Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di scoprire nuove interazioni proteiche extracellulari coinvolte nei processi di riconoscimento cellulare, in particolare le proteine recettoriali incorporate nella membrana. L'approccio AveXis è progettato per aggirare le affinità di interazione molto deboli che caratterizzano questa classe di interazioni proteiche e il fatto che le proteine di membrana sono difficili da manipolare biochimicamente. Ciò si ottiene compilando prima una libreria proteica ricombinante delle regioni extracellulari dei recettori della superficie cellulare.

Ciò si ottiene progettando plasmidi di espressione per produrre le regioni del dominio ecto dei recettori come frammenti solubili sia come esche biotinilate monomeriche che come enzima pentamero etichettato con lode. Il secondo passo consiste nell'esprimere e normalizzare le proteine per essere pronte per lo screening delle interazioni. Tutte le proteine sono prodotte in cellule di mammifero per garantire l'aggiunta di modifiche post-traduzionali come diss, solfuro, legami e glicosilazione.

Un passaggio cruciale del protocollo consiste nel garantire che le proteine dell'esca e della preda all'interno della libreria siano tutte normalizzate entro i livelli di soglia. Poi arriva la parte eccitante, lo screening per nuove interazioni. I Bates vengono disposti in pozzetti individuali di una piastra microt e quindi sondati per le interazioni utilizzando la lode.

Quindi viene eseguita una fase di lavaggio. Il passaggio finale consiste nell'aggiungere il substrato per l'enzima per rilevare eventuali lodi catturate sulle matrici di proteine esca. In definitiva, i risultati di uno screening VEX possono mostrare quali recettori di cell surfers sono in grado di formare partner di legame e possono quindi essere coinvolti nei processi di riconoscimento e comunicazione tra le cellule.

Il vantaggio principale di questa tecnica di metodi di estrazione proteica popolari, come le due purificazioni ibride o biochimiche del lievito, è che è specificamente progettata per rilevare le interazioni proteiche extracellulari. È particolarmente adatto per scoprire nuove interazioni tra le proteine dei recettori legati alla membrana. Queste interazioni sono difficili da rilevare con altre tecniche perché le proteine di membrana sono biochimicamente difficili da manipolare e in genere le loro interazioni con i controrecettori sono estremamente deboli.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative al modo in cui le cellule si riconoscono e comunicano tra loro. A livello molecolare, può essere utilizzato per rispondere a domande relative a processi biologici di base, come ad esempio quali proteine recettoriali visualizzate sulla superficie di uova e spermatozoi si sono combinate tra loro, o quali interazioni con i ligandi recettoriali sono responsabili di comportamenti cellulari come la fusione dei miociti o la formazione della cresta neurale. La sfida principale con questo approccio è quella di compilare le librerie di proteine esca e preghiera all'interno delle quali selezionare le interazioni.

È anche molto importante assicurarsi che le proteine dell'esca e della preda siano normalizzate entro i livelli di soglia richiesti per il test. In questo modo si riducono i falsi negativi e la frequenza dei falsi positivi. Ho avuto l'idea di questo metodo durante il mio dottorato di ricerca, quando stavo cercando di identificare un partner di legame per la proteina di superficie cellulare CD 200.

Essenzialmente, mi stavo ponendo la domanda, qual è il modello di legame per questo particolare recettore della superficie cellulare? Anche oggi? Questa rimane una domanda tecnicamente difficile a cui rispondere a quel tempo, tuttavia, il genoma umano era quasi in fase di completamento e mi resi conto che, poiché ora avevamo un elenco completo di tutti i recettori della superficie cellulare nel genoma, ora potevamo invece chiedere all'interno di questo insieme di proteine recettoriali che possono interagire tecnicamente.

È una domanda molto più facile a cui rispondere e AveXis è stato il metodo che abbiamo sviluppato per rispondere. Una volta stabilita una libreria di esche e vettori di pre-espressione, preparatevi a trasfettarli in cellule HEC 2 9 3 E iniziate seminando le cellule il giorno prima della trasfezione a una densità di 250.000 cellule per millilitro in 50 millilitri di terreno freestyle 2 9 3 per garantire un'efficiente euforia della biotina. Integrare il terreno utilizzato per produrre le proteine dell'esca, non le proteine della preda con la biotina d con tutte le piastre preparate, incubare le cellule durante la notte in condizioni standard.

Poiché la biotina ha una bassa solubilità e una soluzione accurata, preferiamo pesare la biotina aggiuntiva e poi aggiungerla al terreno e agitare energicamente il giorno successivo. Trasfettare 50 millilitri di cellule coltivate con 25 microgrammi di plasmide esca o preda utilizzando un reagente di trasfezione adatto per produrre esche biotinilate cot transfetto. L'esca si costruisce con un rapporto di 10 a uno con plasmidi che codificano una forma secreta della proteina ELI biotina ligasi per un raccolto.

Le colture cinque giorni dopo la trasfezione prima pallidano le cellule mediante centrifugazione a 3000 volte la gravità per 20 minuti e poi filtrando il surnatante S attraverso un filtro da 0,22 micron. Una delle caratteristiche chiave di AveXis è che, poiché le proteine ricombinanti sono secrete, possono essere diluite o concentrate all'interno delle attività di soglia. Abbiamo scoperto che le proteine ricombinanti hanno un'espressione variabile fino a quattro ordini di grandezza, quindi la fase di normalizzazione riduce il verificarsi di falsi positivi durante le fasi di screening.

Per iniziare la normalizzazione dell'esca, la biotina non coniugata deve essere rimossa dal terreno mediante dialisi poiché competerà per la proteina dell'esca biotinilata per il legame con lo strept nei siti di legame iniziando fissando l'esca in una provetta per dialisi. Per garantire un'efficace dialisi delle proteine ricombinanti, abbiamo scoperto che è importante fornire una superficie eccessiva al tubo di dialisi. In genere, forniamo da due a tre volte più tubi di quelli effettivamente necessari per il volume da dializzare.

