Name: Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Scopri il metodo AVEXIS per identificare interazioni deboli tra recettori di membrana e ligandi extracellulari utilizzando una libreria di proteine ricombinanti. Questa tecnica avanzata consente di studiare i processi di riconoscimento cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal numero Wellcome Trust sovvenzione [077108] assegnato a GJW.

1. Compilazione di un Bait and Library of Prey plasmide di espressione Vettori <ol><li> Compilare un elenco di recettori della superficie delle cellule e proteine ​​secrete di interesse da screening di interazioni e recuperare le loro sequenze da un database adeguato sequenza della proteina. La maggior parte delle proteine ​​contenenti un peptide N-terminale di segnalazione secretoria sono adatti (questi includono tipo I, GPI-legati e proteine ​​secrete). Tipicamente, una famiglia di proteine ​​(per esempio superfamiglia delle immunoglobuline o tutti i recettori limitato a un tipo di cellula specifico come il eritrociti) sarebbe selezionato. </li><li> Determinare l&#39;estensione delle regioni extracellulari individuando la posizione del peptide segnale e regione transmembrana con funzionalità software proteina predizione. Usiamo tipicamente v3.0 SignalP 5 e TMHMM v2.0 6. </li><li> Design set di primer che amplificano il frammento intero ectodomain per ciascun recettore. Abbiamo una serie di esca e vettori prede che sono adatti per questo scopo che sonovailable da Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Progettare l&#39;innesco senso intorno all&#39;inizio metionina per includere un sito di restrizione NotI enzima e una sequenza di Kozak ottimale, questo è seguito da 25 coppie di basi di corrispondenza esatta sequenza gene-specifico (Fig. 2A). </li><li> Progettare il primer antisenso per troncare tipo I proteine ​​recettori appena prima della regione transmembrana previsto in modo da esprimere l&#39;intera ectodomain come proteina solubile ricombinante. Includere un sito di restrizione AscI in questo fondo, che dovrebbe poi tradurre in cornice ad un C-terminale di ratto Cd4d3 quattro proteine ​​tag 7 (Fig. 2A). </li><li> Amplificare i frammenti ectodomain di tutti i geni che utilizzano questi primer e clonarli nel esche o vettore di preda. A volte trovano utile prima li clonare in vettori shuttle prima subcloning in un vettore appropriato espressione di mammifero, si usa un derivato del vettore pTT3 3,4. Sia l&#39;esca e la preda vettori contenin C-terminale della proteina tag, come segue (Fig. 2b). <ol><li> Esche: Un tag contenente domini 3 e 4 del CD4 di ratto (Cd4d3 +4) proteine ​​seguiti da una sequenza peptidica che è un substrato per l&#39;enzima Bira E.coli e possono quindi essere monobiotinylated su specifico residuo di lisina (Fig. 2B) . Il Cd4d3 4 tag viene riconosciuto dal anticorpo monoclonale OX68 e viene utilizzato per quantificare l&#39;espressione delle proteine ​​esca da ELISA. Le proteine ​​sono quindi esca monomerica e monobiotinylated. Altri vettori proteina esca qualora la sostituzione del peptide biotinylatable da 6-tag per la sua purificazione sono disponibili. </li><li> Prede: Le prede anche contenere un topo Cd4d3 4 tag seguito da una sequenza peptidica della proteina di ratto matrice cartilaginea oligomerici (COMP) ed un C-terminale dell&#39;enzima β-lattamasi. Il peptide COMP assicura i pentameri preda forme volta espresso (Fig. 2B). </li></ol></li></ol> 2. Prey e Bait-espressione della proteina Usiamoun comodo alto livello di sistema di espressione mediante coltura in sospensione della linea cellulare HEK293E 4 per produrre le librerie di proteine, ma qualsiasi sistema di espressione mammifero dovrebbe essere adatto. Un&#39;alternativa disponibile in commercio è il sistema di Freestyle. Le cellule coltivate vengono abitualmente su una piattaforma di agitazione (125 rpm) a 37 ° C, 5% CO 2 al 70% di umidità relativa. Proteine ​​di controllo sia positive che negative devono essere espresse. Il ratto Cd4d3 4 tag solo frammento è disponibile sia come esca e la preda e sono idonei controlli negativi. Allo stesso modo, i vettori esca e la preda che codificano per un controllo positivo sono disponibili (Addgene); si utilizzano in genere il topo-CD200 CD200R interazione 8. <ol><li> Seme le cellule HEK293E il giorno prima della trasfezione ad una densità di 2,5 x 10 5 cellule mL -1. Noi abitualmente coltivare le cellule in volumi di 50 mL in Freestyle293 mezzi in base alle raccomandazioni del costruttore. Per garantire biotinilazione efficiente, t integrareegli terreno di coltura cellulare utilizzato per produrre proteine ​​esca con D-biotina ad una concentrazione finale di 100 pM. Mezzo usato per esprimere le proteine ​​preda non ha bisogno di essere integrato con ulteriori D-biotina. </li><li> Il giorno seguente, le cellule trasfezione usando un reagente adatto trasfezioni (293fectin es). Uso 25 pg dell&#39;esca o preda costrutti plasmidici per trasfettare cultura a 50 mL. Per produrre le esche biotinilati, co-trasfezione del plasmide codificante il costrutto esca con un plasmide che codifica una forma secreta della proteina-biotina E.coli ligasi ( Bira) che è disponibile da Addgene. Co-trasfezione plasmidi esca un rapporto di 10:1 (2,5 microgrammi) del plasmide codificante la proteina secreta Bira. </li><li> Culture Harvest cinque giorni post-trasfezione di primo pellet delle cellule per centrifugazione a 3000 xg per 20 minuti, seguita da filtrazione del surnatante attraverso un filtro di 0,22 pM. </li></ol> [Suggerimento: Bait e proteine ​​predas deve essere conservato diluiti a 4 ° C e come guida generale deve essere utilizzato entro un anno. Aggiungere batteriostatici quali 50 ug / mL polimixina B solfato o 10 mM NaN 3 per evitare la contaminazione batterica dei supernatanti.] 