Preparazione di cellule derivate mieloidi soppressore (MDSC) da Naive e Pancreatiche topi affetti da tumore in citometria a flusso e di smistamento automatico magnetico cellulare Attivato (AutoMACS)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è generare rapidamente una popolazione di leucociti arricchiti in GR uno positivi contenenti cellule soppressorie di origine mieloide vitali, o M DSC, da milze di topo, da utilizzare in saggi in vivo e in vitro. Innanzitutto, le milze di diversi topi vengono raggruppate e processate per generare una sospensione monocellulare. Per quantificare la percentuale di M DSC prima dell'arricchimento, un piccolo aliquota delle cellule raggruppate viene trasferita in una piastra a fondo V da 96 pozzetti.

Gli antigeni di superficie MAC uno e GR uno vengono marcati e le cellule marcate sono trasferite in provette FACS per l'analisi citofluorimetrica. I leucociti rimanenti, raccolti in pool, vengono colorati con un anticorpo coniugato a un fluorocromo specifico per GR uno e incubati con microperle magnetiche, che si legano al fluorocromo presente sull'anticorpo anti-GR uno. Le popolazioni GR uno positive e GR uno negative vengono quindi separate utilizzando un separatore AutoMax pro per valutare il successo dell'arricchimento della popolazione per GR uno.

Viene prelevato un piccolo aliquota e analizzato per l'espressione di GR uno e MAC uno al fine di valutare le percentuali di MDSC. Il confronto dei dati di immunofenotipizzazione ottenuti dimostra un aumento delle percentuali di MDSC nella popolazione leucocitaria arricchita per GR uno rispetto alla popolazione non arricchita. Inoltre, si osserva un incremento di MDSC naive, ottenendo una popolazione confrontabile con quella di MDSC presenti in soggetti con tumore.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la colorazione convenzionale in flusso e il sorting basato su citometria a flusso ad alta velocità di M DSCs da tessuti linfoidi, è che la nostra tecnica con mix master impedisce variazioni significative nei risultati assicurando una colorazione superficiale uniforme dei leucociti in pool, nonché il typing forense e il sorting AutoMax rispettivamente di m DSCs e cellule positive per GR uno. Le procedure saranno dimostrate da Nadine Nelson, studentessa laureata del nostro laboratorio, e dal dottor Haw sra, direttore della struttura centrale di citometria a flusso dell'USF. La seguente procedura deve essere eseguita in un ambiente sterile sotto cappa di sicurezza biologica, mantenendo cellule e anticorpi sul ghiaccio.

Ogni volta che possibile, assemblare il setaccio per la dissociazione cellulare inserendo la maglia metallica nell'apertura della coppetta verso il fondo. Inserire quindi l'anello di ritenzione nell'area filettata con il lato scanalato rivolto verso l'alto e utilizzare la chiave per stringere l'anello di ritenzione e fissare saldamente la maglia. Posizionare il setaccio assemblato in una piastra di Petri contenente 10 millilitri di una soluzione tampone XPBS.

Milze prelevate da topi C57BL/6 portatori di tumore o controlli naïve di età compresa tra le sei e le otto settimane, posizionarle sulla griglia del setaccio per la dissociazione cellulare. Quindi utilizzare una pestella di vetro per macinare le milze attraverso la griglia, raccogliendole nella piastra di Petri. Ripetere questo procedimento per ciascun gruppo di trattamento di topi.

Successivamente, utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, applicare la sospensione cellulare su un filtro cellulare da 70 micron e lasciarla filtrare in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare a 250-300 ×g per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet aggiungendo cinque millilitri di tampone per la lisi dei globuli rossi per ogni milza, pipettando ripetutamente su e giù in modo vigoroso; incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, arrestare la reazione aggiungendo 20 millilitri di PBS e pipettando ripetutamente su e giù in modo vigoroso.

Quindi centrifugare a 250-300 ×g per cinque minuti; dopo aver rimosso il soprannatante, risospendere il pellet in 20 millilitri di PBS sterile e contare le cellule. Utilizzando trian blu e un emocitometro, risospendere le cellule a una concentrazione compresa tra 1×10⁷ e 2×10⁷ cellule per millilitro in mezzo di colorazione al 3%. Il raggiungimento di una colorazione ottimale è l'aspetto più difficile di questa procedura.

