Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione
5 aprile 2012
Neuroni recettori olfattivi (ORNs) convertire i segnali olfattivi prima in un recettore corrente che a sua volta attiva i potenziali d'azione che vengono trasmessi ai neuroni di secondo ordine nel bulbo olfattivo. Qui si descrive la tecnica pipetta di aspirazione di registrare simultaneamente l'odorizzante indotta recettore correnti e potenziali d'azione da ORNs mouse.
L'obiettivo generale di questa procedura è registrare le risposte indotte da odoranti nei neuroni recettori olfattivi del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante l'escissione dell'epitelio olfattivo e l'isolamento dei neuroni recettori olfattivi del topo. Il secondo passaggio consiste nel posizionare i neuroni recettori olfattivi isolati in una camera di registrazione montata su un microscopio invertito.
I micromanipolatori sostengono l'elettrodo di registrazione e un dispositivo per il cambio di soluzione. Successivamente, aspirare un neurone recettore olfattivo identificato all'interno della punta di un'elettroda pipetta a suzione. L'ultimo passaggio consiste nel posizionare la pipetta con la cellula aspirata nella sua punta davanti al dispositivo per il cambio di soluzione, in modo da esporre il neurone agli odoranti.
Infine, il metodo di registrazione con pipetta a aspirazione viene utilizzato per studiare la funzione dei neuroni recettori olfattivi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tecnica del voltage clamp in intera cellula, è che consente registrazioni di lunga durata con cambiamenti rapidi e precisi della soluzione. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la forma della pipetta di registrazione è importante e il posizionamento stabile delle cellule del bulbo olfattivo all'interno della punta della pipetta è difficile da apprendere.
Iniziare questa procedura tirando una micropipetta da un capillare di vetro borosilicato con filamento UNFI in un tiratore di micropipette con una lunga conicità. Trasferire quindi la pipetta in un porta-micropipetta appositamente realizzato, montato su un microscopio eretto. Il microscopio è dotato di un reticolo nell'oculare e di un coltello a diamante mobile montato sul tavolino.
Successivamente, osservare la punta della pipetta sotto l'obiettivo 20x. Utilizzare il redle come guida. Tracciare delicatamente la pipetta ad un angolo di 90 gradi utilizzando il coltello al diamante su misura sul diametro esterno della pipetta di 10 micrometri.
Spostare il coltello a diamante ulteriormente verso la punta. Applicare gradualmente pressione su di esso. La punta della pipetta dovrebbe rompersi in modo netto nel punto in cui è stata incisa.
Quindi, sotto un obiettivo da 40x, arrotondare la punta della pipetta fino a un diametro interno di cinque micrometri utilizzando un filamento riscaldato elettricamente. Una volta terminato, la micropipetta è pronta per essere utilizzata per la registrazione delle correnti dagli ORN del topo. Nel passaggio successivo, sacrificare un topo ed asportarne la testa.
Quindi rimuovere la pelle sovrastante il cranio, successivamente bisecare la testa lungo la linea mediana. Successivamente, trasferire le due emi-teste su un microscopio stereoscopico da dissezione. Rimuovere il setto nasale ed estrarre i turbinati olfattivi.
Posizionare il tessuto in una piastra di Petri con soluzione ringer per mammiferi contenente glucosio. Successivamente, staccare l'epitelio olfattivo dalla cartilagine sottostante di due turbinati. Trasferire il tessuto in un tubo einor contenente 250 microlitri di ringer.
Quindi conservare il tessuto rimanente a quattro gradi Celsius per un uso successivo. Vortexare brevemente due volte per un secondo a velocità media il tubo EOR contenente l'epitelio olfattivo. Questo passaggio determina la dissociazione meccanica delle NS dall'epitelio.
Successivamente, posizionare la soluzione di Ringer contenente gli ORN dissociati nella camera di registrazione montata sul microscopio ed eliminare i frammenti più grandi di tessuto in sospensione utilizzando una pinzetta fine. Lasciare sedimentare l'ORN per 20 minuti prima di iniziare la perfusione continua con soluzione di Ringer e procedere alle registrazioni; in questa procedura, riempire la pipetta con soluzione di Ringer. Posizionare la pipetta nel supporto per pipette e fissare il supporto allo stadio della testa dell'amplificatore per patch clamp.