3. La normalizzazione del Bait e Campioni Prey Una delle caratteristiche principali del saggio AVEXIS è che, poiché le proteine ​​ricombinanti sono secrete possono essere diluiti o concentrati (normalizzato) con l&#39;attività di soglia stabiliti prima di essere utilizzati nel test. Abbiamo trovato che i livelli in cui sono espresse le proteine ​​ricombinanti coprono una vasta gamma - fino a 4 ordini di grandezza - e quindi il passo di normalizzazione riduce significativamente il numero di falsi positivi nelle schermate. 3,1 Bait normalizzazione Nota: non coniugato D-biotina deve essere rimosso dal supporto (tipicamente da dialisi), poiché sarà in competizione con il biotinilato bait proteine ​​per il legame con streptavidina siti di legame. <ol><li> Trasferire surnatanti esche in tubo di dialisi, etichetta, ritagliare in modo sicuro e dializzato ampiamente contro un tampone adatto come PBS per rimuovere biotina libera. </li></ol> [Suggerimento: Abbiamo trovato che la dialisi sufficiente si ottiene normalmente per 6 surnatanti ml x 50 esche contro un volume di 4,5 L di PBS con 4 variazioni nel corso di un periodo di 24 ore. Dialisi insufficiente può essere osservata una inibizione di legame proteico a diluizioni basse durante la fase di normalizzazione esca (Fig. 3A.) <ol start="2"><li> Eseguire un test ELISA per determinare i relativi livelli in cui sono espresse le proteine ​​esca. Preparare una serie di diluizioni delle proteine ​​esca biotinilati e catturare su una placca rivestita con streptavidina microtitolazione. Utilizzare il topo Cd4d3 4 tag per individuare e quantificare le proteine ​​esca catturati utilizzando un anticorpo monoclonale (OX68). Concentrato o diluire le proteine ​​esca per l&#39;importo minimo richiesto per saturare tutto il biotin siti di legame nel pozzetto di una piastra rivestita con streptavidina. </li><li> Bloccare dei pozzetti di una piastra rivestita di streptavidina con tampone fosfato saline/0.1% Tween-20 (PBST) / 2% di sieroalbumina bovina (BSA) per 15 minuti. </li><li> In una piastra separata, una serie di diluizione (quattro diluizioni sono in genere sufficienti 1,3) delle proteine ​​esca in PBST BSA / 2% e il trasferimento di pozzetti di una piastra rivestita con streptavidina. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte in PBST. Aggiungere 100 pl di 2 ug / ml di topo anti-ratto IgG Cd4d3 4 (OX68) incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte in PBST. Aggiungere 100 pl di topo anti-fosfatasi alcalina a 1/5.000 diluizione in PBST / 2% BSA e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte in PBST ed eseguire un lavaggio finale in PBS per rimuovere ogni residuo di detersivo. Aggiungere 100 pl di 1 mg / ml di substrato 104 in tampone dietanolammina (10% dietanolammina (v / v), 0,5 mM MgCl 2, 10 mM NaN 3, pH9.8, protetto dalla luce a 4° C). </li><li> Dopo un&#39;ora, misura l&#39;assorbanza a 405 nm. Rappresentativi dei risultati di normalizzazione esche sono mostrati in figura 3A. </li><li> Bait proteine ​​che vengono espresse a livelli sufficienti per saturare tutti i siti di legame biotina-streptavidina di una piastra rivestita, se usato diluito, dovrebbe essere concentrata usando Vivaspin concentratori (Vivascience, 10kDa MWCO). Come guida, stimiamo che circa il 5 mg di una proteina tipica esca (~ 80 kDa) è sufficiente a saturare un piastra a 96 pozzetti. <ol><li> Bait proteine ​​espresse a livelli elevati può essere diluito in PBST BSA / 2% a una concentrazione sufficiente a saturare la piastra rivestita con streptavidina. L&#39;attività delle esche devono essere verificati dopo la diluizione o concentrazione per garantire che tutti i siti di legame della biotina streptavidina piastra rivestita. </li></ol></li></ol> 3,2 Prey normalizzazione <ol><li> Quantificare i livelli relativi a cui sono espresse le proteine ​​preda con la β-lattamasiL&#39;attività enzimatica. </li><li> Innanzitutto, una serie di diluizioni di supernatante contenente le proteine ​​prede in PBST / 2% tampone BSA. Aggiungere quindi 20 pl delle diluizioni di 60 pl di una 242 pM (0,125 mg / mL) nitrocefina soluzione (Calbiochem). </li><li> Immediatamente trasferire la piastra ad un lettore di micropiastre che accetta una misurazione di assorbanza a 485 nm ogni minuto per 20 minuti a temperatura ambiente. Rappresentativi dei risultati di normalizzazione prede sono mostrati in figura 3B. </li><li> Concentrato campioni con centrifuga concentratori o diluire in PBST / 2% BSA per raggiungere una soglia di attività ~ 2 nmol min -1 fatturato di nitrocefina. In pratica, questo si ottiene se tutto il nitrocefina viene idrolizzato in ~ 7 minuti. </li></ol> 4. AVEXIS Procedura di screening <ol><li> Lavare streptavidina piastra rivestita in PBST. