Uso di un terreno dell'espettorato artificiale per testare l'efficacia degli antibiotici contro
5 giugno 2012
Current test diagnostici di sensibilità agli antibiotici si basa sulla crescita planctoniche di isolati in ricchi di nutrienti, le condizioni aerobiche. Qui, ci avvaliamo di un mezzo alternativo sputum artificiale per studiare sensibilità agli antibiotici di Pseudomonas aeruginosa biofilm sia in condizioni aerobiche e microaerofili più rappresentativi del polmone fibrosi cistica.
Lo scopo di questo esperimento è valutare l'efficacia degli antibiotici contro i biofilm di Pseudomonas aeruginosa in condizioni rappresentative di infezioni croniche nel polmone affetto da fibrosi cistica, utilizzando un mezzo artificiale di catarro definito. I biofilm batterici vengono coltivati in piastre microtitolazione da 24 pozzetti.
I biofilm vengono quindi esposti ad antibiotici. Successivamente, le colture trattate con antibiotici vengono disgregate utilizzando cellulasi e incubate con un colorante metabolico srin, che viene ridotto dalle cellule vitali da blu a rosa. Misurando l'assorbanza delle pozzette, è possibile determinare la concentrazione minima inibitoria delle cellule Cecile nel biofilm, o B-S-M-I-C, per quantificare la suscettibilità agli antibiotici in condizioni prossime a quelle fisiologiche.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la determinazione delle concentrazioni minime inibitorie basata su colture planctoniche, è che i batteri vengono coltivati in un terreno specifico contenente tutti i componenti dell'espettorato, favorendo così la formazione di biofilm. Questi biofilm sono molto più resistenti agli antibiotici. Per preparare il terreno, preparare innanzitutto due bottiglie contenenti 250 millilitri di acqua sterile nella prima bottiglia.
Aggiungere gradualmente la miscela e poi aggiungere quattro grammi di DNA da sperma di pesce a 250 millilitri di acqua sterile. Mescolare la soluzione a temperatura ambiente e lasciare che il DNA si sciolga nel secondo flacone. Aggiungere gradualmente cinque grammi di mucina di tipo due proveniente dallo stomaco di suino e mescolare.
Una volta pronte le soluzioni di DNA e mucina, sciogliere gli aminoacidi in 100 millilitri di acqua sterile, fatta eccezione per la L-tirosina e la L-cisteina, che devono essere sciolte rispettivamente in 25 millilitri di acqua o in 25 millilitri di idrossido di potassio 0,5 molare. Successivamente, sciogliere 5,9 milligrammi di DTPA, cinque grammi di cloruro di sodio e 2,2 grammi di cloruro di potassio in 100 millilitri di acqua. Unire tutte le diverse soluzioni in una bottiglia da un litro, quindi aggiungere cinque millilitri di emulsione di tuorlo d'uovo e portare il volume totale a 850 millilitri con acqua.
Utilizzando un triss molare, regolare il pH a 6,9 e portare il volume finale a un litro con acqua. Per sterilizzare il mezzo, filtrarlo utilizzando una pompa da vuoto a doppio diaframma marca ME2 e un'unità filtrante Millipore Stereo Top con un collo da 45 millimetri e una dimensione dei pori di 0,2 micron. Il processo di filtrazione può essere eseguito nell'arco di due giorni. Il mezzo A SM può essere conservato a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese.
Si inizia diluendo colture notturne di Pseudomona arosa nel mezzo LB per ottenere un OD di 0.05. Successivamente, diluire ulteriormente i batteri in rapporto 1:100 in una piastra con mezzo SM, aggiungendo 1,8 millilitri di coltura batterica diluita per pozzetto in 21 pozzetti di una piastra da coltura tissutale a 24 pozzetti; aliquotare lo stesso volume di mezzo SM nei tre pozzetti rimanenti, che fungeranno da controlli negativi in bianco. Sigillare la piastra a 24 pozzetti e, per consentire la formazione di biofilm, posizionarla in condizioni microaerofile, ottenibili utilizzando bustine generatrici di gas Campi Gen in barattoli anaerobici di grandi dimensioni.
Incubare la coltura su un agitatore impostato a 75 RPM per tre giorni a 37 gradi Celsius; dopo tre giorni, i biofilm appariranno come una massa gelatinosa contenente cellule batteriche e non potranno essere interrotti mediante pipettaggio. Una volta formati i biofilm, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di antibiotico a concentrazioni serialmente diluite. Assicurarsi di preparare almeno quattro replicati per ciascuna concentrazione del farmaco da testare e lasciare quattro pozzetti contenenti biofilm senza trattamento, in modo che possano essere utilizzati come controlli negativi.
