilmente anche di materiale exopolymeric prodotto dalla cellule biofilm), che non è macchiate di colorante metabolica. Lo spessore del biofilm è stata stimata essere di circa 50 um. Il BChip Ca è stato utilizzato per stimare la suscettibilità di due farmaci antifungini, fluconazolo e amfotericina B, ed i risultati sono mostrati nella Figura 3. Coerentemente con rapporti pubblicati su standard di settore da 96 saggi e piastra, i biofilm sono resistenti contro il fluconazolo 10 e il calcolato IC 50 per<html> amfotericina B è pari a 0,3 mg / ml 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso per la fabbricazione di Ca BChip. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> Figura 2. Un&#39;immagine ad alta thoughput Ca BChip, stampato utilizzando un micro-distributore robotizzato e contenente 768 punti su PS-MA rivestite con diapositive. Ogni spot emisferica è di 50 nL in volume, circa 700 micron di diametro, e con distanza di 1,2 millimetri tra le macchie. Altri prodotti (in senso orario) sono microscopia ottica, scanner microarray, microscopia 2D-e 3D-fluorescenza, e la scansione di immagini al microscopio elettronico dei biofilm individuali sul BChip Ca. La figura SEM ad alto ingrandimento di 25.000 x mostra un filamento ifale larghezza di 2 micron. Figura 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Risultati dei test di sensibilità antifungina e determinazione dei valori di IC 50 per (A) fluconazolo e (B) amfotericina B usando Ca BChip. Le immagini al microscopio a fluorescenza di amfotericina B-trattati biofilm sono mostrati in (C). I risultati sono media ± errore standard significa per due chip separati contenenti 10 repliche per ogni condizione.

<ol><li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals%3A+a+three-year+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li>
<li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li>
<li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li>
<li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li>
<li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans%3A+Development%2C+architecture%2C+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li>
<li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+biofilms+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li>
<li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+activity+of+amphotericin+B%2C+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li>
</ol>

Jose L. Lopez-Ribot e Anand K. equità Ramasubramanian proprio in MicrobeHTS Technologies, Inc., che sta sviluppando agenti antifungini. MicrobeHTS Technologies, Inc. ha fornito alcun sostegno finanziario per questi studi.

Abbiamo sviluppato un cell-based ad alta densità microarray, Ca BChip, costituito da volumi nanolitri biofilm di Candida albicans. Il microarray è stata stampata su substrati di vetro modificato, che ha consentito per il fissaggio solido di spot gel di collagene, fornendo idrofobicità necessaria per un non-diffusione, gel emisferica 3D. Un singolo Ca BChip può sostituire circa otto piastre a 96 pozzetti, e chip diversi possono essere stampati e trattati allo stesso tempo. Il chip utilizza nano...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 3-amminopropiltrietossisilano (APTES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440140 </td></tr><tr><td> Polistirene-Co-anidride maleica (PS-MA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 426946 </td></tr><tr><td> Microscopia diapositive di vetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> Coda di tipo Rat collagene I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Robotic micro-distributore </td><td> Omnigrid Micro </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> Microarray Scanner </td><td> GenePix Personal 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> Ibridazione Cassette </td><td> ArrayIt Corporation </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> FUN1 [2-clororo-4-(2,3-diidro-3-metil-(benzo -1,3-tiazol-2-il)-metilidene)-1-fenil quinoliniumiodide] </td><td> Invitrogen Corp. </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> Fluconazolo </td><td> Sicor Pharmaceuticals, Inc. </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> Amfotericina B </td><td> Sigma </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 50-020-PC </td></tr><tr><td> Ceramic Tip 190 micron orifizio </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> GraphPad Prism Software </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> GenePix Pro V4.1 </td><td> Molecular Devices </td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (ca bchip) per high-throughput screening farmaco antifungino