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di PBST / 2% BSA in ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti per bloccare altri siti di legame delle proteine ​​spuri all&#39;interno di ogni bene. </li&gt; </ol> [Suggerimento: per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio dopo operazioni di lavaggio, la lastra viene sfruttato - con forza - su carta assorbente] <ol start="3"><li> Rimuovere la soluzione di saturazione con un colpo intelligente della piastra sopra un lavandino e aggiungere 100 microlitri normalizzato esca biotinilato monomerico ai pozzetti ed incubare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere i campioni esca dalla piastra ribaltando il piatto e intelligente flicking sopra un lavandino, e lavare 3 volte in PBST. </li><li> Aggiungere 100 pl della preda normalizzato pentamerized costrutto a ciascun pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora, lavate come nel passaggio 4,4 ed eseguire un lavaggio finale con PBS solo. </li><li> Aggiungere 60 ml di soluzione pM 242 nitrocefina (sciogliere 5 mg di nitrocefina in 500 microlitri di DMSO, mescolare accuratamente e poi ulteriormente diluire il nitrocefina in 40 ml di PBS e passare attraverso un filtro 0,22 uM prima di aggiungere alle piastre) e incubare a temperatura ambiente . Interazioni positivi può osservarea occhio poiché la nitrocefina giallo viene idrolizzato ad un colore rosso. Quantificare leggendo l&#39;assorbanza a 485 nm usando un lettore di piastre. Una piastra tipica e quantificazione è mostrato in fig. 4. </li></ol> [Suggerimento: interazioni positive si osservano di solito entro 2 ore a temperatura ambiente, anche se le piastre devono essere posizionati a 4 ° C per 16 ore per garantire che tutti i potenziali interazioni vengono rilevati. Abbiamo anche scoperto che nitrocefina precipitato e imperfezioni sulla plastica della piastra di microtitolazione come graffi / impronte digitali può talvolta portare a falsi positivi artefattuali a 485 nm, nonostante non idrolisi nitrocefina palese. Si consiglia pertanto di scattare fotografie delle piastre per registrare visivamente fatturato nitrocefina nei pozzetti.] 5. Risultati rappresentativi Un esempio rappresentativo di una piastra di screening AVEXIS è mostrato in Figura 4. Si dovrebbe osservare idrolisi (giallo al rosso) del substrato nitrocefina nellapositiva dei pozzetti di controllo (sia mediata da anticorpi di controllo cattura della preda e anche l&#39;interazione controllo positivo) entro una decina di minuti. Alcune interazioni all&#39;interno dello schermo si osservano anche all&#39;interno di questo lasso di tempo, ma altri possono richiedere più tempo (poche ore) a comparire. Tipicamente, un hit-rate di circa 0,4-0,6% (un&#39;interazione positiva per ogni 150-250 interazioni state selezionate) è tipico, a seconda delle librerie di proteine ​​state selezionate. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" /> Figura 1. Identificazione del recettore-ligando interazioni cellulari che mediano i processi di riconoscimento con AVEXIS. Lo schema mostra due cellule interagenti (A e B) che scambiano informazioni attraverso le interazioni effettuate tra membrana incorporati proteine ​​recettoriali. AVEXIS è scalabile saggio interazione proteina specificamente progettato per identificare nuovi recettore-ligando coppie che sono caratterizzate da forze di interazione molto deboli. Ricombinante cosìbiblioteche luble proteine ​​che rappresentano il ectodomain tutto il repertorio recettore sulla superficie cellulare di entrambe le cellule vengono compilate sia come pentamerica prede β-lattamasi-etichetta (tipo di cellula A) o monomeriche esche biotina-tag (per cellule di tipo B). La pentamerisation del prede aumenta la concentrazione locale dei ectodomains di effettuare un guadagno complessivo avidità modo che le interazioni anche molto transitori possono essere rilevati. La biblioteca esca è disposti su piastre rivestite di streptavidina e sistematicamente sondato per le interazioni con le proteine ​​preda. Dopo un lavaggio breve, tutte le prede catturate vengono rilevati utilizzando il β-lattamasi attività associate con la preda. