Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare le risposte indotte dagli odori dai neuroni dei recettori olfattivi dei topi. Ciò si ottiene sezionando prima l'epitelio olfattivo e isolando i neuroni del recettore olfattivo del topo. Il secondo passo consiste nel posizionare i neuroni del recettore olfattivo isolati in una camera di registrazione montata su un microscopio invertito.

I micro manipolatori trattengono l'elettrodo di registrazione e un cambio di soluzione. Quindi, aspirare un neurone recettore olfattivo identificato nella punta di un elettrodo di pipetta di aspirazione. Il passaggio finale consiste nel posizionare la pipetta con la cellula aspirata nella punta davanti a un cambiatore di soluzione per esporre il neurone agli odori.

In definitiva, il metodo di registrazione della pipetta di aspirazione viene utilizzato per studiare la funzione dei neuroni dei recettori olfattivi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la tecnica del morsetto di tensione a cella intera è che consente lunghe durate di registrazione utilizzando cambi di soluzione rapidi e precisi. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la forma della pipetta di registrazione è importante e il posizionamento stabile delle cellule dell'alveolo nella punta della pipetta è difficile da imparare.

Iniziare questa procedura tirando una micropipetta con un capillare in vetro silicato bo UNFI lamentato in un micro estrattore per pipette con una lunga conicità. Quindi trasferire la pipetta in un micro portapipette su misura montato su un microscopio verticale. Il microscopio è dotato di un redle nell'oculare e di un coltello diamantato mobile montato sul tavolino.

Quindi, osservare la punta della pipetta sotto l'obiettivo 20 x. Usa il redle come guida. Incidere delicatamente la pipetta con un angolo di 90 gradi utilizzando il coltello diamantato su misura al diametro esterno della pipetta di 10 micrometri.

Spostare il coltello diamantato più verso la punta. Applicare gradualmente una pressione su di esso. Il puntale della pipetta dovrebbe rompersi in modo netto nel punto in cui è stato scritto.

Quindi, sotto un obiettivo 40x, lucidare la punta della pipetta fino a un diametro interno di cinque micrometri utilizzando un filamento riscaldato elettricamente. Una volta terminata, la micropipetta è pronta per essere utilizzata per la registrazione delle correnti provenienti dagli orli dei topi. Nel passaggio successivo, sacrifica un topo e rimuovi la sua testa.

Quindi staccare la pelle sovrastante il cranio, successivamente dividere in due la testa lungo la linea mediana. Quindi, trasferire le due teste Hemi su uno stereomicroscopio da dissezione. Estrarre il setto nasale e rimuovere i turbinati olfattivi.

Mettere il fazzoletto in una capsula di Petri con una soluzione di ringer di mammifero contenente glucosio. Successivamente, staccare l'epitelio olfattivo dalla cartilagine sottostante da due turbinati. Trasferire il fazzoletto in una provetta contenente 250 microlitri di ringer.

Quindi conservare il tessuto rimanente a quattro gradi Celsius per dopo. Utilizzare il tubo EOR contenente l'epitelio olfattivo due volte brevemente per un secondo a velocità media. Questo passaggio porta alla dissociazione meccanica del NS dall'epitelio.

Quindi posizionare la soluzione di ringer contenente gli orni dissociati nella camera di registrazione montata sul microscopio, rimuovere i grossi pezzi di tessuto nella sospensione utilizzando un paio di pinze sottili. Lasciare riposare l'ORN per 20 minuti prima di iniziare la perfusione continua con la soluzione di suoneria e procedere alle registrazioni in questa procedura, riempire la pipetta con la soluzione di suoneria. Posizionare la pipetta nel supporto per pipette e collegare il supporto allo stadio della testa dell'amplificatore con morsetto patch.

Quindi, collegare la linea dell'olio alla porta laterale del portapipetta. Quindi abbassare la pipetta nella camera di registrazione. Regolare l'altezza del serbatoio dell'olio per stabilire una pressione leggermente positiva sulla punta della pipetta.

Questo può essere fatto osservando i detriti cellulari che si allontanano o si avvicinano alla pipetta. Cercare di non contaminare la punta della pipetta con detriti cellulari. Successivamente, scansiona la camera di registrazione alla ricerca di un ORN isolato, che può essere riconosciuto dalla sua tipica morfologia bipolare utilizzando un ingrandimento da 20 a 40 x.

Quindi spostare l'elettrodo di registrazione in prossimità del corpo cellulare ORN. Aspirare delicatamente la linea aerea collegata al serbatoio dell'olio in modo che il corpo cellulare entri nella punta della pipetta. Continuare ad applicare l'aspirazione con attenzione e lentamente fino a quando l'intero corpo cellulare non viene aspirato nella punta della pipetta di aspirazione, lasciando i dendriti e le ciglia esposti alla soluzione del bagno.

Spostare la pipetta di aspirazione dalla sezione contenente gli orni stabilizzati alla sezione di registrazione della camera. Posizionare con cautela la pipetta di aspirazione davanti al tubo a tre cilindri per lo scambio della soluzione. La pipetta di aspirazione deve essere posizionata abbastanza vicino all'apertura del tubo a tre cilindri in modo che l'ORN sia esposto al flusso laminare ed evitando così la turbolenza di miscelazione Per ottenere lo scambio di soluzione, spostare il confine tra i flussi paralleli di soluzione che scorre dal tubo a tre cilindri del cambiatore di soluzione attraverso la punta della pipetta di aspirazione per monitorare la qualità e l'affidabilità dello scambio di soluzione.

La corrente di giunzione evocata spostando la cella tra soluzioni di diversa composizione ionica può essere misurata. L'andamento temporale dello scambio di soluzioni è in genere di circa 20 millisecondi. Quando il neurone del recettore olfattivo viene inserito in una soluzione odorizzante, qui può essere suscitata una risposta evocata dall'odore.

Un ORN è stato esposto a un centinaio di micromolari di eugenolo per un secondo, come indicato dalla barra sopra la registrazione. Nel pannello superiore, la corrente del recettore è stata filtrata a una larghezza di banda da zero a 50 hertz per visualizzare la corrente del recettore Solo il pannello inferiore mostra la stessa registrazione filtrata all'ampia larghezza di banda da zero a 5.000 hertz per visualizzare anche i potenziali d'azione. Ecco le risposte alla dose di un ORN eugenolo responsivo L'eugenolo è stato utilizzato alle concentrazioni che vanno da 0,3 micromolari a cento micromolari.

La durata dello stimolo era di un secondo e le tracce venivano filtrate da zero a 50 hertz. Un progressivo aumento della concentrazione di odorizzante ha portato a una risposta di aumento più ampia e più rapida, che terminava anche più lentamente. Una volta terminata l'esposizione agli odori, gli ORNS possono mostrare un modello di risposta oscillatorio durante lunghe stimolazioni a concentrazioni intermedie di odorizzante.

Qui, un ORN responsivo all'acetofenone è stato stimolato per otto secondi dopo una risposta di picco rapida e transitoria all'inizio della stimolazione. Durante il tentativo di questa procedura si osserva una serie di risposte ricorrenti più piccole. È importante ricordare di maneggiare con cura i neuroni dei recettori olfattivi e di essere molto pazienti.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.