Name: Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare lattivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Impara a isolare macrofagi alveolari murini e valutarne l'attivazione indotta da nanoparticelle polianidride. Questo protocollo combina lavaggio broncoalveolare e citometria a flusso per studiare le risposte immunitarie polmonari.

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Gli autori desiderano ringraziare l&#39;US Army Medical Research e Materiel Command (numeri di sovvenzione W81XWH-09-1-0386 e W81XWH-10-1-0806) per il sostegno finanziario e il dottor Shawn Rigby dal Fondo Iowa State Citometria a flusso per l&#39;Università la sua assistenza tecnica di esperti.

1. Raccolta macrofagi alveolari (AMɸ) dal mouse attraverso il lavaggio del polmone <ol><li> Indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) come un camice da laboratorio, guanti monouso e protezione per gli occhi. </li><li> Preparare completa AMɸ (cAMɸ) mezzo prima dell&#39;inizio della raccolta. Aggiungere 2,5 ml di penicillina / streptomicina (pen / strep) soluzione, 250 pl di β-mercaptoetanolo (2-mercaptoetanolo), e 25 mL di calore inattivato siero fetale bovino (FBS), a 222,25 ml di Dulbelcco Modified Eaglès Medium (DMEM). Filtro-sterilizzare medie cAMɸ utilizzando un 0,2 micron pori del filtro bottiglia formato superiore sotto vuoto. </li><li> Eutanasia un topo sano CO 2 asfissia in una camera euthanization. Sebbene un topo C57BL / 6 (6-8 settimane) è stato utilizzato per gli scopi di questo progetto, questa tecnica lavaggio polmonare possono essere eseguite su qualsiasi ceppo di topo. Utilizzando una bombola di gas compresso, lasciate flusso di gas nella camera per 1 minuto prima immissione del topo nel capambra per assicurare che la camera è completamente carica con CO 2. Posizionare il mouse nella camera per almeno un minuto a eutanasia il mouse. Inoltre, ciascun topo exsanguinate tramite puntura cardiaca come metodo fisico per confermare la morte topo come descritto in 1,4. </li><li> Lay mouse sul retro (lato dorsale), a spruzzo con 70% etanolo, individuare lo sterno e, ad un angolo di 30 gradi con l&#39;addome, inserire un ago di 23 gauge (attaccato ad una siringa da 1 ml) di circa 50 mm nella cavità toracica . Con corretto posizionamento dell&#39;ago, dovrebbe essere possibile raccogliere tra 0,4 e 1 ml di sangue a seconda delle dimensioni del mouse. Esaminare l&#39;animale per la cessazione dei segni vitali. </li><li> Luogo del mouse sul banco di laboratorio in modo che è sdraiato sul suo addome (lato ventrale). Spray del mouse con il 70% di etanolo per sterilizzare l&#39;ambiente di lavoro. Pizzica la pelle circa a metà strada lungo la spina dorsale del mouse. Dissezione con forbici che sono stati sterilizzati con etanolo al 70%, fanno una piccola incisione attraverso la pelle. &lt;/ Li&gt; <li> Afferra la pelle su entrambi i lati dell&#39;incisione e tirare la pelle in direzioni opposte lungo il cranio-caudale asse del mouse. Se eseguita correttamente, la pelle viene rimosso dalla carcassa sottostante. </li><li> Il collo del mouse dovrebbe ora mostrare i muscoli e le ghiandole esposti. Tagliare con cautela che il tessuto e tirarlo verso la parte anteriore del mouse utilizzando una pinza, esponendo così la laringe, trachea, esofago e del mouse. Evitare di tagliare la vena giugulare o carotide. </li><li> La trachea è ora visibile ed è identificabile come il tessuto con anelli cartilaginei intorno ad esso. Delicatamente tenere la trachea con una pinza e delicatamente sollevare e separare la trachea dall&#39;esofago, che si trova sul lato dorsale. </li><li> Fai una piccola incisione anteriore al punto in cui si sostiene la trachea, ma posteriore alla laringe. L&#39;incisione dovrebbe essere effettuato a circa 45 ° gradi. Inoltre, non completamente transetto della trachea, in quanto ciò gli impedirà di rientro inla cavità del corpo. </li><li> Riempire una siringa da 1 cc munito di un catetere Cat Tom con PBS sterile in preparazione per inserire il catetere nel lume della trachea. Tenere la trachea utilizzando una pinza e con la mano tenere il catetere in prossimità della punta per aumentare il controllo e delicatamente inserirlo nel sito di incisione tracheale. Inserire delicatamente catetere nella trachea circa 20 mm. Afferrare la trachea che è attorno al tubo del catetere, liberando dall&#39;altro. </li><li> Uso di una siringa da 1 ml munito del catetere, delicatamente infondere 0,75 mL di temperatura ambiente, PBS sterile nei polmoni e poi delicatamente aspirare il retro PBS in siringa. Ripetere questa operazione per tre volte mentre esternamente massaggiare il torace. Scollegare la siringa dal catetere ed erogare il liquido di lavaggio in una provetta da centrifuga da 15 mL. Dopo aver riempito la siringa con 0,75 mL di PBS fresco e ricollegando la siringa al catetere, ripetere i punti 1,9 e 1,10 volte per ogni mouse. Il recupero del fluido può essere parziale, ottenendo inferiore