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" /> Figura 2. Bait and costrutto progettazione preda. (A) Il CD200 proteina recettore di ratto è fornito come un esempio di come i ectodomains intero proteine ​​di superficie cellulare recettori sono determinate e primer sono progettati per effettuare sia escae prede costrutti di espressione. La sequenza di proteina tradotta cDNA e vengono visualizzati dal N-terminale del peptide segnale al transmembranale regione transmembrana di ratto CD200. Un innesco senso è progettato per includere un sito 5 &#39;enzima di restrizione NotI e la sequenza di Kozak ottimale seguita da 25 basi della sequenza corrisponde esattamente alla sequenza di cDNA CD200. L&#39;innesco antisenso contiene un sito AscI e 25 basi della sequenza esatta corrispondenza situato immediatamente a monte del residuo selezionato troncamento ectodomain. Per mantenere la ectodomain in frame con il ratto Cd4d3 4 tag, il sito AscI dovrebbe tradursi come Gly-Ala-Pro. (B) Una rappresentazione schematica delle esche e costrutti di espressione preda. Ogni recettore contiene ectodomains fiancheggiati da NotI e siti ASCI e uno Cd4d3 4 tag. Le esche contengono un C-terminale sequenza peptidica che può essere specificamente monobiotinylated da coinfezione con un plasmide che esprime un enzima secreto Bira. Le prede sono seguiti dalla sequenza pentamerisationdalla proteina matrice cartilaginea oligomerica (COMP) e la β-lattamasi enzima. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" /> Figura 3. La normalizzazione dei dell&#39;esca e proteine ​​preda. (A) esempi rappresentativi di normalizzazione esca. Una serie di diluizioni di quattro differenti esca dialisi supernatanti sono stati rilevati mediante ELISA utilizzando un anticorpo anti-CD4 monoclonale tag. I quattro esche sono espressi a diversi livelli 1&gt; 2&gt; 3&gt; 4. Le esche devono essere normalizzati a un livello di soglia che satura i siti di legame biotina in ciascun pozzetto. Esche altamente espresse possano essere diluito per conservare le proteine ​​(ad esempio esca 1 potrebbe essere diluito ~ 1:100), esche e mal espressi concentrato. Letture diminuiti a basse diluizioni sono talvolta osservati in alcuni esche (es. esche 2) che è imputabile alla presenza di D-biotina coniugato a causa di dialisi incomplete. (B) I livelli a cui sono vittime le proteine ​​sono expressato è quantificato utilizzando il tasso di idrolisi di un β-lattamasi substrato, nitrocefina. Nell&#39;esempio illustrato, le tre prede sono espressi a livelli diversi: preda 1&gt; 2&gt; 3. Prede devono essere normalizzati un&#39;attività di ~ 2 nmol min -1, che corrisponde a completare idrolisi di 14,5 nmol nitrocefina in ~ 7 minuti (es preda 1). Le prede di altri in questo esempio dovrebbe essere concentrata prima dell&#39;uso nello screening. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentativi AVEXIS screening risultati. (A) una fotografia di un rappresentante piastra di screening AVEXIS. Una proteina contro la preda viene sondato 41 esche diverse e una positiva interazione viene rilevato in E2 bene. Controlli utilizzati nei piatti di screening comprendono: un biotinilato anti-CD4 anticorpi per catturare tutte le proteine ​​preda aggiunto al bene (G6), una interazione controllo: rat CD200 (esche)-CD200R (prede) con il CD200R preda utilizzato alla diluizione di soglia (H3), 1:10 (H4) e 1:100 (H5). I controlli negativi erano: uno Cd4d3 4 esca sondati con la proteina preda essere proiettato (H1) e la preda CD200R (H2). (B) Quantificazione dei valori di assorbanza della stessa schermata effettuata in triplicato. I punti dati sono media ± SD.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Quando le cellule viventi sono osservate in vivo, le membrane plasmatiche mostrare comportamenti altamente dinamici: estendere e processi a membrana a scomparsa in quanto si mettono in contatto e comunicare con loro due vicini. Le interazioni fisiche tra le membrane-embedded proteine ​​recettori che mediano molti di questi contatti sono evoluti per essere estremamente debole in modo da permettere questo comportamento altamente mobili. E &#39;stato stimato che le forze di interazione debole come monomerici 50 micron potrebbe essere sufficiente a guidare le interazioni spontanee a densità dei recettori fisiologici 9 che fa rilevare nuove interazioni estremamente impegnativi 2,10. Il metodo AVEXIS qui descritto fornisce un metodo sensibile per rilevare transitori proteina extracellulare: interazioni proteiche che possono essere implementate in maniera scalabile con un basso tasso di falsi positivi. Mentre altri metodi scalabili sono stati sviluppati per rilevare le interazioni extracellulari 11-15,Un vantaggio di AVEXIS è che i parametri sperimentali come l&#39;esca e la preda attività sono state quantificate per rilevare anche la più debole delle interazioni (t 1/2 ≤ 0,1 s), pur mantenendo un basso tasso di falsi positivi 3. Inoltre, le procedure semplificate e robusta preparazione del campione hanno permesso questo test da attuare su una scala molto più grande di altri test e abbiamo recentemente descritto una schermata sistematica interazione ~~~HEAD=NNS un totale di oltre 16.500 potenziali interazioni 16. Il dosaggio può essere eseguita su qualsiasi proteina per la quale è possibile esprimere un frammento solubile proteina ricombinante. Questo include pertanto proteine ​​che contengono un peptide N-terminale come segnale di tipo I, GPI-legati e proteine ​​secrete. Recentemente abbiamo progettato una serie di vettori che ora ci consentono di esprimere proteine ​​di tipo II come esche 17. Il saggio non è generalmente indicato per le