Name: Uso di un terreno dellespettorato artificiale per testare lefficacia degli antibiotici contro Pseudomonas aeruginosa In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Scopri come testare l'efficacia degli antibiotici contro i biofilm di Pseudomonas aeruginosa utilizzando un terreno dell'espettorato artificiale. Questo metodo riproduce le condizioni polmonari della fibrosi cistica per studiare la resistenza antimicrobica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Riconosciamo l&#39;appoggio del Regno Unito Istituto Nazionale per la Ricerca sulla Salute, il Dr. Hadwen Trust per la ricerca umanistici, della britannica leader di finanziamento carità di ricerca medica senza animali esclusivamente tecniche di ricerca per sostituire gli esperimenti su animali, e il Wellcome Trust (Grant 089.215). Riconosciamo inoltre Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (educazionale di sovvenzione).

<ol><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li>
<li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li>
<li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+testing+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+and+clinical+response+to+parenteral+antibiotic+administration%3A+lack+of+association+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis.</a> Chest. 123, 1495-1502 (2003).</li>
<li>Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcolony+formation%3A+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).</li>
<li>Garbe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+JG024%2C+a+pseudomonas+aeruginosa+PB1-like+broad+host+range+phage+under+simulated+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions.</a> BMC Microbiol. 10, 301(2010).</li>
<li>Naughton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AES-1+exhibits+increased+virulence+gene+expression+during+chronic+infection+of+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung.</a> PLoS One. 6, e24526(2011).</li>
<li>Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pseudomonas+biofilm+susceptibilities+to+assign+simulated+antibiotic+regimens+for+cystic+fibrosis+airway+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).</li>
<li>Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oxygen+limitation+on+the+in+vitro+antimicrobial+susceptibility+of+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa+grown+planktonically+and+as+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).</li>
<li>Bjarnsholt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+the+respiratory+tract+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients.</a> Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).</li>
<li>Hill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+susceptibilities+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+derived+from+patients+with+cystic+fibrosis+under+aerobic%2C+anaerobic%2C+and+biofilm+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).</li>
<li>Fung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+mucin-containing+synthetic+growth+medium+mimicking+cystic+fibrosis+lung+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum.</a> J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).</li>
<li>Rybtke, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Allergy+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).</li>
<li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).</li>
<li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rapid+and+simple+non-radioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes%3A+an+alternative+to+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).</li>
<li>Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+antibiotic+treatment+on+bacteriophage+production+by+a+cystic+fibrosis+epidemic+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).</li>
<li>Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum-sensing+signals+indicate+that+cystic+fibrosis+lungs+are+infected+with+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms.</a> Nature. 407, 762-764 (2000).</li>
<li>Mowat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+Aeruginosa+Population+Diversity+and+Turnover+in+Cystic+Fibrosis+Chronic+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care.+Med%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).</li>
<li>Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+phenotypes+and+genotypes+within+populations+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+cystic+fibrosis+lung+during+pulmonary+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations.</a> J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).</li>
<li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li>
<li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li>
<li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

