Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)
16 maggio 2012
Quantitativa reale tempo di reazione a catena della polimerasi (qPCR) è un metodo rapido e sensibile per indagare i livelli di espressione di microRNA (miRNA vari) molecole in campioni tumorali. Usando questo metodo di espressione di centinaia di molecole diverse miRNA possono essere amplificati, quantificati e analizzati utilizzando lo stesso modello cDNA.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare i livelli di espressione delle molecole di micro RNA nel cancro alla prostata e nei tessuti prostatici normali mediante PCR quantitativa in tempo reale. Questo viene ottenuto estraendo innanzitutto l'RNA totale dai tessuti prostatici. Ciò include l'mRNA, il micro RNA e altri piccoli RNA.
Successivamente, l'RNA viene retrotrascritto per generare cDNA. Quindi viene eseguita una PCR in tempo reale con green cyber utilizzando il cDNA come modello per amplificare e quantificare l'espressione di microRNA in tempo reale. Si ottengono risultati che mostrano l'espressione relativa di microRNA in vari campioni prostatici basati sulla PCR quantitativa in tempo reale.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi è che offre un'elevata sensibilità, accuratezza, riproducibilità ed è rapida ed economica. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, poiché l'espressione dei microRNA è spesso correlata a geni fortemente coinvolti nel processo tumorale. Possiamo quindi utilizzare la QPCR per valutare l'espressione dei microRNA e osservare come questa si correli con variabili cliniche.
Questi biomarcatori potrebbero potenzialmente essere utilizzati sia come strumenti diagnostici che prognostici. Potrebbero aiutarci a diagnosticare il cancro della prostata e a determinare quali tumori prostatici siano aggressivi. Inoltre, esiste la possibilità che questi biomarcatori possano agire come agenti terapeutici.
Questo metodo non solo può fornire informazioni sulla genesi del tumore prostatico, ma potrebbe anche essere applicato ad altri tipi di cancro e malattie. Raccogliere i campioni prostatici al momento dell'ectomia e orientare il campione utilizzando punti di riferimento anatomici. Colorare la prostata e le vescicole seminali nel modo seguente: lato destro verde, lato sinistro blu.
Prelevare una sezione trasversale mediale casuale del tessuto perpendicolare alla superficie rettale, congelare il campione e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Fare una fotocopia e orientare le fette dei campioni, dividendole in quattro parti uguali. Consultare un patologo per determinare le aree tumorali rispetto a quelle normali nell'immagine corrispondente.
Utilizzare le aree segnate come guida per identificare il tessuto tumorale da cui estrarre l'RNA per l'isolamento dell'RNA. Iniziare posizionando i campioni prostatici congelati su ghiaccio secco e consultando la fotocopia delimitata. Asportare una piccola porzione del tumore prostatico.
Omogeneizzare il tessuto tumorale della prostata in un millilitro di reagente triolo. Incubare i campioni omogeneizzati per cinque minuti. Aggiungere 0,2 millilitri di cloroformio ai campioni a temperatura ambiente e agitare vigorosamente per 15 secondi.
Incubare i campioni per tre minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 12.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la fase acquosa superiore incolore in nuove provette e aggiungere 0,5 millilitri di alcol isopropilico. Incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare a 12.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet contenente l'RNA. Aggiungere un millilitro di etanolo al 75% al pellet di RNA, vortexare il campione e sedimentare mediante centrifugazione per cinque minuti a 7.500 ×g a quattro gradi Celsius. Nuovamente, aspirare il soprannatante e asciugare il pellet di RNA per cinque-dieci minuti, assicurandosi che non diventi completamente secco.
Rosso, risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi e utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione dell'RNA. Utilizzare un bioanalizzatore per verificare la qualità e l'integrità dei campioni di RNA. Trascrivere al contrario l'RNA in CDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa seguendo le istruzioni del produttore.
Per generare una curva standard, preparare una serie di diluizioni del CD NA originale da un campione noto per avere un'espressione significativa del gene di interesse. Eseguire la PCR in tempo reale preparando un mix master basato su un volume di reazione di 20 microlitri di quant due x. Rilevare il mix master PCR cyber green 10 x microscript primer universale, saggio primer microscript 10 x e acqua libera da RN a's.