proteine ​​di membrana multipass come trasportatore di ionis o pompe in quanto è improbabile che possano essere correttamente piegato al di fuori del contesto di una membrana plasmatica. Abbiamo applicato questo per una varietà di sistemi diversi e si sono espressi con successo proteine ​​extracellulari da zebrafish 3,16,18, umano, mouse e P. falciparum per schermi di interazione. In termini di risorse necessarie per impostare uno schermo AVEXIS, abbiamo scoperto che un collo di bottiglia significativo è la costruzione, selezione e completo sequenziamento dei plasmidi di espressione. Questo aspetto del metodo può richiedere fino a un anno per fare ~ 100 esche e costrutti prede, tuttavia, con il costo diminuzione della sintesi del gene, ora favorire commercialmente outsourcing questo aspetto del progetto. Il sistema mammifero di espressione insieme ad un grande incubatore per colture scuotimento del tessuto (si usa un cellulare Multitron INFORS HT) consente a un singolo ricercatore di esprimere e normalizzare fino a ~ 100 esche e le proteine ​​preda di un mese. Una volta che le proteine ​​sono prodotte e normalizzati, screening per le interazioni è rapido con fino a dodici piastre a 96 pozzetti essere convenientemente lavorati al giorno. L&#39;apparecchiatura solo su misura che abbiamo sviluppato per facilitare la produzione di un grande numero di proteine ​​è aria compressa-driven pistone che viene utilizzato per passare fino a cinque supernatanti attraverso un filtro 0.22μm in parallelo. La classe principale di interazioni che potrebbero perdere rispetto alle interazioni attesi dalla letteratura (falsi negativi) sono interazioni omofili, anche se alcune di queste interazioni possono essere rilevati 3. Nei casi in cui interazioni previsti non vengono rilevati, riteniamo che questo è dovuto alla formazione di interazioni omofili dalle proteine ​​preda (preda effetto &quot;mascheratura&quot;) che impedisce poi ulteriori interazioni con proteine ​​esca immobilizzate. La frequenza con cui vengono rilevate le interazioni dipende dal contenuto della biblioteca proteina sottoposta a screening. Come guida per il lettore, uno schermo di&gt; 30, 000 le interazioni all&#39;interno della superfamiglia delle immunoglobuline zebrafish portato a 188 positivi - una frequenza di 0,6% 3,16,18. Un controllo molto rapido che può essere eseguito per verificare eventuali colpi positivi è determinare se l&#39;interazione può essere rilevato in entrambe esca-prede orientamenti, che è, può essere la stessa interazione rilevato indipendentemente se le proteine ​​leganti sono presenti sia come esca o di una preda. Ogni volta che abbiamo osservato questo comportamento reciprocità, l&#39;associazione è stato successivamente dimostrato di essere specifico, dimostrando diretto legame saturabile di proteine ​​purificate mediante risonanza plasmonica di superficie. Va sottolineato che, poiché si aumenta avidità vincolante artificialmente pentamerising le proteine ​​preda, non consideriamo il test adatto per confrontare quantitativamente i punti di forza di interazione. Per ottenere i parametri biofisici legame di interazione che usiamo proteine ​​monomeriche e risonanza plasmonica di superficie. Infine, una volta una interazione è stato identificato, l&#39;hinatura velocità gh del dosaggio rende relativamente facile adattare il saggio di schermo per reagenti quali anticorpi o piccole molecole che bloccano l&#39;interazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Cat. Numero </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Freestyle dei media </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocefina </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SA-piastre di microtitolazione rivestite </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 anticorpi </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Dialisi tubi </td><td> Perforare </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> Polimixina B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-biotina </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Substrato-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 centrifugo concentratori </td><td> Sartorius </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 micron filtri </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

avidità-based screening interaction extracellulare (avexis) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Proteina extracellulare: le interazioni tra proteine ​​secrete o di membrana guinzaglio proteine ​​sono fondamentali per la coesione iniziare la comunicazione intercellulare e di garantire all&#39;interno di organismi pluricellulari. Proteine ​​previsto per formare interazioni extracellulari sono codificati da circa un quarto di geni umani 1, ma nonostante la loro importanza e abbondanza, la maggior parte di queste proteine ​​non hanno documentato partner di legame. Principalmente, ciò è dovuto alla loro intrattabilità biochimica: proteine ​​di membrana-embedded sono difficili da solubilizzare nella loro conformazione nativa e contengono modificazioni post-traduzionali