In questo studio abbiamo utilizzato un nuovo modello in vitro sulla base di ASM per replicare P. biofilm condizioni aeruginosa all&#39;interno del polmone CF 4. Il modello è stato modificato con successo per la piccola, high-throughput test di agenti antimicrobici. I passaggi critici di questo test sono: <ol><li> Preparazione costante dei mezzi di comunicazione ASM e sterilità mantenimento. Abbiamo dedicato lunghe ore per ottimizzare il modo in cui viene aggiunto ogni componente di ottenere risultati riproducibili ogni volta. Filtrazione della ASM è lento, ma è preferibile alla sterilizzazione in autoclave, che può danneggiare il componente mucina. Noi non consigliamo l&#39;aggiunta di antibiotici, come suggerito da altri 11, perché questo può comportare notevoli pressioni selettive, mutazioni di unità, indurre la lisi profago 16 e altera in modo significativo l&#39;espressione di più geni batterici. </li><li> Il dosaggio deve essere ottimizzata in base al volume of ASM utilizzato. Shaking velocità sono aumentati per i minori volumi e di un biofilm più breve ciclo di vita si osserva. </li></ol> Un&#39;applicazione evidente del modello di piccola scala biofilm ASM è la determinazione più realistica di suscettibilità biofilm BSMIC antimicrobici (90). Nicchie anaerobici e microaerofili sono presenti nel polmone CF e vi sono prove che l&#39;ossigeno è limitata nel profondo del biofilm maturo 2, 17. Qui si dimostra che 10/14 clinica P. aeruginosa isolati da pazienti Sputa CF presentano una notevole (4 - ≥ 128 volte) diminuzione della sensibilità alla tobramicina in condizioni microaerofili in ASM. I risultati di questo studio suggeriscono che antibiotici, come tobramicina, potrebbero essere meno efficaci contro P. aeruginosa nei polmoni CF quelli indicati con i metodi convenzionali test di sensibilità. Questi risultati riflettono gli studi precedenti sulla sensibilità agli antibiotici di biofilm 10. Small-scala saggi ASM quindi fornire una piattaforma semplice, ad alto rendimento per la generazione di significativi dati di sensibilità agli antibiotici per informare meglio le decisioni terapeutiche. Il saggio è limitata nello stesso modo convenzionale test di sensibilità agli antibiotici in singole colonie che vengono prelevati per lo screening che non può essere rappresentativa della popolazione. Tuttavia, riteniamo che un approccio (i) con superficie di crescita non collegato biofilm e (ii) applicabile alle condizioni microaerofili, rappresenta un&#39;alternativa chiara e un potenziale miglioramento dei metodi esistenti. Concludiamo che questo test è un modello adeguato per lo studio P. aeruginosa biofilm popolazioni. Ulteriori test in ambito clinico sarebbe verificare se suscettibilità agli antibiotici basata su biofilm cresciuti P. aeruginosa potrebbe portare a scelte diverse con antibiotici potenzialmente migliori esiti clinici e microbiologici. Indagini simili che utilizzano modelli di biofilm classici hanno dimostrato che i valori BSMIC portarealle raccomandazioni diverse per il trattamento antibiotico 5,17. Oltre al test per l&#39;efficacia delle agenti anti-infettivi, il sistema ASM rappresenta un buon mercato, un&#39;alternativa semplice e riproducibile per modelli animali per studi come quelli che mirano a comprendere la diversificazione delle P. aeruginosa popolazioni. Abbiamo osservato vasta eterogeneità nelle popolazioni naturali di P. aeruginosa recuperato dal paziente Sputa CF 18, 19. Simile la diversificazione fenotipica e genotipica può essere osservato durante la crescita in ASM 4 (ed i nostri dati non pubblicati), che lo rende un interessante modello in vitro delle condizioni polmonari CF. La relativa semplicità del modello ASM rende facile progettare esperimenti a lungo termine adattamento destinato, ad esempio, a monitorare gli effetti degli antibiotici o altre sollecitazioni su P. aeruginosa popolazione divergenza. Inoltre, altri patogeni batterici possono essere coltivate inASM. Ad esempio, Fouhy et al. ASM 2007 hanno utilizzato per studiare la formazione di biofilm da S. maltophillia 20.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DNA di sperma di pesce </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74782 </td></tr><tr><td> Mucin da suini allo stomaco, di tipo II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2378 </td></tr><tr><td> L-alanina </td><td> Acros Organics </td><td> 102830250 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5006 </td></tr><tr><td> L (+)-Asparagina monoidrato </td><td> Acros Organics </td><td> 175271000 </td></tr><tr><td> L (+)-acido aspartico </td><td> Acros Organics </td><td> 105041000 </td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td> Sigma-Adrich </td><td> 168149 </td></tr&gt; <tr><td> L (+)-acido glutammico </td><td> Acros Organics </td><td> 156211000 </td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Acros Organics </td><td> 220911000 </td></tr><tr><td> L-Istidina </td><td> Sigma-Adrich </td><td> H8000 </td></tr><tr><td> L-Isoleucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I2752 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L8000 </td></tr><tr><td> L (+)-Lisina monocloridrato </td><td> Acros Organics </td><td> 125222500 </td></tr><tr><td> L-metionina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9625 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> Acros Organics </td><td> 130310250 </td></tr><tr><td> L-prolina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380 </td></tr><tr><td> L-serina </td><td> Acros Organics </td><td> 132660250 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> Acros Organics </td><td> 138930250 </td></tr><tr><td> L (-)-Triptofano </td><td> Acros Organics </td><td> 140590250 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> Acros Organics </td><td> 140641000 </td></tr><tr><td> L-Valina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V0500 </td></tr><tr><td> L&#39;acido Diethylenetriaminepentaacetic </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 32318 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S/3160/60 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> BDH </td><td> BDH0258 </td></tr><tr><td&gt; KOH </td><td> BDH </td><td> BDH0262 </td></tr><tr><td> Emulsione di tuorlo d&#39;uovo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 17148 </td></tr><tr><td> ME 2 pompa a vuoto a membrana </td><td> Vacuubrand </td><td> 696126 </td></tr><tr><td> Steritop filtri (diametro dei pori: 0,22 micron, la dimensione del collo: 45 mm) </td><td> Millipore </td><td> SCGPT10RE </td></tr><tr><td> Luria-Bertani mezzo </td><td> Sigma </td><td> L2897 </td></tr><tr><td> 96 pozzetti microtitolazione piastre </td><td> Sarstedt </td><td> 82,1581 </td></tr><tr><td> 24 pozzetti di coltura di tessuti trattati con piastre </td><td> Iwaki </td><td> 3820-024 </td></tr><tr><td> CampyGen generazione di gas confezioni </td><td> Oxoid </td><td> CN0025 </td></tr><tr><td> Camera microaerofilo </td><td> Oxoid </td><td> HP0011 </td></tr><tr><td> Tobramicina solfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1783 </td></tr><tr><td> Cellulasi, da Aspergillus niger </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 22178 </td></tr><tr><td> Resazurina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 199303 </td></tr><tr><td> Citrate.H 2 0 </td><td> BDH </td><td> BDH0288 </td></tr><tr><td> Fluostar omega lettore di micropiastre </td><td> BMG-Labtech </td><td> SPECTROstar Omega </td></tr></tbody></table>

uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; in condizioni più rilevanti al polmone fibrosi cistica

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Vi è una crescente preoccupazione per la rilevanza dei test di sensibilità in vitro agli antimicrobici quando applicata a isolati di P. aeruginosa da fibrosi cistica (CF) pazienti. Metodi esistenti contare su uno o alcuni isolati coltivati ​​aerobicamente e planktonically. Predeterminate cut-off sono utilizzati per definire se i batteri sono sensibili o resistenti a qualsiasi antibiotico somministrato 1. Tuttavia, durante le infezioni polmonari croniche in CF, P. popolazioni aeruginosa esistono in biofilm e vi sono prove che l&#39;ambiente è in gran parte microaerofilo 2. La netta differenza di condizioni tra i batteri nel polmone e quelli durante i test diagnostici ha messo in discussione l&#39;affidabilità e la rilevanza anche di questi test 3. Media espettorato artificiale (ASM) è un terreno di coltura contenente i componenti di espettorato dei pazienti CF, tra cui aminoacidi, mucina e il DNA libero. P. aeruginosa &lt;/ Em&gt; Crescita in ASM crescita mimica durante le infezioni CF, con la formazione di auto-aggregazione di strutture biofilm e divergenza della popolazione 4,5,6. Lo scopo di questo studio era di sviluppare un microtitolazione-piastra di analisi per studiare sensibilità agli antibiotici di P. aeruginosa basata sulla crescita in ASM, che è applicabile a queste due condizioni microaerofili e aerobica. Un saggio di ASM è stato sviluppato in un formato micropiastra. P. biofilm aeruginosa sono stati lasciati sviluppare per 3 giorni prima dell&#39;incubazione con agenti antimicrobici a diverse concentrazioni per 24 ore. Dopo l&#39;interruzione biofilm, la vitalità cellulare è stata misurata mediante colorazione con resazurina. Questo test è stato utilizzato per accertare la sessile concentrazione minima inibitoria delle cellule (SMIC) di tobramicina per 15 differenti P. aeruginosa isolati in condizioni aerobiche e microaerofili SMIC ei valori sono stati confrontati con quelli ottenuti con brodo di crescita standard. Mentre non vi eraalcune prove per i valori di MIC maggiori per isolati coltivati ​​in ASM rispetto ai loro omologhi planctonici, le maggiori differenze sono state trovate con i batteri testati in condizioni microaerofili, che hanno mostrato una resistenza molto aumentata fino ad un&gt; 128 volte, verso tobramicina nel sistema ASM, quando rispetto ai saggi effettuati in condizioni aerobiche. La mancanza di associazione tra i metodi attuali test di sensibilità e risultati clinici ha messo in dubbio la validità dei metodi attuali 3. Vari modelli in vitro sono stati utilizzati precedentemente per studiare P. biofilm aeruginosa 7, 8. Tuttavia, questi metodi si basa su biofilm di superficie collegati, mentre i biofilm ASM simili a quelli osservati nel polmone CF 9. Inoltre, la concentrazione di ossigeno ridotto nel muco è stato dimostrato che alterano il comportamento di P. aeruginosa 2 e pregiudica la suscettibilità agli antibiotici 10. Pertanto using ASM in condizioni microaerofili può fornire un ambiente più realistico in cui studiare sensibilità agli antibiotici.