Quindi incubare le piastre precedentemente per ulteriori 24 ore dopo l'incubazione con gli antibiotici. Utilizzare 100 microlitri per pozzetto di cellulasi diluita a 100 milligrammi per millilitro in tampone citrato per rompere i biofilm, quindi incubare le piastre su un agitatore impostato a 150 RPM in condizioni aerobiche a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine di questa incubazione, si può ricorrere a pipettaggio manuale per ulteriormente disgregare i biofilm qualora si osservino grumi di cellule nel mezzo.
Successivamente, aggiungere 100 microlitri di rezin per pozzetto per quantificare la vitalità delle cellule rilasciate dai biofilm e incubare le cellule per uno o due ore. A 37 gradi Celsius, solo le cellule vitali sono in grado di metabolizzare il colorante blu zarin nella sua forma rosa fluorescente. Al termine dell'incubazione, trasferire i campioni in una piastra a 96 pozzetti e misurare la fluorescenza dei pozzetti utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 540 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nanometri.
Per quantificare la vitalità batterica e la suscettibilità ai farmaci, sottrarre innanzitutto la fluorescenza di fondo del controllo vuoto dai pozzetti restanti. Successivamente, calcolare la percentuale di inibizione dividendo la fluorescenza media di ciascuna concentrazione per la fluorescenza media dei controlli non trattati e moltiplicando per 100. La B-S-M-Y-C è definita come la concentrazione dell'antibiotico che determina un'inibizione del 90% dell'attività metabolica, come mostrato in queste microfotografie elettroniche: le cellule cresciute in biofilm differiscono notevolmente dai batteri coltivati in colture planctoniche.
In particolare, grandi quantità di matrice extracellulare mostrate in giallo circondano le cellule nel biofilm in verde, ma non nelle colonie planctoniche. Inoltre, i batteri nei biofilm sono tipicamente più resistenti agli antibiotici in questo esperimento. La concentrazione minima inibitoria di tobramicina per la coltura planctonica di pseudomonas aerogen in blu è stata determinata essere di circa quattro microgrammi per millilitro.
Al contrario, come mostrato in rosso, il 100% dei batteri nei biofilm è sopravvissuto fino a 512 microgrammi per millilitro di antibiotico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare batteri in un mezzo artificiale di espettorato definito. Dovresti inoltre essere in grado di eseguire un test di suscettibilità agli antibiotici per determinare la concentrazione minima inibitoria necessaria per inibire la crescita batterica in un ambiente più realistico come quello del polmone affetto da fibrosi cistica.
Panoramica
Questo studio analizza la suscettibilità antibiotica dei biofilm di Pseudomonas aeruginosa utilizzando un mezzo di coltura artificiale simile al muco polmonare nei pazienti affetti da fibrosi cistica. La ricerca evidenzia le differenze nella resistenza agli antibiotici tra colture in biofilm e colture planctoniche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Resistenza agli antimicrobici
- Ricerca sui biofilm
Sfondo
- I metodi attuali per il test della suscettibilità agli antibiotici si concentrano sui batteri planctonici.
- Pseudomonas aeruginosa è un patogeno comune nei pazienti affetti da fibrosi cistica.
- Si sa che i biofilm mostrano una maggiore resistenza agli antibiotici.
- Un mezzo di escreato artificiale può simulare meglio l'ambiente polmonare della fibrosi cistica.
Scopo dello studio
- Valutare l'efficacia degli antibiotici contro i biofilm di Pseudomonas aeruginosa.
- Utilizzare un mezzo artificiale di espettorato definito per condizioni di test più accurate.
- Confrontare la concentrazione minima inibitoria (MIC) degli antibiotici in colture a biofilm rispetto a colture planctoniche.
Metodi Utilizzati
- I biofilm sono stati coltivati in piastre microtitolazione a 24 pozzetti in condizioni aerobiche e microaerofile.
- Gli antibiotici sono stati applicati ai biofilm, seguiti da una rottura mediante cellulasi.
- La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando un colorante metabolico che indica le cellule vive.
- Sono state effettuate misurazioni della fluorescenza per determinare la suscettibilità agli antibiotici.
Risultati principali
- I biofilm hanno mostrato una resistenza significativamente maggiore agli antibiotici rispetto alle colture planctoniche.
- La concentrazione minima inibitoria per la tobramicina era molto più elevata nei biofilm.
- È stata osservata la presenza di matrice extracellulare nei biofilm, che contribuisce alla resistenza.
- Lo studio fornisce un metodo affidabile per testare l'efficacia degli antibiotici in condizioni di biofilm.
Conclusioni
- Il mezzo di escreato artificiale è efficace per lo studio della suscettibilità agli antibiotici nei biofilm.
- I biofilm rappresentano una sfida unica nel trattamento delle infezioni croniche nella fibrosi cistica.
