Uso di un terreno dell'espettorato artificiale per testare l'efficacia degli antibiotici contro Pseudomonas aeruginosa In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

Lo scopo di questo esperimento è quello di valutare l'efficacia di antibiotici contro i biofilm di pseudomonas Aerogen, in condizioni, rappresentative di infezioni croniche nel polmone della fibrosi cistica utilizzando un mezzo di espettorato artificiale definito. I biofilm batterici vengono coltivati in 24. Piastre per microtitolazione del pozzo.

I biofilm vengono quindi esposti agli antibiotici. Successivamente, le colture trattate con antibiotici vengono interrotte utilizzando la cellulasi e incubate con un colorante metabolico srin, che viene ridotto dal blu al rosa dalle cellule vitali. Misurando l'assorbanza dei pozzetti, è possibile determinare la concentrazione inibitoria minima delle cellule di Cecile nel biofilm di B-S-M-I-C per quantificare la suscettibilità agli antibiotici in condizioni quasi fisiologiche.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la determinazione delle concentrazioni minime inibitorie basate sulla coltura planctonica, è che i batteri crescono in un terreno specializzato contenente tutti i componenti dell'espettorato, favorendo così la formazione di biofilm. Questi biofilm sono molto più resistenti agli antibiotici. Per preparare il terreno, preparare prima due bottiglie contenenti 250 millilitri di acqua sterile nella prima bottiglia.

Aggiungere gradualmente l'agitazione e poi aggiungere quattro grammi di sperma di pesce, DNA a 250 millilitri di acqua sterile. Mescolare la soluzione a temperatura ambiente e lasciare che il DNA si sciolga nella seconda bottiglia. Aggiungere gradualmente cinque grammi di mucina di tipo due dallo stomaco suino e mescolare.

Una volta che le soluzioni di DNA e mucina sono pronte, sciogliere gli amminoacidi in 100 millilitri di acqua sterile, ad eccezione della L-tirosina e della L-cisteina, che devono essere sciolte rispettivamente in 25 millilitri di acqua, o 25 millilitri di idrossido di potassio 0,5 molari. Successivamente, produce 5,9 milligrammi di DTPA, cinque grammi di cloruro di sodio e 2,2 grammi di cloruro di potassio in 100 millilitri di acqua. Unire tutte le diverse soluzioni in una bottiglia da un litro, quindi aggiungere cinque millilitri di emulsione di tuorlo d'uovo e guarnire il composto fino a 850 millilitri con acqua.

Utilizzando un triss molare, regolare il pH a 6,9 e portare il volume finale fino a un litro con acqua per sterilizzare il terreno, filtrarlo utilizzando una pompa per vuoto a due diaframmi di marca ME e un'unità di filtraggio superiore stereo Millipore con collo da 45 millimetri e dimensione dei pori di 0,2 micron. Il processo di filtrazione può essere eseguito nell'arco di due giorni. Il mezzo A SM può essere conservato a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese.

Iniziare diluendo le colture notturne di pseudomona arosa in terreno LB per ottenere un OD di 0,05. Quindi diluire ulteriormente i batteri da uno a 100 in una piastra media SM, 1,8 millilitri per pozzetto di coltura batterica diluita in 21 pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti aliquote dello stesso volume di un terreno SM nei tre pozzetti rimanenti, che serviranno come controlli negativi in bianco. Fissare la piastra a 24 pozzetti con biofilm e, per consentire la formazione di biofilm, posizionarla in condizioni di microerrore, che possono essere ottenute utilizzando pacchetti di generazione di gas Campi gen in grandi barattoli anaerobici.

Incubare la coltura su uno shaker impostato a 75 RPM per tre giorni a 37 gradi Celsius dopo tre giorni, i biofilm appariranno come una massa gelatinosa contenente cellule batteriche e non possono essere interrotti dal pipettaggio. Una volta che i biofilm si sono formati a 200 microlitri per pozzetto di antibiotico a concentrazioni diluite in serie. Assicurarsi di impostare almeno quattro repliche per ogni concentrazione di farmaco da testare e lasciare quattro pozzetti contenenti biofilm non trattati in modo che possano essere utilizzati come controlli negativi.

Quindi incubare le piastre in precedenza per altre 24 ore dopo l'incubazione con antibiotici. Utilizzare 100 microlitri per pozzetto di cellulasi da diluire a 100 milligrammi per millilitro in tampone citrato per disgregare i biofilm, incubare le piastre su uno shaker impostato a 150 giri/min in condizioni aerobiche a 37 gradi Celsius per un'ora. Seguendo questo manuale di incubazione, il pipettaggio può essere utilizzato per disaggregare ulteriormente i biofilm se sono visibili grumi di cellule nel terreno.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di rezina per pozzetto per quantificare la vitalità delle cellule rilasciate dai biofilm e incubare le cellule per una o due ore. A 37 gradi Celsius, solo le cellule vitali sono in grado di metabolizzare il colorante zarina blu nella sua forma rosa fluorescente. Dopo l'incubazione, trasferire i campioni in una piastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza dei pozzetti utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di cinque 40 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di cinque 90 nanometri.

Al fine di quantificare la vitalità batterica e la suscettibilità ai farmaci, in primo luogo, sottrarre la fluorescenza di fondo del controllo in bianco dagli altri pozzetti. Successivamente, calcolare la percentuale di inibizione dividendo la fluorescenza media per ciascuna concentrazione per la fluorescenza media dei controlli non trattati e moltiplicando per 100. Il B-S-M-Y-C è definito come la concentrazione di antibiotico che causa un'inibizione del 90% dell'attività metabolica, come mostrato in queste cellule di micrografie elettroniche, cresciute in biofilm, differiscono notevolmente dai batteri cresciuti in colture planctoniche.

In particolare, grandi quantità di matrice extracellulare mostrate in giallo circondano le cellule nel biofilm in verde, ma non nelle colonie planctoniche. Inoltre, i batteri nei biofilm sono in genere più resistenti agli antibiotici in questo esperimento. La concentrazione inibitoria minima di tobramicina per la coltura planctonica di pseudomonas aerogen in blu è stata determinata in circa quattro microgrammi per millilitro.

Al contrario, come mostrato in rosso, il 100% dei batteri nei biofilm è sopravvissuto fino a 512 microgrammi per millilitro di antibiotico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare i batteri in un mezzo di espettorato artificiale definito. Dovresti anche essere in grado di eseguire un test di sensibilità agli antibiotici per determinare la concentrazione inibitoria minima richiesta per inibire la crescita batterica in un ambiente più realistico al polmone della fibrosi cistica.