Current test diagnostici di sensibilità agli antibiotici si basa sulla crescita planctoniche di isolati in ricchi di nutrienti, le condizioni aerobiche. Qui, ci avvaliamo di un mezzo alternativo sputum artificiale per studiare sensibilità agli antibiotici di Pseudomonas aeruginosa biofilm sia in condizioni aerobiche e microaerofili più rappresentativi del polmone fibrosi cistica.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

Cresce la preoccupazione circa la pertinenza dei test di suscettibilità antimicrobica in vitro quando applicati a isolati di P. aeruginosa provenienti dalla fibrosi cistica...

Lo scopo di questo esperimento è valutare l'efficacia degli antibiotici contro i biofilm di Pseudomonas aeruginosa in condizioni rappresentative di infezioni croniche nel polmone affetto da fibrosi cistica, utilizzando un mezzo artificiale di catarro definito. I biofilm batterici vengono coltivati in piastre microtitolazione da 24 pozzetti.I biofilm vengono quindi esposti ad antibiotici. Successivamente, le colture trattate con antibiotici vengono disgregate utilizzando cellulasi e incubate con un colorante metabolico srin, che viene ridotto dalle cellule vitali da blu a rosa. Misurando l'assorbanza delle pozzette, è possibile determinare la concentrazione minima inibitoria delle cellule Cecile nel biofilm, o B-S-M-I-C, per quantificare la suscettibilità agli antibiotici in condizioni prossime a quelle fisiologiche.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la determinazione delle concentrazioni minime inibitorie basata su colture planctoniche, è che i batteri vengono coltivati in un terreno specifico contenente tutti i componenti dell'espettorato, favorendo così la formazione di biofilm. Questi biofilm sono molto più resistenti agli antibiotici. Per preparare il terreno, preparare innanzitutto due bottiglie contenenti 250 millilitri di acqua sterile nella prima bottiglia.Aggiungere gradualmente la miscela e poi aggiungere quattro grammi di DNA da sperma di pesce a 250 millilitri di acqua sterile. Mescolare la soluzione a temperatura ambiente e lasciare che il DNA si sciolga nel secondo flacone. Aggiungere gradualmente cinque grammi di mucina di tipo due proveniente dallo stomaco di suino e mescolare.Una volta pronte le soluzioni di DNA e mucina, sciogliere gli aminoacidi in 100 millilitri di acqua sterile, fatta eccezione per la L-tirosina e la L-cisteina, che devono essere sciolte rispettivamente in 25 millilitri di acqua o in 25 millilitri di idrossido di potassio 0,5 molare. Successivamente, sciogliere 5,9 milligrammi di DTPA, cinque grammi di cloruro di sodio e 2,2 grammi di cloruro di potassio in 100 millilitri di acqua. Unire tutte le diverse soluzioni in una bottiglia da un litro, quindi aggiungere cinque millilitri di emulsione di tuorlo d'uovo e portare il volume totale a 850 millilitri con acqua.Utilizzando un triss molare, regolare il pH a 6,9 e portare il volume finale a un litro con acqua. Per sterilizzare il mezzo, filtrarlo utilizzando una pompa da vuoto a doppio diaframma marca ME2 e un'unità filtrante Millipore Stereo Top con un collo da 45 millimetri e una dimensione dei pori di 0,2 micron. Il processo di filtrazione può essere eseguito nell'arco di due giorni. Il mezzo A SM può essere conservato a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese.Si inizia diluendo colture notturne di Pseudomona arosa nel mezzo LB per ottenere un OD di 0.05. Successivamente, diluire ulteriormente i batteri in rapporto 1:100 in una piastra con mezzo SM, aggiungendo 1,8 millilitri di coltura batterica diluita per pozzetto in 21 pozzetti di una piastra da coltura tissutale a 24 pozzetti; aliquotare lo stesso volume di mezzo SM nei tre pozzetti rimanenti, che fungeranno da controlli negativi in bianco. Sigillare la piastra a 24 pozzetti e, per consentire la formazione di biofilm, posizionarla in condizioni microaerofile, ottenibili utilizzando bustine generatrici