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans rimane il principale agente eziologico della candidosi, che attualmente rappresenta la quarta più comune infezione nosocomiale sangue negli ospedali degli Stati Uniti 1. Queste infezioni opportunistiche rappresentano una crescente minaccia per un numero crescente di individui compromessi, e portare i tassi di mortalità eccessivamente elevati. Ciò è in parte dovuto al limitato arsenale di farmaci antifungini, ma anche alla comparsa di resistenza agli agenti antifungini più comunemente usati. A complicare ulteriormente trattamento è il fatto che una maggioranza di manifestazioni di candidosi sono associati con la formazione di biofilm, e le cellule all&#39;interno di questi biofilm mostrano livelli aumentati di resistenza agli clinicamente più utilizzati agenti antifungini 2. Qui si descrive lo sviluppo di una alta densità microarray che consiste di C. albicans nano-biofilm, che abbiamo chiamato Ca BChip 3. Brevemente, un micro-distributore robotico viene utilizzato to lievito cellule stampa di C. albicans su una substrato solido. Durante la stampa, le cellule di lievito sono racchiusi in una matrice tridimensionale usando un volume basso quanto 50 nL e immobilizzato su un substrato di vetro con un idoneo rivestimento. Dopo la stampa iniziale, le diapositive vengono incubate a 37 ° C per 24 ore per consentire per sviluppo biofilm. Durante questo periodo le macchie crescere in pienamente sviluppati &quot;nano-biofilm&quot; che visualizzare tipici caratteristiche strutturali e fenotipica associati con mature C. albicans biofilm (complessità vale a dire morfologica, tre l&#39;architettura dimensionale e resistenza ai farmaci) 4. Complessivamente, il BChip Ca è composto di ~ 750 biofilm equivalenti e spazialmente distinto; con il vantaggio supplementari che chip multipli può essere stampato e elaborati contemporaneamente. La vitalità cellulare è stimato misurando l&#39;intensità fluorescente di FUN1 metabolica macchia utilizzando un scanner microarray. Questo chip fungina è l&#39;ideale per use in vero high-throughput screening per la scoperta di nuovi farmaci antifungini. Rispetto agli standard attuali (cioè il 96-well modello piastra microtitolo della formazione di biofilm 5), i principali vantaggi del chip biofilm fungine sono automazione, miniaturizzazione, risparmi nei costi e quantità dei reagenti e dei tempi di analisi, nonché l&#39;eliminazione di lavoro operazioni intensive. Noi crediamo che il chip in modo significativo ad accelerare il processo di scoperta di nuovi farmaci antifungini.

Abbiamo sviluppato una piattaforma ad alta densità microarray costituito da nano-3D di biofilm<em&gt; C. albicans</em&gt; Chiamato<em&gt; Ca</em&gt; BChip. Il profilo suscettibilità di farmaci testati su una<em&gt; Ca</em&gt; BChip è paragonabile a quello tradizionale a 96 pozzetti modello di piastra, suggerendo che il chip funghi è ideale per una vera high-throughput screening di farmaci antifungini.

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) per High-throughput screening farmaco antifungino

Candida albicans rimane il principale agente eziologico della candidosi, che attualmente rappresenta la quarta infezione nosocomiale più comune del flusso sanguigno...

L'obiettivo generale di questa procedura è sviluppare un saggio ad alto rendimento basato su microarray per lo screening di biofilm finalizzato alla scoperta di farmaci antifungini. Questo risultato si ottiene innanzitutto modificando chimicamente la superficie di vetrini da microscopio. Successivamente, le cellule di lievito vengono incapsulate in una matrice di collagene.Quindi, un chip biofilm di Candida albicans o un chip CAB viene preparato utilizzando un microarray robotizzato. Infine, la suscettibilità ai farmaci viene stimata mediante il chip CAB. In definitiva, un saggio di vitalità eseguito con uno scanner per microarray mostra il profilo di suscettibilità dei farmaci antifungini nei confronti dei biofilm nanoformati su un chip CAB.Il principale vantaggio di questa tecnica basata su microarray rispetto ai metodi esistenti, come la piastra standard industriale da 9 0 6 pozzetti, è che si tratta di un vero e proprio sistema ad alto rendimento. È rapido, robusto, utilizza un volume operativo ridotto e permette di risparmiare tempo. Per preparare le lamelle funzionalizzate, iniziare posizionando le lamelle in un porta-lamelle rimovibile. Lavare le lamelle due volte immergendo

candida-albicans-biofilm-chip-cabchip-for-high-throughput-antifungal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

In questo video ci dimostra come il nostro laboratorio passaggi di routine RIFLESSI embrionali umane linee di cellule staminali con tripsina.