Includere due set di primer, uno per il gene bersaglio e un altro per il gene di riferimento, in questo caso RNU6B. Pipettare due microlitri di ciascuna diluizione di cDNA in tubi capillari per light cycler individuali e aggiungere 18 microlitri del master mix. Utilizzare un adattatore per capillari e centrifugare. Posizionare i capillari in un termociclatore in tempo reale basato su capillari ed eseguire il programma di PCR come segue: 95 gradi Celsius per 15 minuti, seguiti da 50 cicli di 94 gradi Celsius per 15 secondi.
55 gradi Celsius per 30 secondi e 70 gradi Celsius. Per 30 secondi, selezionare un campione come calibratore e impostarne la quantità normalizzata del bersaglio a uno. Confrontare l'espressione relativa del micro RNA in tutti gli altri campioni rispetto al calibratore per generare curve di amplificazione.
Per le reazioni PCR, utilizzare il software Light Cycler versione 3.5 nella scheda di quantificazione. Quantificare le reazioni ed esportare i dati in un file di testo. Importare i dati nel software di analisi REL quant per generare i risultati di quantificazione.
Importare file separati per il gene bersaglio, il gene di riferimento e i dati della curva standard. Specificare la posizione del campione calibratore sia per il gene bersaglio che per quello di riferimento, nonché le posizioni dei campioni. I dati vengono espressi come rapporto tra bersaglio e riferimento di diversi campioni, diviso per il rapporto tra bersaglio e riferimento del campione calibratore.
Utilizzare la curva standard precedentemente generata per un particolare microRNA e un gene di controllo come standard di riferimento per estrapolare i dati quantitativi del microRNA. Obiettivi di concentrazioni sconosciute. Analizzare tre campioni come gruppo e calcolare le concentrazioni medie e le deviazioni standard delle triplicazioni.
Se uno dei tre replicati è incoerente rispetto al resto del gruppo, il programma lo escluderà. Qui viene mostrato un esempio di analisi A-Q-P-C-R su campioni prostatici. I grafici mostrano i livelli di espressione del gene di riferimento U six che inizia l'amplificazione esponenziale intorno al ciclo 20, mentre l'espressione del gene bersaglio, MIR 98, mostra un'amplificazione ritardata intorno al ciclo 25.
I dati di questo esperimento sono stati esportati come file di testo e analizzati mediante software di analisi Requ; sono state specificate le posizioni dei capillari contenenti il calibratore e i campioni. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno se effettuata correttamente. L'affidabilità di questa tecnica dipende dalla qualità dell'RNA.
Pertanto, è fondamentale prestare particolare attenzione nella manipolazione dell'RNA poiché può degradarsi molto facilmente.
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Panoramica
Questo studio utilizza la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) per misurare i livelli di espressione di microRNA nel cancro alla prostata e nei tessuti prostatici normali. Il metodo consente l'amplificazione e la quantificazione di diverse molecole di miRNA a partire dallo stesso stampo di cDNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncologia
- Biologia Molecolare
Sfondo
- I microRNA svolgono un ruolo cruciale nella regolazione genica.
- Il cancro alla prostata è una preoccupazione sanitaria significativa.
- Comprendere l'espressione dei miRNA può fornire informazioni sulla biologia del cancro.
- La qPCR è una tecnica ampiamente utilizzata per analizzare l'espressione genica.
Scopo dello studio
- Quantificare i livelli di espressione dei microRNA nei tessuti del cancro alla prostata.
- Confrontare i livelli di miRNA tra tessuti prostatici tumorali e normali.
- Utilizzare la qPCR per l'analisi sensibile e rapida dei miRNA.
Metodi Utilizzati
- Estrazione di RNA totale da tessuti prostatici.
- Trascrizione inversa per generare cDNA.
- PCR in tempo reale basata su Cyber Green per l'amplificazione.
- Quantificazione dell'espressione di microRNA in tempo reale.