di gas Campi Gen in barattoli anaerobici di grandi dimensioni.Incubare la coltura su un agitatore impostato a 75 RPM per tre giorni a 37 gradi Celsius; dopo tre giorni, i biofilm appariranno come una massa gelatinosa contenente cellule batteriche e non potranno essere interrotti mediante pipettaggio. Una volta formati i biofilm, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di antibiotico a concentrazioni serialmente diluite. Assicurarsi di preparare almeno quattro replicati per ciascuna concentrazione del farmaco da testare e lasciare quattro pozzetti contenenti biofilm senza trattamento, in modo che possano essere utilizzati come controlli negativi.Quindi incubare le piastre precedentemente per ulteriori 24 ore dopo l'incubazione con gli antibiotici. Utilizzare 100 microlitri per pozzetto di cellulasi diluita a 100 milligrammi per millilitro in tampone citrato per rompere i biofilm, quindi incubare le piastre su un agitatore impostato a 150 RPM in condizioni aerobiche a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine di questa incubazione, si può ricorrere a pipettaggio manuale per ulteriormente disgregare i biofilm qualora si osservino grumi di cellule nel mezzo.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di rezin per pozzetto per quantificare la vitalità delle cellule rilasciate dai biofilm e incubare le cellule per uno o due ore. A 37 gradi Celsius, solo le cellule vitali sono in grado di metabolizzare il colorante blu zarin nella sua forma rosa fluorescente. Al termine dell'incubazione, trasferire i campioni in una piastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza dei pozzetti utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 540 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nanometri.Per quantificare la vitalità batterica e la suscettibilità ai farmaci, sottrarre innanzitutto la fluorescenza di fondo del controllo vuoto dai pozzetti restanti. Successivamente, calcolare la percentuale di inibizione dividendo la fluorescenza media di ciascuna concentrazione per la fluorescenza media dei controlli non trattati e moltiplicando per 100. La B-S-M-Y-C è definita come la concentrazione dell'antibiotico che determina un'inibizione del 90% dell'attività metabolica, come mostrato in queste microfotografie elettroniche: le cellule cresciute in biofilm differiscono notevolmente dai batteri coltivati in colture planctoniche.In particolare, grandi quantità di matrice extracellulare mostrate in giallo circondano le cellule nel biofilm in verde, ma non nelle colonie planctoniche. Inoltre, i batteri nei biofilm sono tipicamente più resistenti agli antibiotici in questo esperimento. La concentrazione minima inibitoria di tobramicina per la coltura planctonica di pseudomonas aerogen in blu è stata determinata essere di circa quattro microgrammi per millilitro.Al contrario, come mostrato in rosso, il 100% dei batteri nei biofilm è sopravvissuto fino a 512 microgrammi per millilitro di antibiotico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare batteri in un mezzo artificiale di espettorato definito. Dovresti inoltre essere in grado di eseguire un test di suscettibilità agli antibiotici per determinare la concentrazione minima inibitoria necessaria per inibire la crescita batterica in un ambiente più realistico come quello del polmone affetto da fibrosi cistica.

use-artificial-sputum-medium-to-test-antibiotic-efficacy-against

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Vieira, J., et al. Progettazione e sviluppo di un modello per studiare l'effetto dell'ossigeno supplementare sul microbioma delle vie aeree della fibrosi cistica.  J. Vis. Exp. (2021).Questo video mostra la preparazione di un mezzo di espettorato artificiale che imita la viscosità, la composizione dei nutrienti e il pH dell'espettorato polmonare della fibrosi cistica. Il mezzo risultante fornisce una piattaforma fisiologicamente rilevante per gli studi ex vivo.