VOLume infuso. Se la raccolta di cellule provenienti da più di un mouse, posizionare il tubo di 15 ml con le cellule raccolte sul ghiaccio fino a quando tutti lavaggi polmonari sono stati effettuati. </li></ol> 2. Elaborazione di lavaggio polmonare AMɸ Harvest <ol><li> Centrifugare liquido di lavaggio del polmone a 250 x g per 10 min a 4 ° C. </li><li> Usando una tecnica sterile, supernatante decantare in idoneo contenitore per rifiuti all&#39;interno di un armadio biosicurezza. Risospendere il pellet di cellule delicatamente rastrellando il tubo da centrifuga attraverso la parte superiore di un rack provetta. Aggiungere 1 mL di terreno cAMɸ per risospendere le cellule. </li><li> Enumerare le cellule utilizzando un contatore di particelle Coulter Z1 pipettando 20 microlitri di cellule in 10 ml di diluente ISOTON II in flaconcino contatore Coulter. Aggiungere 3 o 4 gocce di Zap-oglobin reagente litico II nel flaconcino, capovolgere delicatamente da 3 a 4 volte e poi caricare il flacone di campione sul bancone per ottenere una concentrazione cellulare. Assicurarsi di programmare il contatore con un fattore di diluizione di 2 x 10 4 per visualizzare ilconcentrazione cellulare come il numero di cellule per ml. </li><li> Diluire le cellule a 2,5 x 10 5 per mL utilizzando mezzo cAMɸ. </li><li> Distribuire 2 mL di 2,5 x 10 5 cellule / ml in ciascun pozzetto di una 6-ben piatto di coltura di tessuti. </li><li> Per arricchire per AMɸ, le piastre di coltura all&#39;interno di incubare a 37 ° C incubatore umidificato con un 5% di CO 2 ambiente per 6 h per permettere alle cellule di aderire al fondo del pozzo. Aspirare delicatamente il supernatante di non perturbare cellule aderenti. </li><li> Risciacquare le pozzetti usando PBS sterile (calcio e magnesio libero) per rimuovere le cellule non aderenti e detriti. Aggiungere 2 mL di terreno cAMɸ a ciascun pozzetto. </li><li> Incubare le cellule all&#39;interno notte a 37 ° C incubatore umidificato con un 5% di CO 2 ambiente prima dell&#39;aggiunta di stimolanti. Dopo questa fase di arricchimento, circa il 87% delle cellule sono positive per il macrofago CD11b marcatori e F4/80 (figura 2c). </li></ol> 3. Aggiunta di PolyanhydridNanoparticelle e trattamenti elettronici di controllo <ol><li> Fabbricare nanoparticelle tramite polianidride anti-solvente nanoencapsulation 15. In questo processo, il polimero viene sciolto in cloruro di metilene (4 ° C ad una concentrazione di 25 mg / mL) e si precipita in pentano (-20 ° C ad un rapporto 1:200 cloruro di metilene: pentano). </li><li> Pesare con nanoparticelle polianidride sterilizzato pesano carta su un saldo che può misurare con precisione gli importi microgrammi. Aggiungere particelle in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Risospendere le nanoparticelle in ghiacciata cAMɸ. I calcoli sono fatti in modo tale che non più di 0,3 mL di mezzo viene aggiunto a ciascun pozzetto per ottenere la concentrazione desiderata di nanoparticelle. Conservare le particelle risospeso in ghiaccio fino a quando le nanoparticelle sono aggiunti alla coltura bene. </li><li> Prima di aggiungere le nanoparticelle alle culture AMɸ, sonicare particelle utilizzando un sonicatore banco con una micropunta. Sterilizzare microtip a spruzzo con il 70% di etanolo e wiping con un Kimwipe sterile prima della sonicazione. Sottoporre ad ultrasuoni a 10-20 joule per 30 a 45 s mantenendo la provetta in ghiaccio. Osservare macroscopicamente la sospensione di nanoparticelle. Se le particelle non sono sufficientemente disperse, consentono di impostare la sospensione su ghiaccio per 1 a 2 min per garantire che le nanoparticelle sono sotto della temperatura di transizione vetrosa del polimero prima sonicazione nuovamente per 30 a 45 secondi. Lo scopo di questo passo è sonicazione per disperdere adeguatamente le nanoparticelle, come CPTEG 50:50: nanoparticelle CPH tendono ad aggregarsi quando esposto ad un ambiente acquoso. Tuttavia, alcuni piccoli aggregati di nanoparticelle possono rimangono in sospensione. </li><li> Sospensione di nanoparticelle (adeguatamente dispersa) dovrebbero essere tenuti in ghiaccio e possono essere usate immediatamente per prevenire prematura erosione superficiale o di aggregazione. </li><li> Rimuovere le capsule di Petri contenenti il ​​AMɸ da incubatore e il luogo nel quadro di biosicurezza. Piastra Tilt a circa un angolo di 45 gradi e fuori pipetta la quantità di medium che verrà aggiunto alla sospensione nanoparticelle (non dovrebbe superare 0,3 mL). Non disturbare le cellule aderenti durante la rimozione del mezzo. </li><li> Vortex la sospensione di nanoparticelle polianidride brevemente prima di aggiungerlo nei pozzetti appropriati. Pipettare la quantità di sospensione nanoparticelle (non più di 0,3 mL) nel bene specifico (s), tuttavia, non pipettare su e giù per miscelare. Questa azione potrebbe staccare l&#39;aderente AMɸ dal pozzo. Le particelle si depositano sul fondo del pozzo e contattare le cellule. Per