Per un periodo di 24 ore, dializzare ampiamente l'esca contro un tampone adatto come PBS dopo l'esecuzione della dialisi. Un ELIZA inizia bloccando i pozzetti di una piastra microt codificata con streptococco con PBST contenente BSA per 15 minuti. Nel frattempo, su una piastra pulita, eseguire una serie di quattro diluizioni da una a tre delle proteine esca in PBST con il 2% di BSA.

Dopo l'incubazione di 15 minuti, trasferire la diluizione sulla piastra codificata per streptococco TTR e incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente dopo un'ora, lavare i pozzetti e poi a ciascuno, aggiungere bene 100 microlitri di due microgrammi per millilitro OX 68. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'altra ora. Dopo la seconda incubazione, eseguire un'altra serie di lavaggi e caricare la piastra con fosfatasi alcalina anti-USA.

Incubare la piastra per una terza ora a temperatura ambiente. Ora lavate la piastra tre volte in PBST e datele un lavaggio finale PBS. Per rimuovere eventuali residui di detersivo, aggiungere 100 microlitri di un milligrammo per millilitro di substrato 1 0 4 in tampone di etanolammina dopo un'ora.

A temperatura ambiente misurare l'assorbanza di 4 0 5 nanometri, una serie di diluizione di quattro diversi supinato di esca dializzata è stata rilevata da Eliza utilizzando un anticorpo monoclonale anti CD a quattro tag. Se le proteine dell'esca express non diluite sono insufficienti a saturare tutti i siti di legame della biotina di una piastra rivestita di ENC avida di streptococco, concentrare la proteina utilizzando un concentratore di spin Viva. In caso contrario, utilizzare la proteina esca a una concentrazione diluita in PBST con il 2% di BSA.

Questo è appena sufficiente per saturare il sito di legame della biotina del saggio. Quantificare i livelli relativi ai quali le pre proteine sono espresse utilizzando l'attività dell'enzima beta lattamasi. Iniziare facendo una serie di diluizioni del supinato contenente le paraproteine nel tampone PBST 2%BSA.

Quindi aggiungere 20 microlitri di diluizione a 60 microlitri di una soluzione di stepina nitrosa caricata in una piastra. Trasferire immediatamente la piastra in un lettore di piastre e misurare l'assorbanza di 4 85 nanometri una volta al minuto per i successivi 20 minuti utilizzando concentratori centrifughi o diluizione PBST con 2%BSA. Impostare la concentrazione finale dei campioni per idrolizzare tutti i nitro nel saggio in circa sette minuti, che è circa due ol di ricambio di nitro al minuto.

Inizia lo schermo AveXis lavando una piastra rivestita con streptococco TAVR ENC in PBST e picchiettando la piastra per asciugarla su un tovagliolo di carta. Quindi, aggiungere PBST con BSA a ciascun pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti. Questo blocca i siti di legame delle proteine spurie.

All'interno di ciascuno, rimuovere la soluzione bloccante con un colpo intelligente della piastra su un lavandino e aggiungere 100 microlitri di esca monomerica biotinilata normalizzata nei pozzetti appropriati. Incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente. Quindi rimuovere i campioni di esca dalla piastra con un altro colpo e lavarla via tre volte con PBST.

Quindi asciugare dopo il terzo lavaggio. Ora aggiungi 100 microlitri del costrutto di preda pentamero normalizzato a ciascun pozzetto e incuba la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Dopo un'ora, fare altri tre lavaggi con PBST e un lavaggio finale solo con PBS.

Infine, aggiungere 60 microlitri di soluzione di nitroso sette a ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore, o preferibilmente incubare le piastre per 16 ore a quattro gradi SIU. Il giorno successivo, le interazioni positive saranno diventate rosse. Scattare una fotografia della lastra per una registrazione visiva e quindi quantificare le reazioni a un'assorbanza di 4 85 nanometri utilizzando un lettore di piastre.

Dopo circa 10 minuti dall'inizio della reazione di screening di AveXis, sono stati osservati cambiamenti di colore dal giallo al rosso sia nel controllo di cattura della preda mediato da anticorpi che nell'interazione di controllo positivo. Questo cambiamento di colore indica l'idrolisi del nitro nel substrato. Alcune interazioni positive sono osservabili su questa scala temporale, ma la maggior parte ha impiegato alcune ore per apparire.

In genere, è stato osservato un tasso di successo di circa lo 0,4-0,6% di positivi. Una volta preparate le librerie proteiche, la parte di screening di questa tecnica può essere eseguita rapidamente. È possibile eseguire lo screening di un massimo di 12 lastre in un giorno dopo aver identificato un'interazione.

Il passo successivo più importante è innanzitutto dimostrare che l'interazione può essere ripetuta utilizzando preparati proteici freschi e indipendenti. In secondo luogo, determiniamo sempre se l'interazione è indipendente dall'orientamento della preda esca, cioè può essere ricambiata? Ciò comporta la clonazione dei domini del vettore esca nel vettore preda e viceversa.

Le interazioni che possono essere ripetute e ricambiate sono considerate ad alta confidenza e hanno sempre dimostrato di essere positive. Utilizzando altre tecniche come la risonanza del plasma di superficie, ci piace utilizzare il plasma di superficie in risonanza per convalidare ulteriormente qualsiasi interazione che identifichiamo nuovamente. È importante sottolineare che questo fornisce una dimostrazione che i due componenti purificati possono interagire direttamente e possono anche essere utilizzati per dimostrare che il legame è seduto e quindi specifico.