Preparazione di un terreno di espettorato artificiale per emulare la fibrosi cistica espettorato polmonare ex vivo

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

Le vie respiratorie del flusso mucoso di fibrosi cistica (CF) sono un ambiente ideale per i patogeni microbici a prosperare. Il manoscritto descrive un nuovo metodo per studiare il microbioma polmonare CF in un ambiente che imita dove provocano malattie e come le alterazioni delle condizioni chimiche possano guidare la dinamica microbica.

Il WinCF Modello - Un Microcosmo Economico e Tractable di un muco bronchiale Plugged per studiare la Microbiologia del polmone Infezioni

Descriviamo un protocollo per un modello di co-coltura tridimensionale di vie aeree infette, utilizzando CFBE41o- cellule, macrofagi THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, stabilito presso l'interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce una nuova piattaforma per testare simultaneamente l'efficacia antibiotica, la funzione della barriera epiteliale e i marcatori infiammatori.

P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

Questo protocollo fornisce metodi per la visualizzazione delle cellule batteriche e del polisaccaride del locus di sintesi dei polisaccaridi (Psl) all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica.

Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica

Questo flusso di lavoro può essere utilizzato per eseguire test di suscettibilità agli antibiotici utilizzando un modello ex vivo stabilito di biofilm batterico nei polmoni di individui con fibrosi cistica. L'uso di questo modello potrebbe migliorare la validità clinica dei test MBEC (concentrazione minima di eradicazione del biofilm).

Test di efficacia antibiotica in un modello ex vivo di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus Biofilms nel polmone della fibrosi cistica

Il mezzo espettorato della fibrosi cistica sintetica (SCFM2) può essere utilizzato in combinazione sia con la microscopia a scansione laser confocale che con lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per osservare aggregati batterici ad alta risoluzione. Questo documento descrive in dettaglio i metodi per valutare le popolazioni aggregate durante il trattamento antimicrobico come piattaforma per studi futuri.

Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa

L'obiettivo di questo protocollo è quello di sviluppare un sistema modello per l'effetto dell'iperossia sulle comunità microbiche delle vie aeree della fibrosi cistica.  Il mezzo espettorato artificiale emula la composizione dell'espettorato e le condizioni di coltura iperossica modellano gli effetti dell'ossigeno supplementare sulle comunità microbiche polmonari.

Progettazione e sviluppo di un modello per studiare l'effetto dell'ossigeno supplementare sul microbioma delle vie aeree della fibrosi cistica

Questo protocollo descrive un modello di biofilm polimicrobico a quattro specie rilevante per la fibrosi cistica (FC) polmonare che può essere utilizzato per esplorare l'impatto delle interazioni batteriche interspecie.

Crescita di un biofilm polimicrobico rilevante per la fibrosi cistica per sondare i fenotipi della comunità

Questa metodologia consente la creazione di un modello di biofilm polimicrobico nella fibrosi cistica per i test di sensibilità antimicrobica nei laboratori di ricerca e clinici. Questo modello fornisce risultati accurati e affidabili su una gamma di uscite.

Sviluppo di un modello di biofilm di colonia polimicrobica per testare gli antimicrobici nella fibrosi cistica

Questo studio delinea un quadro per lo sviluppo di un modello di biofilm polimicrobico aggregato e l'ottimizzazione di un protocollo di estrazione dell'RNA per valutare l'espressione genica di Pseudomonas aeruginosa che riflette l'ambiente polmonare della fibrosi cistica. Le applicazioni includono la valutazione degli effetti antimicrobici e lo studio di alternative antibiotiche in condizioni rilevanti per la fibrosi cistica.

Modello di biofilm aggregato per fibrosi cistica per studiare l'espressione genica rilevante per l'infezione

Scopri come testare l'efficacia degli antibiotici contro i biofilm di Pseudomonas aeruginosa utilizzando un terreno dell'espettorato artificiale. Questo metodo riproduce le condizioni polmonari della fibrosi cistica per studiare la resistenza antimicrobica.

Uso di un terreno dellespettorato artificiale per testare lefficacia degli antibiotici contro Pseudomonas aeruginosa In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica (Video) | JoVE Journal

Uso di un terreno dell'espettorato artificiale per testare l'efficacia degli antibiotici contro

Esplora altri video