RIFLESSI Passaging sulle cellule staminali embrionali umane-linee con tripsina

Descriviamo un metodo semplice, rapido e robusto per la formazione...

A 96 Beh microtest piastra a base di Metodo per la Formazione di monitoraggio e test di suscettibilità antifungini Candida albicans Biofilm

Questo video dimostra lo sviluppo di un modello murino in vivo per studiare la formazione di biofilm di Candida albicans nel tessuto sottocutaneo. L'esperimento prevede l'impianto di dispositivi infetti da Candida nella regione posteriore dell'animale per lo sviluppo del biofilm.

Candida albicans Formazione di biofilm in un modello murino in vivo

Presentiamo una procedura sperimentale di sviluppo del biofilm di Candida albicans in un modello sottocutaneo murino. I biofilm fungini sono stati quantificati determinando il numero di unità formanti colonie e mediante un imaging a bioluminescenza non invasivo, in cui la quantità di luce prodotta corrisponde al numero di cellule vitali.

Candida albicans Biofilm sviluppo sulla medicalmente rilevanti Foreign Bodies in un mouse sottocutaneo modello seguito da Bioluminescence Imaging

Questo protocollo descrive l'uso di un dispositivo microfluidico automatico personalizzabile per visualizzare la formazione di biofilm in Candida albicans in condizioni fisiologiche host.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Descriviamo l'assembly, operazione, e la pulizia di un apparato di flusso progettato per formazione di biofilm fungine di immagine in tempo reale mentre sotto flusso. Inoltre forniamo e discutere algoritmi quantitativi da utilizzare sulle immagini acquisite.

Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo

Qui, presentiamo un protocollo per valutare il risultato dell'applicazione di luce rossa sulla crescita di biofilm di Candida albicans . Un dispositivo di luce rossa non coerente con la lunghezza d'onda di 635 nm e densità di energia di 87,6 J·cm-2 è stato applicato durante la crescita di Candida albicans biofilm per 48 h.

Quotidiano fototerapia con luce rossa per sviluppo di Biofilm di regolare dei albicans del Candida

Per visualizzare e quantificare le caratteristiche interne dei biofilm Candida albicans, prepariamo campioni intatti fissi che vengono chiariti dalla corrispondenza dell'indice di rifrazione. Quindi, la microscopia ottiva di sezionamento può essere utilizzata per ottenere dati immagine tridimensionali attraverso l'intero spessore del biofilm.

Chiarire e imaging Candida albicans Biofilms

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere dati quantitativi sull'attività antifungina di peptidi e altri composti, come agenti antifungini a piccole molecole, contro la Candida albicans. Il suo uso della densità ottica piuttosto che contare le unità formanti colonie per quantificare l'inibizione della crescita consente di risparmiare tempo e risorse.

Quantificare l'attività antifungina dei peptidi contro la Candida albicans

Un protocollo basato su piastre di microtitolazione a 96 pozzetti che utilizza un saggio di riduzione di 2,3-bis(2-metossi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carbossilide-2H-tetrazolio (XTT) è descritto nel presente documento, per studiare gli effetti degli anticorpi sui biofilm formati da C. tropicalis. Questo protocollo in vitro può essere utilizzato per verificare l'effetto di potenziali nuovi composti antifungini sull'attività metabolica delle cellule della specie Candida nei biofilm.

Un saggio di riduzione solubile a base di tetrazolio per valutare l'effetto degli anticorpi sui biofilm di Candida tropicalis

Stabiliamo un modello murino di infezione correlata al catetere (CRI) associata a C.albicans, in cui si forma un biofilm sul catetere e l'interazione tra C.albicans e l'ospite è ben correlata con l'IRC clinico. Questo modello aiuta a selezionare le terapie per l'IRC associato al biofilm di C.albicans , gettando le basi per la trasformazione clinica.

Un modello di infezione da Candida albicans correlato al catetere nel topo

Scopri il metodo Ca BChip per lo screening ad alto rendimento di farmaci antifungini contro biofilm di Candida albicans. Questa piattaforma microarray offre profili di suscettibilità confrontabili con i metodi convenzionali.

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) per High-throughput screening farmaco antifungino

Esplora altri video