Questo può essere eseguito con successo mediante titolazione degli anticorpi in anticipo. Utilizzare la preparazione di miscele master e la marcatura superficiale in piccoli volumi come descritto in questo protocollo. Per marcare le cellule per l'analisi citofluorimetrica, etichettare le pozzette di una piastra vbo a 96 pozzette per campioni di controllo e sperimentali e per le marcature singole.

Per i controlli di compensazione, aggiungere da cinque volte 10 alla quinta a una volta 10 alla sesta cellule in 50 microlitri in ciascun pozzetto etichettato. Centrifugare quindi la piastra a 250-300 ×g per cinque minuti dopo la centrifugazione. Osservare la piastra dal basso.

Guardare verso l'alto per assicurarsi che i pellet siano presenti nei pozzetti, preparare una miscela madre di blocco BDFC per mouse contenente l'anticorpo monoclonale ratto anti muse CD16/32 diluito in mezzo di marcatura al 3% in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro su ghiaccio, agitando brevemente con un vortex. Quindi centrifugare brevemente per cinque secondi tenendo la piastra a fondo V da 96 pozzetti sopra un contenitore per rifiuti o un lavandino. Capovolgere rapidamente la piastra e riportarla nella posizione iniziale per rimuovere il soprannatante senza disturbare i pellet cellulari.

Quindi aggiungere 50 microlitri della miscela master del blocco FC a tutti i pellet nella piastra a fondo V da 96 pozzetti, mescolando delicatamente aspirando e dispensando con la pipetta. Posizionare la piastra sul ghiaccio e incubare per 15 minuti al buio. Centrifugare la piastra a 250-300 ×g per cinque minuti. Preparare una miscela master di anticorpi Mac one fitzy e GR one A PC diluiti in mezzo di marcatura al 3% in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro posto sul ghiaccio.

Vortex, centrifuga brevemente per cinque secondi. Dopo la centrifugazione, capovolgi la piastra per rimuovere il soprannatante da ogni pozzetto, quindi aggiungi 50 microlitri della miscela di anticorpi ai pellet di controllo o sperimentali. Mescola accuratamente pipettando delicatamente su e giù. Per le compensazioni con singola colorazione, aggiungi 50 microlitri di MAC diluito uno F GR uno A PC o DPI nel mezzo di colorazione al 3% nei pozzetti appropriati. Per il controllo senza colorazione, aggiungi 50 microlitri di mezzo di colorazione al 3% nel pozzetto appropriato e mescola.

Quindi incubare la piastra per 30 minuti al buio sul ghiaccio. Durante l'incubazione, etichettare le provette fax in modo che corrispondano a ciascun pozzetto della piastra e aggiungere 200 microlitri di mezzo di colorazione al 3% in ogni provetta fax. Trascorsi i 30 minuti di incubazione, centrifugare la piastra a 250-300 ×g per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, rimuovere i soprannatanti come in precedenza. Quindi lavare i pellet aggiungendo 100 microlitri di mezzo di colorazione al 3% a ciascun pellet. Mescolare bene pipettando delicatamente su e giù.

Centrifugare nuovamente la piastra per cinque minuti. Ripetere, lavare, eseguire nuovamente il passaggio dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante come in precedenza e risospendere ogni pellet in 100 microlitri di mezzo di colorazione al 3% e mescolare accuratamente. Successivamente, trasferire 100 microlitri delle cellule risospese da ogni pozzetto della piastra nei rispettivi tubi FACS opportunamente etichettati.

Quindi aggiungere 75 nanogrammi per millilitro di DPI ai campioni di controllo e sperimentali e al controllo di compensazione per la colorazione singola di DPI. Acquisire i dati citometrici per determinare le percentuali di MDSC come descritto nel documento allegato; successivamente arricchire gli aliquot di leucociti positivi per GR1, prelevando una volta 10 alla settima dei leucociti rimanenti non colorati, trasferendoli in provette FACS opportunamente etichettate e centrifugandoli a 250-300 ×g per cinque minuti. Aggiungere 50 microlitri di una diluizione 1:10 dell'anticorpo GR1-PE in buffer Max e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius al buio.

Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di buffer max in ogni provetta fax e centrifugare a 250-300 ×g per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, eliminare il sopranatante. Quindi aggiungere 200 microlitri di una diluizione uno a quattro di microperle anti-PE in buffer max in ogni provetta e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius al buio.

Aggiungere due millilitri di buffer max in provette fax e centrifugare a 250-300 ×g per cinque minuti. Successivamente, risospendere il pellet in tre millilitri di buffer di marcatura, filtrando attraverso un setaccio da 70 micron in una nuova provetta conica da 50 millilitri etichettata. In questo protocollo, stiamo utilizzando la separazione magnetica automatica.

La separazione magnetica è un'ottima scelta di metodi. Se è necessario separare un elevato numero di cellule in modo rapido ed economico, e in base a un marcatore di superficie, assicurarsi di verificare i risultati alla fine mediante citometria a flusso. Per preparare e attivare il separatore AutoMax pro, verificare che tutte le bottiglie siano riempite con le soluzioni appropriate.

Accendere lo strumento. Dopo l'inizializzazione, verificare lo stato dei contenitori dei fluidi e delle colonne. Tutti i simboli devono essere verdi.

Successivamente nel menu, selezionare separazione dalla barra dei menu superiore, seguita da lavaggio. Ora, dalla barra dei menu inferiore, selezionare risciacquo dall'opzione a comparsa, seguita da esegui per avviare il processo di condizionamento. Una volta completato con successo il processo di condizionamento, lo strumento indicherà che è pronto per la separazione.

Sotto il menu stato, posizionare il tubo conico da 50 millilitri contenente le cellule marcate magneticamente nella fila A di un rack per tubi refrigerato di dimensioni adeguate. Quindi posizionare un tubo conico da 50 millilitri per la raccolta della frazione negativa nella fila B e un tubo conico da 15 millilitri per la raccolta della frazione positiva nella fila C; selezionare il programma di separazione cellulare POS cell S per la selezione positiva delle cellule bersaglio marcate in modalità sensibile a partire dai campioni. Quando il programma inizia, le cellule bersaglio marcate magneticamente vengono trattenute sulla colonna AutoMax, mentre le cellule non marcate vengono rilasciate nel tubo di raccolta della frazione negativa nella fila B. Successivamente, il magnete viene ritratto e le cellule bersaglio marcate vengono rilasciate nel tubo di raccolta positivo nella fila C del rack per tubi.

Dopo l'arricchimento, utilizzare il trian blu e un emocitometro per ricontare le frazioni GR uno positive e GR uno negative. Successivamente, risospendere le cellule a una concentrazione compresa tra 1 × 10⁷ cellule per millilitro e 2 × 10⁷ cellule per millilitro in mezzo di marcatura al 3% e trasferire 50 microlitri in provette FACS opportunamente etichettate. Marcare le cellule con MAC uno e il colorante per la vitalità DPI per la citometria a flusso e per le compensazioni con singolo colorante.

Eseguire l'acquisizione dei dati di citometria a flusso per determinare le percentuali di cellule GR1 positivo e GR1 negativo e per confrontare anche le percentuali di MDSC prima e dopo l'arricchimento con AutoMax. Milze sono state prelevate da topi con tumore del pancreas e da topi naïve e processate in sospensioni cellulari singole come descritto in questo articolo video. È stata eseguita la citometria a flusso per esaminare i leucociti naïve, marcati sulla superficie con anticorpi fluorescenti coniugati anti-MAC1 e anti-GR1, come mostrato qui. Solo una percentuale molto bassa, 1,19%, di MDSC positivi per MAC1 e GR1 è stata osservata prima dell'arricchimento con AutoMax. Tuttavia, dopo l'arricchimento della popolazione GR1 positiva, questa sottopopolazione cellulare risulta significativamente più ampia, pari al 10,5% nei topi naïve, ed è ora comparabile al 25,3% nei topi con tumore.

Seguendo questa procedura, altri metodi, tra cui MDSC accelerata, sorting basato su citometria a flusso in esperimenti di trasferimento in vivo, PCR quantitativa in tempo reale e western blotting, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti i meccanismi molecolari responsabili dell'espansione, della migrazione e differenziazione dei MDSC e della loro soppressione delle risposte immunitarie.