Successivamente, collegare la linea dell'olio al porto laterale del supporto per pipetta. Quindi abbassare la pipetta nella camera di registrazione. Regolare l'altezza del serbatoio dell'olio per stabilire una pressione leggermente positiva alla punta della pipetta.
Questo può essere fatto osservando i detriti cellulari che si muovono lontano o verso la pipetta. Evitare di contaminare la punta della pipetta con detriti cellulari. Successivamente, esaminare la camera di registrazione alla ricerca di un'ORN isolata, riconoscibile per la sua tipica morfologia bipolare utilizzando un ingrandimento compreso tra 20 e 40 volte.
Quindi spostare l'elettrodo di registrazione in prossimità del corpo cellulare dell'ORN. Aspirare delicatamente attraverso il tubo collegato al serbatoio d'olio in modo che il corpo cellulare entri nella punta della pipetta. Continuare ad applicare un'aspirazione delicata e lenta finché l'intero corpo cellulare non viene aspirato all'interno della punta della pipetta a suzione, lasciando il dendrite e i cigli esposti alla soluzione del bagno.
Spostare la pipetta a suzione dalla sezione contenente gli ORN sedimentati alla sezione di registrazione della camera. Posizionare con attenzione la pipetta a suzione davanti al tubo a tre canne per lo scambio della soluzione. La pipetta a suzione deve essere posizionata abbastanza vicina all'apertura del tubo a tre canne in modo che l'ORN sia esposto a un flusso laminare, evitando così turbolenze di miscelamento. Per ottenere lo scambio della soluzione, spostare il confine tra i flussi paralleli della soluzione proveniente dal tubo a tre canne del sostitutore di soluzione attraverso la punta della pipetta a suzione, al fine di monitorare la qualità e l'affidabilità dello scambio della soluzione.
È possibile misurare la corrente di giunzione provocata dal movimento della cellula tra soluzioni di diversa composizione ionica. Il profilo temporale dello scambio della soluzione è tipicamente di circa 20 millisecondi. Quando il neurone recettore olfattivo viene esposto a una soluzione di odorante, qui si può elicitare una risposta provocata dall'odorante.
Un ORN è stato esposto a eugenolo a cento micromolari per un secondo, come indicato dalla barra sopra la registrazione. Nel pannello superiore, la corrente recettoriale è stata filtrata con una banda passante da zero a 50 hertz per visualizzare soltanto la corrente recettoriale. Nel pannello inferiore è mostrata la stessa registrazione filtrata con una banda passante ampia, da zero a 5.000 hertz, in modo da visualizzare anche i potenziali d'azione. Di seguito sono riportate le risposte in funzione della dose di un ORN sensibile all'eugenolo. L'eugenolo è stato utilizzato a concentrazioni comprese tra 0,3 micromolare e cento micromolari.
La durata dello stimolo era di un secondo e i tracciati sono stati filtrati da zero a 50 hertz. Un aumento progressivo della concentrazione dell'odorante ha prodotto una risposta con incremento più ampio e rapido, che si è inoltre interrotta più lentamente. Una volta terminata l'esposizione all'odorante, gli ORN possono mostrare un andamento oscillatorio durante stimolazioni prolungate a concentrazioni intermedie di odorante.
Qui, un'ORN sensibile all'acetofenone è stata stimolata per otto secondi. Dopo un picco di risposta rapido e transitorio all'inizio dello stimolo, si osserva una serie di risposte ricorrenti più piccole. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di manipolare con attenzione i neuroni recettori olfattivi e di essere molto pazienti.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una procedura per registrare le risposte indotte da odoranti nei neuroni recettoriali olfattivi del topo (ORNs). La tecnica della pipetta di aspirazione consente la registrazione simultanea di correnti recettoriali e potenziali d'azione da questi neuroni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Sistema olfattivo
Sfondo
- I neuroni recettoriali olfattivi convertono i segnali odorosi in risposte elettriche.
- Comprendere le risposte dei neuroni recettoriali olfattivi è fondamentale per lo studio dell'elaborazione olfattiva.
- La tecnica della pipetta aspirante è un metodo prezioso per le registrazioni elettrofisiologiche.
- Questo studio si concentra su modelli murini per la ricerca olfattiva.
Scopo dello studio
- Registrare la corrente recettoriale e i potenziali d'azione dai neuroni olfattivi del topo.
- Studiare la risposta dei neuroni olfattivi a diversi odoranti.
- Migliorare la comprensione della trasduzione del segnale olfattivo.