strutturalmente importanti. Inoltre, le affinità di interazione tra proteine ​​recettori sono spesso caratterizzate da forze di interazione estremamente basse (emivita &lt;1 secondo) precludendo la loro rivelazione con molti metodi abituali high throughput 2. Qui, descriviamo un saggio, AVEXIS (Avidità-based extracellularelar Interaction Screen) che vince queste sfide tecniche che consentono la rilevazione delle interazioni proteiche molto deboli (t 1/2 ≤ 0,1 sec) con un basso tasso di falsi positivi 3. Il saggio è generalmente implementato in un formato alto rendimento per consentire lo screening sistematico di molte migliaia di interazioni in un formato conveniente micropiastra (Fig. 1). Essa si basa sulla produzione di proteine ​​ricombinanti solubili librerie che contengono i frammenti ectodomain di recettori di superficie cellulare o proteine ​​secrete entro il quale per schermare interazioni, pertanto, questo approccio è adatto per il tipo I, di tipo II, GPI-linked recettori di superficie cellulare e secreta proteine, ma non per le proteine ​​di membrana multipass quali canali ionici e trasportatori. Le librerie di proteine ​​ricombinanti vengono prodotte usando un sistema pratico e di alto livello di espressione mammifero 4, per garantire che le modifiche post-traduzionali importanti quali glycosylazione e di legami disolfuro sono aggiunti. Espressa proteine ​​ricombinanti sono secreti nel mezzo e prodotta in due forme: una esca biotinilato che può essere catturato su una rivestita di streptavidina fase solida adatta per lo screening, e un pentamerised enzima-tag (β-lattamasi) preda. L&#39;esca e proteine ​​preda sono presentati l&#39;uno all&#39;altro in modo binario di rilevare le interazioni dirette tra loro, analogamente a una convenzionale ELISA (Fig. 1). La pentamerisation delle proteine ​​la preda è ottenuta attraverso una sequenza peptidica della proteina di matrice cartilaginea oligomerica (COMP) e aumenta la concentrazione locale dei ectodomains fornendo in tal modo vantaggi significativi avidità per consentire interazioni anche molto transitori da rilevare. Normalizzando le attività sia l&#39;esca e la preda a livelli predeterminati prima della proiezione, abbiamo dimostrato che le interazioni che hanno monomeriche emivite di 0,1 sec possono essere rilevati con bassi tassi di falsi positivi 3.

AVEXIS è un saggio di rendimento elevato di proteine ​​di interazione sviluppate per lo screening sistematico per nuovi extracellulare del recettore-ligando coppie coinvolte in processi di riconoscimento cellulare. Si è specificamente progettato per rilevare le interazioni proteina transitori che sono difficili da identificare usando altri metodi di high throughput.

Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

Le interazioni proteina-proteina extracellulari tra proteine secrete o ancorate alla membrana sono fondamentali sia per l'avvio della comunicazione intercellulare che per...

L'obiettivo generale di questa procedura è scoprire nuove interazioni proteiche extracellulari coinvolte nei processi di riconoscimento cellulare, in particolare proteine recettoriali incorporate nella membrana. L'approccio AveXis è progettato per aggirare le affinità di interazione estremamente deboli tipiche di questa classe di interazioni proteiche e il fatto che le proteine di membrana siano difficili da manipolare dal punto di vista biochimico. Questo viene ottenuto innanzitutto compilando una libreria proteica ricombinante delle regioni extracellulari dei recettori di superficie cellulare.Questo viene ottenuto progettando plasmidi di espressione per produrre le regioni del dominio ecto dei recettori come frammenti solubili, sia come sonde monomeriche biotinilate sia come sonde pentameriche marcate enzimaticamente. Il secondo passaggio consiste nell'esprimere e normalizzare le proteine per renderle pronte per il screening delle interazioni. Tutte le proteine vengono prodotte in cellule mammifere per garantire che vengano aggiunte le modifiche post-traduzionali come legami disolfuro, legami solfidici e glicosilazione.Una fase cruciale del protocollo consiste nell'assicurare che le proteine esca e preda all'interno della libreria siano tutte normalizzate entro livelli soglia. Segue quindi la parte più interessante, ovvero lo screening di nuove interazioni. Le Bates vengono distribuite in pozzetti individuali di una piastra micro e successivamente vengono analizzate per rilevare le interazioni mediante l'uso della praise.Successivamente viene eseguito un passaggio di lavaggio. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiungere il substrato per l'enzima al fine di rilevare qualsiasi proteina bersaglio catturata negli array di proteine esca. In definitiva, i risultati di un esame VEX possono mostrare quali recettori sulla superficie cellulare sono in grado di formare interazioni di legame e che quindi potrebbero essere coinvolti nei processi di riconoscimento e comunicazione tra le cellule.