gli studi indicati in questo rapporto, la concentrazione finale di nanoparticelle di co-coltura con l&#39;AMɸ era di 125 mg / mL. Procedere con pozzetti successivi e gruppi di trattamento desiderato. Include gruppi di controllo positivi e negativi, come unico mezzo e 200 ng / mL lipopolisaccaride (LPS) per pozzetti. </li><li> Riportare le piastre di coltura ai 37 ° C incubatore umidificato con un 5% di CO 2 nell&#39;atmosfera per 48 ore. Studi cinetici nel nostro laboratory hanno dimostrato 48 ore per essere il periodo di coltura ottimale per valutare sia espressione sulla superficie cellulare marcatore e secrezione di citochine in quanto permette di tempo adeguato per la trascrizione e la sintesi proteica a verificarsi. Sebbene maggiori livelli di citochine accumulano durante un prolungato periodo di coltura (cioè, 72 ore), valutando l&#39;espressione sulla superficie cellulare marcatore a questo punto nel tempo può essere confuso con il contributo degli elevati livelli di citochine. Le variazioni di espressione di superficie marcatore osservato non può essere direttamente attribuibile alla stimolazione con le stesse nanoparticelle. </li></ol> 4. La valutazione di attivazione AMɸ in citometria a flusso <ol><li> Preparare fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) tampone (0,1% di sodio azide e 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA)) in 0,1 M di fosfato di soluzione salina tamponata (pH 7,4) prima di raccogliere i macrofagi placcati che sono state co-coltivate con nanoparticelle or stimolanti. </li><li> Preparare soluzioni di lavoro del tampone di bloccaggio e gli anticorpi monoclonali. Per preparare il buffer blocco, diluire IgG di ratto (Sigma) e anti-CD16/32 (eBioscience) a 1 mg / ml e 10 ug / ml, rispettivamente, in tampone FACS. Diluire marcatore di superficie del pannello di anticorpi in un tampone FACS sia alla concentrazione consigliati dal produttore o la concentrazione utente ottimizzata. Per i risultati presentati in questo lavoro, il pannello marcatore di superficie è costituito da anticorpi contro MHC II, CD86, CD40 e il CIRE (CD209). Anti-topo anticorpi contro i marcatori macrofagi F4/80 e CD11b sono anche inclusi nel pannello di identificare il fenotipo macrofago durante l&#39;analisi dei dati. Si deve prestare attenzione nella scelta di anticorpi contro molecole MHC II, come ceppi di topi inbred spesso differiscono nelle loro aplotipi MHC II. Gli anticorpi selezionati dovranno reagire con le alloantigeni specifici MHC espresse dal ceppo di topi di interesse. </li><li> Dopo 48 h di incubazione con nanoparticelle e / ostimolanti, luogo di coltura di cellule piatti sul ghiaccio per 20 min. Per rimuovere i macrofagi aderenti dalle piastre, raschiare delicatamente pozzetti con un raschietto cella di 24 cm. </li><li> Usando una pipetta da 5 mL sierologica, aspirare delicatamente le cellule ed il mezzo su e giù cinque volte per generare una sospensione di cellule singole. Pipettare i contenuti dei singoli pozzetti in provette di polistirene 5 mL separati in modo da non mescolare le cellule provenienti da diversi trattamenti sperimentali. </li><li> Aggiungere 2 mL di tampone FACS a ciascuna provetta. </li><li> Provette da centrifuga di cellule a 250 x ga 4 ° C per 10 min. </li><li> Decantare il surnatante e Risospendere delicatamente pellet di cellule in liquido residuo da rastrellare i tubi nella parte superiore di un rack provetta. </li><li> Al fine di prevenire il legame non specifico degli anticorpi monoclonali, aggiungere 10 ul di tampone di bloccaggio (preparato in 4,2) a ciascun tubo di cellule. Tubi vortex e incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Aggiungere il volume appropriato di anticorpi monoclonali diluiti in ogni provetta e incubmangiato al buio in ghiaccio per 15 min. Tubi che contengono i campioni da analizzare deve ricevere la combinazione di anticorpi del pannello policromo (ottimizzazione precedente di combinazione di anticorpi deve essere eseguita da laboratori individuali). Altri gruppi di controllo dovrebbero essere inclusi per impostare correttamente i parametri di acquisizione sul citometro a flusso, compreso un tubo di cellule che non sono stati etichettati, e tubi di compensazione che corrispondono alle cellule marcate usando ogni singolo colore separatamente. Per impostare correttamente le porte per l&#39;analisi di citometria di flusso, la fluorescenza Minus One (FMO) controlli dovrebbero essere inclusi durante l&#39;acquisizione. Controlli FMO sono cellule marcate con tutti gli anticorpi fluorocromo-coniugati che vengono utilizzati sul pannello tranne uno che viene sostituito dal suo rispettivo controllo isotipico. Popolazioni positivi e negativi (ossia, separare le aliquote di cellule trattate con uno stimolante controllo positivo e medium da solo) dovrebbero essere inclusi in FMO provette di controllo e di compensazione. </li><li&gt; 2 mL di tampone FACS a ciascuna provetta vortice, e centrifugare a 250 x ga 4 ° C per 10 min. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in liquido residuo da rastrellare i tubi nella parte superiore di un rack provetta. </li><li> Se il pannello anticorpo è costituito da un anticorpo non coniugato direttamente ad un fluorocromo, ma è invece coniugato a biotina, un fluorocromo streptavidina coniugata è necessario per visualizzare il marcatore di superficie. In questa fase, aggiungere un volume appropriato di diluita fluorocromo streptavidina coniugata e incubare al buio per 15 min in ghiaccio. Come in 4,2, la streptavidina viene diluito ad una concentrazione raccomandata dal produttore o di una ottimizzata da parte dell&#39;utente. Questo passo è necessario solo per pannelli contenenti biotinilati anticorpi primari. </li><li> Eseguire una fase di lavaggio, come descritto in 4.10. </li><li> Diluire un volume adeguato di fissativo 01:03 BD stabilizzare in acqua deionizzata. Aggiungere 100 ml di fissativo diluito in ogni provetta mentre delicatamente vortexing per evitare grumi di cellule. Cellule marcate e può essere stabilmente fissato conservata al buio a 4 ° C per circa una settimana prima di acquisizione su un citometro a flusso. </li></ol> 5. Dati rappresentativi Nanoparticelle fabbricati in fase 3,1 avevano un diametro medio di 163 ± 24 nm e una morfologia coerente con quello ottenuto in studi precedenti 5,16. Nanoparticelle in soluzione prima e dopo sonicazione sono mostrati in Figura 1 per dimostrare la necessità di sonicazione per garantire un&#39;adeguata dispersione delle particelle. L&#39;analisi citofluorimetrica delle AMɸs raccolte ottenuta tramite lavaggio polmonare è mostrato in Figura 2. Etichettare cellule con una combinazione di anti-topo CD11b e anti-topo F4/80 anticorpi così come i controlli corrispondenti FMO permette di stabilire l&#39;etichettatura sfondo, identificando AMɸs e gating per ulteriori analisi. Trattamento dei macrofagi alveolari con polianidridenanoparticelle migliora attivazione come mostrato dalla maggiore intensità di fluorescenza media di MHC II, CD40, CD86, e CIRE (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Figura 1 50:50 CPTEG: CPH nanoparticelle prima (A) e dopo (B) 30 s di sonicazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi citofluorimetrica delle raccolte macrofagi alveolari contrassegnati con (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b e il PE-Cy7 FMO Control, (B) Alexa Fluor 700 FMO controllo e la PE-Cy7 anti-F4/80 e (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b e PE-Cy7 anti-F4/80. Il numero nell&#39;angolo in alto a destra rappresenta la percentuale di cellule positive doppio. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> Figura 3. Istogrammi dimostrando un aumento della fluorescenza intensitàsità per l&#39;espressione superficie di MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) e CIRE (D) dopo co-coltura di macrofagi alveolari con 50:50 CPTEG: polianidride CPH nanoparticelle per 48 ore. Gli istogrammi rappresentano risultati per AMɸ etichettati come controlli (FMO <img alt="Grafico Linea 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), Non trattata AMɸ marcato con anticorpi contro marcatori di superficie tutti i cellulari ( <img alt="Grafico Linea 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) E AMɸ coltivate con nanoparticelle ed etichettati con anticorpi contro marcatori di superficie tutti i cellulari ( <img alt="Grafico Linea 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Polianidride piattaforme vaccino nanoparticelle hanno dimostrato l&#39;efficacia se somministrato per via intranasale in regimi monodose 5. Misurazione l&#39;attivazione delle cellule fagocitiche popolazioni residenti nei polmoni indotti dalla piattaforma di mandata vaccino consente di valutare la potenziale capacità di promuovere in definitiva risposte immunitarie adattative. In particolare, la raccolta macrofagi alveolari del polmone dal liquido di lavaggio e trattarli con diver...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> CAM media </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM 2-mercaptoetanolo </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina 10.000 mg / ml di soluzione </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di potassio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albumina di siero bovino) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio Azide </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Ms MHC II aplotipo IA / IE, clone M5/114.15.2, coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) </td><td> EBIOScience </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mouse CD86, clone GL-1, coniugata con alloficocianina (APC)-Cy7 </td><td> Biolegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mouse CD40, clone 1C10, coniugato con APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo CD209, clone 5H10 coniugati con biotina </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mouse