Metodi Utilizzati
- Dissezione dell'epitelio olfattivo per isolare i neuroni olfattivi (ORN).
- Posizionamento dei neuroni isolati in una camera di registrazione su un microscopio invertito.
- Utilizzo di micromanipolatori per tenere gli elettrodi di registrazione.
- Applicazione della tecnica della pipetta a suzione per registrare le risposte neuronali.
Risultati principali
- Registrazione riuscita di correnti recettoriali indotte da odoranti nei neuroni olfattivi (ORN).
- Potenziali d'azione sono stati innescati in risposta a odoranti specifici.
- La tecnica ha dimostrato un'elevata fedeltà nella cattura delle risposte neuronali.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi di elaborazione olfattiva.
Conclusioni
- La tecnica della pipetta di aspirazione è efficace per lo studio delle risposte dei neuroni olfattivi.
- I risultati forniscono informazioni sul percorso di trasduzione del segnale olfattivo.
- Questo metodo può essere applicato a ulteriori ricerche in neuroscienze olfattive.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione affidabile delle risposte indotte da odoranti nei neuroni recettoriali olfattivi (ORNs) è fondamentale per ridurre i rischi associati a target biologici sensoriali nelle fasi iniziali e per validare ipotesi meccanicistiche nella ricerca e sviluppo chemosensoriale. La tecnica della pipetta di aspirazione consente la registrazione simultanea di correnti recettoriali e potenziali d'azione, permettendo una valutazione quantitativa della funzione neuronale e della modulazione farmacologica. Questa capacità rafforza l'affidabilità predittiva nei punti critici di validazione del target e di sviluppo del saggio per i portafogli biofarmaceutici focalizzati sui percorsi sensoriali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'analisi diretta della funzione dei neuroni olfattivi in risposta a stimoli odorosi definiti.
- Permette la riduzione del rischio meccanicistico distinguendo tra la cinetica della corrente recettoriale e quella del potenziale d'azione.
- Semplifica la validazione di perturbazioni genetiche o farmacologiche in modelli murini knock-out o con marcatura genetica.
- Fornisce dati quantitativi per la selezione e il triage degli obiettivi basati su ipotesi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce registrazioni riproducibili e ad alta fedeltà, adatte alla standardizzazione dei saggi.
- Consente cambiamenti rapidi e precisi della soluzione per l'applicazione controllata di composti o odoranti.
- Permette la separazione di correnti recettoriali lente e potenziali d'azione rapidi per letture affidabili.
- Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro di screening successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la malattia consentendo registrazioni da topi di tipo selvatico e modificati geneticamente.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli sensoriali.
- Fornisce informazioni meccanicistiche che guidano strategie traslazionali per biomarcatori.
- Riduce il rischio di fallimento biologico in fasi avanzate confermando l'interazione funzionale con il bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tecnica della pipetta di aspirazione si integra all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, fornendo un ponte tra la verifica di ipotesi meccanicistiche e lo sviluppo di saggi quantitativi nei flussi di lavoro della neuroscienza sensoriale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la misurazione diretta delle risposte dei neuroni olfattivi agli odoranti e ai modulatori.
- Screening: Offre risultati quantitativi e riproducibili per la preparazione del saggio e la valutazione dei composti.
- Analisi: Fornisce misurazioni cinetiche e dell'ampiezza delle correnti recettoriali e dei potenziali d'azione per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento con modelli preclinici e supporta lo sviluppo di biomarcatori quando utilizzato con neuroni olfattivi geneticamente definiti.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile per l'uso su neuroni olfattivi di tipo selvatico, knockout ed etichettati fluorescentemente, a sostegno della scalabilità della piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi sensoriali.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi elettrofisiologici.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) e l'efficienza del capitale fornendo dati funzionali solidi fin dalle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione e un avanzamento mirati dei programmi di biologia sensoriale, adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia e tecniche di micromanipolazione precise.
- Necessita di strumentazione specializzata, inclusi il sistema con pipetta a suggente e sistemi per lo scambio rapido delle soluzioni.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per i parametri di registrazione e i flussi di analisi dei dati.
- Adattabile a diversi modelli murini, inclusi quelli di tipo selvatico, knockout e con ORN marcati fluorescentemente.
- È essenziale un'attenta manipolazione dei neuroni e una precisa preparazione delle pipette per mantenere la fedeltà della registrazione.