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi popolari di estrazione proteica, come il sistema di due ibridi nel lievito o le purificazioni biochimiche, è che essa è stata progettata specificamente per rilevare interazioni proteina-proteina extracellulari. È particolarmente adatta per scoprire nuove interazioni tra proteine recettoriali ancorate alla membrana. Queste interazioni sono difficili da rilevare con altre tecniche poiché le proteine di membrana sono biochimicamente difficili da manipolare e le loro interazioni con i recettori corrispondenti sono tipicamente estremamente deboli.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardanti il modo in cui le cellule riconoscono e comunicano tra loro. A livello molecolare, può essere utilizzato per rispondere a domande relative a processi biologici di base, come ad esempio quali proteine recettoriali espresse sulla superficie di uova e spermatozoi si legano tra loro, oppure quali interazioni tra recettori e ligandi sono responsabili di comportamenti cellulari come la fusione dei miociti o la formazione della cresta neurale. La principale difficoltà di questo approccio consiste nel compilare le librerie proteiche di esca e di preda all'interno delle quali effettuare la ricerca di interazioni.È inoltre molto importante assicurarsi che le proteine esca e preda siano normalizzate entro i livelli soglia richiesti per il saggio. Questo riduce la frequenza di risultati falsi negativi e falsi positivi. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo durante il mio dottorato, quando stavo cercando di identificare un partner d'interazione per la proteina di superficie cellulare CD 200.Fondamentalmente, mi stavo ponendo la domanda: qual è il profilo di legame per questo particolare recettore di superficie cellulare? Ancora oggi? Questa rimaneva all'epoca una domanda tecnicamente difficile da rispondere. Tuttavia, il genoma umano era ormai prossimo al completamento e mi resi conto che, poiché disponevamo ormai di un elenco completo di tutti i recettori di superficie cellulare presenti nel genoma, avremmo potuto invece chiederci, all'interno di questo insieme di proteine recettrici, quali potessero interagire tecnicamente.Questa è una domanda molto più facile da rispondere, e AveXis era il metodo che abbiamo sviluppato per rispondervi. Una volta ottenuta una libreria di vettori di espressione per l'esca e per il pre, preparatevi a trasfettarli in cellule HEC 2 9 3 E iniziando a seminare le cellule il giorno precedente la trasfezione a una densità di 250.000 cellule per millilitro in 50 millilitri di mezzo freestyle 2 9 3 per garantire un'efficiente eluizione della biotina. Integrate il mezzo utilizzato per produrre le proteine esca, non le proteine preda, con d-biotina; una volta pronte tutte le piastre, incubate le cellule tutta la notte in condizioni standard.Dato che la biotina ha una bassa solubilità e una soluzione accurata, si preferisce pesare la biotina aggiuntiva e quindi aggiungerla al mezzo agitando vigorosamente il giorno successivo. Trasfettare 50 millilitri di cellule in coltura con 25 microgrammi del plasmide esca o preda utilizzando un reagente di trasfezione adeguato per produrre esche biotinilate; effettuare la cotrasfezione del costrutto esca in un rapporto di 10 a 1 con plasmidi che codificano una forma secreta della proteina ELI, ligasi della biotina, prima del raccolto.Le colture a cinque giorni dal transfezione vengono dapprima chiarificate centrifugando le cellule a 3000 volte la forza di gravità per 20 minuti e successivamente filtrando il surnatante S attraverso un filtro da 0,22 micron. Una delle caratteristiche principali di AveXis è che, poiché le proteine ricombinanti sono secrete, possono essere diluite o concentrate entro soglie di attività. Abbiamo osservato che le proteine ricombinanti presentano un'espressione variabile fino a quattro ordini di grandezza; pertanto, il passaggio di normalizzazione riduce l'insorgenza di falsi positivi durante le fasi di screening.Per iniziare la normalizzazione dell'esca, la desbiotina non coniugata deve essere rimossa dal mezzo mediante dialisi, poiché competerebbe con l'esca biotinilata per il legame ai siti di legame della streptavidina. Iniziare fissando l'esca in un tubo da dialisi. Per garantire una dialisi efficace delle proteine ricombinanti, abbiamo riscontrato che è importante fornire un'elevata superficie al tubo da dialisi. Tipicamente, utilizziamo da due a tre volte più tubo di quanto effettivamente richiesto per il volume da dializzare.Nel corso di un periodo di 24 ore, dializzare abbondantemente l'esca contro un buffer idoneo, come PBS, dopo aver eseguito la dialisi. Un ELIZA inizia bloccando le pozzette di una piastra microtiter codificata con streptavidina con PBST contenente BSA per 15 minuti. Nel frattempo, su una piastra pulita, preparare una serie di quattro diluizioni uno a tre delle proteine esca in PBST con BSA al 2%.Dopo l'incubazione di 15 minuti, trasferire la diluizione nella piastra codificante strep TTR e incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente; trascorsa un'ora, lavare le pozzette e quindi aggiungere a ciascuna pozzetta 100 microlitri di OX 68 a due microgrammi per millilitro. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ulteriore ora. Al termine della seconda incubazione, eseguire un'altra serie di lavaggi e aggiungere alla piastra l'anticorpo anti-US coniugato con fosfatasi alcalina.Incubare la piastra per un ulteriore ora a temperatura ambiente. A questo punto, lavare la piastra tre volte con PBST ed eseguire un ultimo lavaggio con PBS. Per rimuovere qualsiasi residuo di detergente, aggiungere 100 microlitri di substrato 1 0 4 a una concentrazione di un milligrammo per millilitro nel buffer di dietanolammina dopo un'ora.A temperatura ambiente, misurare l'assorbanza a 4 0 5 nanometri. Una serie di diluizioni di quattro diversi sobbrenatanti di esca dializzati è stata rilevata mediante ELISA utilizzando un anticorpo monoclonale anti-tag CD4. Se le proteine di esca espresse non diluite non sono sufficienti a saturare tutti i siti di legame della biotina su una piastra rivestita con streptavidina, concentrare la proteina utilizzando un concentratore Viva-spin. In caso contrario, utilizzare la proteina di esca a una concentrazione diluita in PBST con il 2% di BSA.Questa quantità è sufficiente per saturare il sito di legame della biotina nel saggio. Quantificare i livelli relativi di espressione delle preproteine utilizzando l'attività enzimatica della beta-lattamasi. Iniziare preparando una serie di diluizioni del sopernatante contenente le paraproteine in tampone PBST con 2% BSA.Quindi aggiungere 20 microlitri della diluizione a 60 microlitri di una soluzione di nitros stepin caricata in una piastra. Trasferire immediatamente la piastra in un lettore di piastre e misurare l'assorbanza a 485 nanometri una volta al minuto per i successivi 20 minuti utilizzando concentratori centrifughi o PBST diluito con 2% BSA. Impostare la concentrazione finale dei campioni in modo da idrolizzare tutti i nitros nel saggio in circa sette minuti, pari a circa due turnover di nitros al minuto.Avviare la schermata AveXis lavando una piastra rivestita con strep TAVR ENC in PBST e asciugando la piastra tamponandola delicatamente su un tovagliolo di carta. Successivamente, aggiungere PBST con BSA in ogni pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti. Questo passaggio blocca i siti di legame proteici spurii.In ciascun pozzetto, rimuoveremo la soluzione di blocco con un rapido movimento della piastra sopra un lavello e aggiungeremo 100 microlitri di esca monomerica biotinilata normalizzata nei pozzetti appropriati. Incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere i campioni di esca dalla piastra con un altro rapido movimento e lavarli tre volte con PBST.Quindi asciugare tamponando dopo il terzo lavaggio. Aggiungere ora 100 microlitri del costrutto preda pentamerico normalizzato in ogni pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Trascorsa un'ora, eseguire altri tre lavaggi con PBST e un lavaggio finale con PBS soltanto.Infine, aggiungere 60 microlitri di soluzione nitrosa sette in ogni pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore, oppure, preferibilmente, incubare le piastre per 16 ore a quattro gradi SIU. Il giorno successivo, le interazioni positive saranno diventate rosse. Scattare una fotografia della piastra per ottenere una documentazione visiva, quindi quantificare le reazioni a un'assorbanza di 485 nanometri utilizzando un lettore di piastre.Dopo circa 10 minuti dall'inizio della reazione di screening AveXis, si sono osservati cambiamenti di colore dal giallo al rosso sia nel controllo dell'acquisizione dell'analita mediata da anticorpo sia nell'interazione del controllo positivo. Questo cambiamento di colore indica l'idrolisi del nitrito nel substrato. Alcune interazioni positive sono osservabili su questa scala temporale, ma la maggior parte richiede alcune ore per apparire.Di norma, si osserva un tasso di riscontro di circa lo 0,4-0,6% di positivi. Una volta preparate le librerie proteiche, la fase di screening di questa tecnica può essere eseguita rapidamente. È del tutto possibile esaminare fino a 12 piastre in un giorno dopo aver identificato un'interazione.Il passo successivo più importante è innanzitutto dimostrare che l'interazione può essere ripetuta utilizzando preparazioni proteiche indipendenti e fresche. In secondo luogo, verifichiamo sempre se l'interazione è indipendente dall'orientamento esca-prede, ovvero se può essere reciproca. Ciò richiede il clonaggio dei domini del vettore esca nel vettore preda e viceversa.Si ritiene che le interazioni che possono essere ripetute e reciprocate siano ad alta affidabilità e sono sempre state dimostrate positive. Utilizzando altre tecniche come la risonanza plasmonica di superficie, preferiamo impiegare la risonanza plasmonica di superficie per convalidare ulteriormente tutte le interazioni che identifichiamo nuovamente. È importante sottolineare che questo approccio dimostra come i due componenti purificati possano interagire direttamente e può inoltre essere utilizzato per mostrare che il legame è saturo e quindi specifico.

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