CD11b, clone M1/70, coniugato con Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mouse F4/80, clone BM8, coniugato con ficoeritrina (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Texas red coniugato streptavidina </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Materiali di consumo e reagenti </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Utilizzato come 70% (v / v) </td></tr><tr><td> CO 2 compressa </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 1 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Sovereign 3 ½ &quot;Fr Catcatheter Tom </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Biosicurezza Cabinet </td><td> NUAIRE </td><td> Series 22 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione Forbici </td><td> Pescatore </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 1X senza calcio e magnesio </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 Tubi centrifuga ml con tappo a vite </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Sei ben Cultura tessuto trattato Piatti </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Racks tubi in plastica </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Cella Scraper 24 centimetri </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mL polistirene Round-Provetta a fondo </td><td> Falco </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettare-aid XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, e 2 ml Pipettes </td><td> Pescatore </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 e 10 microlitri Micropipettatrici </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 e 10 puntali pl </td><td> Pescatore </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD di stabilizzazioneFissativo </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> ISOTON II Diluente </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II reagente litico </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Fiale polistirene Coulter Counter </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Provette </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Attrezzatura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga refrigerata </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore umidificato CO 2 </td><td> Nuaire </td><td> Modello Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto Citofluorimetro </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Contatore di particelle Coulter Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Sonicator Processing Equipment liquido con micropunta </td><td> Misonix </td><td> Modello No. S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

raccolta murini macrofagi alveolari e valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Nanoparticelle biodegradabili sono emersi come una piattaforma versatile per la progettazione e realizzazione di nuovi vaccini intranasali contro le malattie infettive respiratorie. In particolare, polianidride nanoparticelle composto di acido alifatico sebacico (SA), il aromatico 1,6-bis (p-carbossifenossi) esano (CPH), o il anfifilo 1,8-bis (p-carbossifenossi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) visualizzare massa unica e cinetica di erosione superficiale e 1,2 può essere sfruttata per rilasciare lentamente biomolecole funzionali (ad esempio, antigeni proteici, immunoglobuline, ecc) in vivo 3,4,5. Queste nanoparticelle possiedono anche attività adiuvante intrinseca, che li rende una scelta eccellente per una piattaforma di distribuzione vaccino 6,7,8. Al fine di chiarire i meccanismi che regolano l&#39;attivazione dell&#39;immunità innata a seguito di vaccinazione della mucosa nasale, bisogna valutare le risposte molecolari e cellulari della p antigenecellule risentirsi (APC) responsabili per l&#39;avvio di risposte immunitarie. Le cellule dendritiche sono le principali APC si trovano nella conduzione delle vie aeree, mentre i macrofagi alveolari (AMɸ) predominano nel parenchima polmonare 9,10,11. AMɸ sono altamente efficienti in compensazione nei polmoni di agenti patogeni microbici e detriti cellulari 12,13. Inoltre, questo tipo di cellule gioca un ruolo importante nel trasporto di antigeni microbici ai linfonodi drenanti, che è un primo passo importante nella apertura di una risposta immunitaria adattativa 9. AMɸ esprimono anche livelli elevati di pattern recognition innata e recettori scavenger, secernono mediatori pro-infiammatori, e prime cellule T naive 12,14. Una popolazione relativamente pura di AMɸ (ad esempio, superiore al 80%) può essere facilmente ottenuta mediante lavaggio polmonare per studi in laboratorio. Resident AMɸ raccolte da animali immuni competenti forniscano un fenotipo rappresentante dei macrofagi che encounter la particella vaccino basato in vivo. Qui, descriviamo i protocolli utilizzati per la raccolta e la cultura AMɸ da topi ed esaminare il fenotipo attivazione dei macrofagi in seguito al trattamento con le nanoparticelle polianidride in vitro.