- La ricerca futura dovrebbe concentrarsi sul superamento della resistenza agli antibiotici associata ai biofilm.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Le attuali metodiche di saggio della suscettibilità antimicrobica spesso non riescono a prevedere gli esiti clinici nella fibrosi cistica a causa delle discrepanze tra i saggi planctonici standard e le condizioni di infezione cronica polmonare, caratterizzate da biofilm e ambiente microaerofilo. Questa lacuna aumenta il rischio di proseguire con antibiotici inefficaci nello sviluppo preclinico, portando a costosi fallimenti in fasi avanzate. Incorporando un mezzo di muco artificiale e modelli di biofilm in condizioni di ossigeno fisiologicamente rilevanti, i team di ricerca e sviluppo possono migliorare la validazione degli obiettivi e ridurre i rischi nella selezione dei composti promettenti attraverso screening dell'efficacia più predittivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase di Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'efficacia degli antibiotici contro P. aeruginosa inglobato in biofilm in condizioni che simulano quelle del polmone affetto da fibrosi cistica, supportando la validazione degli obiettivi nei modelli di infezione persistente.
- Valore operativo: Fornisce un formato riproducibile in microtiter plate per la valutazione ad alto rendimento della concentrazione minima inibitoria su cellule sessili (SMIC) su diversi ceppi isolati.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative basate sulla fluorescenza per misurare la rottura del biofilm e l'inibizione metabolica, consentendo l'analisi della risposta in funzione della dose in condizioni quasi fisiologiche.
- Valore operativo: Utilizza reagenti standardizzati (resazurina, cellulasi) e un mezzo artificiale di espettorato definito per garantire la coerenza del saggio e ridurre la variabilità nel profilo di suscettibilità agli antibiotici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Rileva un aumento della resistenza agli antibiotici nei biofilm—fino a oltre 128 volte maggiore SMIC per la tobramicina in condizioni microaerofile—evidenziando i limiti delle soglie di MIC planctoniche.
- Valore operativo: Supporta la selezione dei modelli preclinici identificando composti con attività mantenuta contro patogeni inglobati in biofilm, fornendo indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi anti-infettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio biofilm ASM si inserisce nel percorso di scoperta di agenti antibatterici, in particolare dopo l'identificazione del composto iniziale e prima dell'ottimizzazione del capostazione, dove la comprensione dell'interazione con il bersaglio in ambienti fisiologici complessi guida la priorizzazione.
- Biologia della scoperta: Verifica l'ipotesi secondo cui l'efficacia degli antibiotici è significativamente ridotta nello stato di biofilm e in condizioni microaerofile, chiarendo la vulnerabilità del bersaglio nelle nicchie di infezione cronica.
- Screening: Fornisce dati SMIC riproducibili e quantitativi che consentono il confronto della potenza antibiotica tra diversi isolati e condizioni, supportando la standardizzazione del saggio.
- Analisi: Genera curve di inibizione e valori SMIC che permettono il confronto tra diverse condizioni e la valutazione statistica delle variazioni nella suscettibilità agli antibiotici.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro alla fisiopatologia rilevante per la fibrosi cistica, modellando la crescita del biofilm e la tensione di ossigeno osservate nell'espettorato del paziente.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma pronta all'uso per valutare diverse classi di antibiotici contro patogeni formatori di biofilm, riducendo lo sviluppo ridondante di saggi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora l'affidabilità predittiva rivelando meccanismi di resistenza dipendenti dalle condizioni, non rilevati nei test standard di suscettibilità.
- Valore operativo: Aumenta la riproducibilità grazie alla composizione definita del mezzo, ai tempi standardizzati di formazione del biofilm e alla lettura automatizzata della fluorescenza.
- Valore strategico: Riduce l'incertezza nella de-risking biologica dei percorsi anti-infettivi identificando i composti che probabilmente falliranno nei modelli di infezione contenenti biofilm.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati aggiustata in base al rischio, basata sull'efficacia in modelli di infezione fisiologicamente rilevanti, migliorando l'allocazione del capitale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microbiologia, coltura di biofilm e tecniche di coltura anaerobica/microaerofila.
- Presuppone l'accesso a strumentazione microfluidica o a lettori di piastre con capacità di rilevamento della resazurina (Ex/Em ~540/590 nm).
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di interruzione del biofilm (ad esempio, trattamento con cellulasi) per garantire letture di vitalità consistenti.
- Comporta considerazioni di adattamento qualora il modello venga esteso ad altri patogeni o classi di antibiotici oltre alla tobramicina e a P. aeruginosa.
- I limiti pratici includono il periodo di formazione del biofilm di 3 giorni e la necessità di un rigoroso controllo dell'ossigeno per mantenere condizioni microaerofile, il che può aumentare la durata e la complessità del saggio.