Risultati principali
- Sono stati determinati i livelli relativi di espressione di vari microRNA.
- Sono state osservate differenze nell'espressione dei microRNA tra tessuti tumorali e normali.
- I risultati evidenziano il potenziale dei microRNA come biomarcatori per il cancro alla prostata.
- La qPCR si è rivelata efficace per analizzare contemporaneamente multipli microRNA.
Conclusioni
- La qPCR è uno strumento prezioso per lo studio dell'espressione dei microRNA nella ricerca sul cancro.
- I risultati potrebbero contribuire alla comprensione della biologia del cancro alla prostata.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare i ruoli funzionali dei miRNA identificati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) per il rilevamento di microRNA nei tumori della prostata consente una quantificazione sensibile e riproducibile dell'espressione di miRNA, supportando la scoperta precoce di biomarcatori e la validazione di target. Questo flusso di lavoro risponde alla necessità di ottenere letture molecolari quantitative e robuste nella ricerca e sviluppo oncologica, facilitando decisioni basate sulla valutazione del rischio nell'interfaccia tra scoperta e applicazione traslazionale. Una quantificazione affidabile di miRNA costituisce la base per la selezione del portafoglio e orienta la riduzione del rischio meccanicistico nei percorsi di ricerca sul cancro.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi quantitativa del coinvolgimento dei miRNA nei percorsi oncogenici.
- Supporta la validazione funzionale dei bersagli correlando l'espressione dei miRNA con variabili cliniche.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico mediante la misurazione precisa di specie di RNA regolatori.
- Fornisce dati per la selezione di biomarcatori candidati nei programmi oncologici in fase iniziale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce saggi quantitativi validati per il rilevamento di miRNA in campioni clinici e preclinici.
- Standardizza la normalizzazione mediante geni di riferimento per garantire la riproducibilità tra esperimenti.
- Consente lo screening scalabile ad alto rendimento dei profili di espressione di miRNA.
- Permette il trasferimento del saggio ad altri tipi di tessuto e modelli di malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la quantificazione degli miRNA all'analisi dei campioni clinici per lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, utilizzando campioni archiviati e freschi.
- Fornisce endpoint quantitativi per valutare la rilevanza patologica degli miRNA candidati.
- Riduce il rischio traslazionale consentendo confronti robusti tra diversi campioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di quantificazione dell'RNA micro basato sulla qPCR integra le fasi iniziali della scoperta fino alla ricerca traslazionale, supportando l'identificazione dei candidati e la validazione preclinica nei percorsi di oncologia.
- Biologia della scoperta: Il profilo quantitativo dei miRNA chiarisce i meccanismi regolatori e supporta la selezione mirata di bersagli basata su ipotesi.
- Screening: Saggi qPCR standardizzati consentono letture quantitative e riproducibili per lo screening di composti o biomarcatori.
- Analisi: La quantificazione relativa e la normalizzazione forniscono dati utilizzabili per confrontare campioni tumorali e normali.
- Ricerca traslazionale: Il metodo è applicabile sia a campioni clinici freschi che archiviati, garantendo la continuità dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Le strategie di progettazione del saggio e di normalizzazione possono essere adattate a diversi tipi di tessuto e aree patologiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi basata sugli miRNA e nella scoperta di biomarcatori.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, riproducibili e scalabili per la quantificazione molecolare.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce i rischi biologici in fase avanzata nei portafogli oncologici.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei biomarcatori candidati e dei bersagli terapeutici in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione dell'RNA e nella progettazione di saggi qPCR.
- Richiede strumentazione di alta qualità per l'estrazione dell'RNA, la sintesi del cDNA e la PCR in tempo reale.
- Necessita di una rigorosa normalizzazione e di una selezione accurata dei geni di riferimento per garantire la comparabilità tra campioni.
- Adattabile a diversi tipi di tessuti e a campioni clinici archiviati, previa opportuna validazione.
- L'integrità dell'RNA e la corretta manipolazione del campione sono fondamentali per l'affidabilità e la riproducibilità dei dati.