Qui, descriviamo i protocolli per la raccolta murini macrofagi alveolari, che risiedono le cellule immunitarie innate nei polmoni, e di esaminare la loro attivazione in risposta a co-coltura con nanoparticelle polianidride.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Le nanoparticelle biodegradabili sono emerse come una piattaforma versatile per la progettazione e l'implementazione di nuovi vaccini intranasali contro le malattie respiratorie...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la capacità delle nanoparticelle di polianidride di attivare i macrofagi alveolari purificati. Innanzitutto, la trachea del topo viene esposta chirurgicamente e viene eseguita una lavanda broncoalveolare per raccogliere le cellule dal tratto respiratorio. I macrofagi alveolari vengono quindi centrifugati per isolarli e coltivati per una notte.Viene quindi preparata una sospensione di nanoparticelle di polianidride e aggiunta ai macrofagi alveolari. I macrofagi vengono incubati per consentire l'attivazione dopo 48 ore. L'espressione dei marcatori di superficie cellulare viene analizzata mediante citometria a flusso.L'analisi dei dati consente l'identificazione di formulazioni di nanoparticelle di Polly Anidride in grado di attivare i macrofagi alveolari specchianti. Questo materiale può contribuire a rispondere a domande nei settori dei biomateriali e dell'immunologia. In particolare, possiamo identificare biomateriali con attività adiuvante intrinseca, dimostrata dalla capacità di attivare le cellule presentatrici di antigeni, tra cui i macrofagi alveolari.L'idea di utilizzare questo metodo nella nostra ricerca è emersa quando abbiamo scoperto che una piattaforma nano-vaccinale a base di polianidride contro patogeni respiratori garantiva una protezione completa contro la polmonite batterica. Nel presente lavoro, abbiamo cercato di indagare le interazioni specifiche della piattaforma vaccinale con le cellule immunitarie respiratorie. Iniziare questa procedura posizionando un topo eutanasizzato supino.Nebulizzare il mouse con etanolo al 70%. Sebbene in questo caso venga utilizzato un mouse C57BL/6 di sei-otto settimane, questa tecnica può essere eseguita su qualsiasi ceppo di mouse. Individuare lo sterno e, con un angolo di 30 gradi rispetto all'addome, inserire un ago da 23 gauge collegato a una siringa da un millilitro. Introdurre l'ago fino a circa 50 millimetri nella cavità toracica ed estrarre da 0,4 a un millilitro di sangue, generalmente nelle ruote.Eseguire questa procedura comporterà difficoltà nell'ottenere un campione per i loro esperimenti. Per questo motivo è molto importante procedere con attenzione, come dimostrato qui. Per eseguire la lavanda, girare il topo sulla sua pancia e spruzzarla con etanolo al 70%.Quindi pizzicare la pelle circa a metà della spina dorsale utilizzando forbici da dissezione sterilizzate con etanolo al 70%. Praticare una piccola incisione attraverso la pelle. Afferrare la pelle su entrambi i lati dell'incisione e tirare in direzioni opposte lungo l'asse cranio-caudale del topo.Una volta esposti i muscoli e le ghiandole del collo, tagliare con attenzione il tessuto muscolare. Quindi, utilizzando pinze, tirare il tessuto verso l'anteriore del topo per esporre la laringe, la trachea e l'esofago.Evitare di recidere la vena giugulare o l'arteria carotide. La trachea è riconoscibile come il tessuto dotato di anelli cartilaginei disposti intorno ad essa. Con la pinzetta, afferrare delicatamente la trachea e sollevarla con cautela, separandola dall'esofago, che si trova sul lato dorsale.Riempire una siringa da 1 cc, dotata di un catetere tomcat, con PBS sterile. Successivamente, con un angolo di 45 gradi, praticare una piccola incisione nella trachea anteriore rispetto alla pinza emostatica, ma posteriore al laringe.Evitare di sezionare completamente la trachea, poiché ciò impedirebbe il suo ripiegamento all'interno della cavità corporea. Utilizzando una pinzetta, tenere ferma la trachea e inserire delicatamente il catetere di circa 20 millimetri nel sito dell'incisione tracheale. Successivamente, afferrare la trachea intorno al tubo del catetere per liberare l'altra mano mentre si effettua un massaggio esterno del torace.Utilizzare una siringa da un millilitro dotata di catetere per infondere delicatamente 0,75 millilitri di PBS sterile a temperatura ambiente nei polmoni. Successivamente, aspirare delicatamente il PBS nuovamente nella siringa. Ripetere questo processo per tre volte.Staccare la siringa dal catetere e versare il fluido di lavaggio in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Riempire la siringa con 0,75 millilitri di PBS fresco, ricollegare la siringa al catetere ed eseguire nuovamente il lavaggio. Il recupero del fluido può essere parziale, pertanto il volume ottenuto potrebbe essere inferiore al volume infuso.Se le cellule verranno raccolte da più di un topo, posizionare il tubo da 15 millilitri con le cellule raccolte sul ghiaccio fino a quando non saranno state eseguite tutte le lavaggi polmonari. Per arricchire la popolazione di macrofagi alveolari nelle cellule raccolte, centrifugare il liquido di lavaggio polmonare a 250 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Utilizzando una tecnica sterile, versare il soprannatante in un contenitore per rifiuti appropriato all'interno di una cappa a sicurezza biologica. Rimescolare il pellet cellulare agitando delicatamente il tubo della centrifuga appoggiandolo sulla sommità di un portaprovette. Aggiungere un millilitro di mezzo completo per macrofagi alveolari per risospendere le cellule e procedere al loro conteggio.Aspirare 20 microlitri di cellule e trasferirli in 10 millilitri di diluente isotono due in un vial per conteggio cellulare. Aggiungere tre o quattro gocce di zog globina, un reagente lisi due nel vial e capovolgere delicatamente il vial da tre a quattro volte. Successivamente, caricare il vial del campione in un contatore di particelle Colter Z uno.Assicurarsi di programmare il contatore con un fattore di diluizione di due per 10 alla quarta per visualizzare la concentrazione cellulare come numero di cellule per millilitro. Una volta determinata la concentrazione cellulare, diluire le cellule a 2,5 per 10 alla quinta per millilitro con mezzo completo per macrofagi alveolari in un tubo da 15 millilitri. Quindi distribuire due millilitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti.Per arricchire i macrofagi alveolari, incubare le piastre di coltura in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con un'atmosfera al 5% CO2 per sei ore. Durante l'incubazione, i macrofagi aderiranno al fondo della pozzetta; al termine dell'incubazione, aspirare delicatamente il sopernatante avendo cura di non disturbare le cellule aderenti. Quindi risciacquare le pozzette utilizzando PBS sterile privo di calcio e magnesio.Per rimuovere le cellule non aderenti e i detriti, aggiungere due millilitri di mezzo completo per macrofagi alveolari in ciascun pozzetto, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo questo passaggio di arricchimento, circa l'87% delle cellule sarà positivo per il marcatore dei macrofagi CD11b e F4/80.Dopo aver arricchito la popolazione di macrofagi alveolari, il passo successivo della procedura consiste nell'aggiungere prima le nanoparticelle di polianidride, che vanno fabbricate mediante nano-incapsulamento in antisolvente di polianidride. In questo processo, il polimero viene disciolto in cloruro di metilene e precipitato nel pentano. Pesare la quantità appropriata di nanoparticelle di polianidride utilizzando carta filtrante sterilizzata.Qui, vengono aggiunti 125 microgrammi di particelle per ogni millilitro di coltura. Aggiungere le particelle in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri, risospendere le nanoparticelle nella quantità appropriata di mezzo completo per macrofagi alveolari freddo su ghiaccio e porre la provetta sul ghiaccio. Successivamente, sterilizzare la micropunta di un sonicatore da banco.Spruzzare con etanolo al 70% e asciugare con un panno sterile mantenendo il tubo sul ghiaccio. Sottoporre a sonicazione da 10 a 20 joule per 30-45 secondi. Osservare macroscopicamente la sospensione di nanoparticelle se le particelle non sono sufficientemente disperse.Posizionare la sospensione sul ghiaccio per uno o due minuti per assicurare che le nanoparticelle siano al di sotto della temperatura di transizione vetrosa del polimero. Successivamente, sottoporre nuovamente a sonificazione per 30-45 secondi. Lo scopo del passaggio di sonificazione è quello di disperdere adeguatamente le nanoparticelle come il tag CCP 50 50.I nanoparticelle di CPH tendono ad aggregarsi quando esposte a un ambiente acquoso. Tuttavia, alcuni piccoli aggregati di nanoparticelle possono comunque rimanere in sospensione. La sospensione di nanoparticelle deve essere mantenuta sul ghiaccio ed utilizzata immediatamente per prevenire un'erosione superficiale prematura o ulteriori aggregazioni.Rimuovere le piastre di coltura contenenti i macrofagi alveolari dall'incubatore e posizionarle nella cappa a sicurezza biologica. Inclinare la piastra avendo cura di non disturbare le cellule aderenti A e pipettare il volume di mezzo che verrà aggiunto alla sospensione di nanoparticelle Vortex. Vortexare brevemente la sospensione di nanoparticelle polianidride, quindi pipettare fino a 0,3 millilitri della sospensione di nanoparticelle nei pozzetti appropriati.Di nuovo, avendo cura di non disturbare le cellule aderenti. Le particelle si depositeranno sul fondo della pozzetta e verranno a contatto con le cellule. Procedere con le pozzette successive e i gruppi di trattamento desiderati.Includere gruppi di controllo positivi e negativi, come il mezzo solo e 200 nanogrammi per millilitro di lipopolisaccaride, nei pozzetti designati, quindi incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Al termine dell'incubazione, l'attivazione degli alveoli può essere valutata mediante citometria a flusso, come descritto nel documento allegato.I macrofagi alveolari sono stati ottenuti da topi C57BL/6 e arricchiti come descritto nell'articolo video per valutare l'attivazione cellulare. Sono state aggiunte 125 microgrammi per millilitro di nanoparticelle di polianidride CPH-CPT 50:50 a 5 × 10⁵ cellule per millilitro di macrofagi alveolari arricchiti, per un periodo di 48 ore. L'espressione dei marcatori dei macrofagi alveolari, MHC II, CD40, CD86 e SIRE, è stata quindi valutata mediante colorazione con anticorpi e citometria a flusso, come mostrato in questo istogramma.I macrofagi alveolari incubati con nanoparticelle, indicati dalla linea blu continua, hanno aumentato l'espressione superficiale di MHC II, una molecola necessaria per la presentazione dell'antigene alle cellule T CD4, rispetto a quelli non trattati con nanoparticelle, come previsto. Livelli inferiori di marcatura sono stati osservati nei controlli di fluorescenza meno uno (FMO), indicando che il segnale osservato non è dovuto all'autofluorescenza. I macrofagi alveolari incubati con nanoparticelle, indicati dalla linea blu continua, hanno potenziato l'espressione di CD40, una molecola co-stimolatoria necessaria per l'attivazione appropriata delle cellule T, rispetto alle cellule non trattate.L'espressione di un'altra molecola co-stimolatoria delle cellule T, CD86, è stata anch'essa aumentata dopo il trattamento con nanoparticelle di polianidride per 48 ore. L'espressione di CYaC, un recettore di tipo lectina che lega motivi carboidrati presenti sulla superficie dei patogeni, è notevolmente potenziata sui macrofagi alveolari dopo il trattamento con nanoparticelle di polianidride. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un lavaggio broncoalveolare allo scopo di isolare macrofagi alveolari murini, di come coltivare tali cellule e di come stimolarle per misurare o valutare l'attivazione cellulare mediante nanoparticelle di poliidrossiacido.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è fondamentale utilizzare tecniche di laboratorio sterili per prevenire la contaminazione delle cellule primarie in corso di raccolta e per evitare l'introduzione di contaminanti nei trattamenti.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Un metodo per valutare la capacità di isolato macrofagi alveolari del mouse per controllare la crescita di spore di Aspergillus fagocitati mediante microscopia confocale.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

Le cellule del midollo osseo coltivate con il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulociti (GM-CSF) generano una coltura eterogenea contenente macrofagi e cellule dendritiche (DC). Questo metodo evidenzia l'utilizzo del legame MHCII e ialuronano (HA) per differenziare i macrofagi dalle DC nella coltura GM-CSF. I macrofagi in questa cultura hanno molte somiglianze con i macrofagi alveolari.

Generazione e identificazione di GM-CSF Derivato alveolo-come macrofagi e dendritiche cellule da midollo osseo di topo

Qui descriviamo il modello e l'approccio per studiare le funzioni dei macrofagi alveolari polmonari nelle metastasi del cancro. Per dimostrare il ruolo di queste cellule nelle metastasi, è stato utilizzato il modello singenico (4T1) del carcinoma mammario in combinazione con la deplezione dei macrofagi alveolari con liposomi di clodronato.

Studiare il ruolo dei macrofagi alveolari in Breast Cancer metastasi

Lo stato di salute del polmone si riflette il tipo e il numero di cellule immunitarie che sono presenti nei bronchioli dei polmoni. Descriviamo una tecnica di lavaggio broncoalveolare che consente di isolare e studio delle cellule non aderenti e fattori solubili dal tratto respiratorio inferiore dei topi.

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

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Fagocitosi del macrofago alveolare e la Clearance di batteri nei topi

Descriviamo un metodo per la lavorazione del fluido di lavaggio bronchoalveolar e corrisponde al sangue periferico di individui cronicamente affetti da HIV sulla terapia antiretrovirale per valutare i serbatoi polmonari di HIV. Questi metodi portano all'acquisizione di cellule T CD4 altamente pure e macrofagi alveolar che possono successivamente essere utilizzati per immunofenofizzazione e quantificazioni HIV DNA/RNA mediante reazione a catena di polimerasi ultrasensibili.

Trattamento del bronchoalveolar Lavage Fluid e del sangue abbinato per il macrofago alveoere e CD4- Immunofenotyping a cellule T e valutazione del serbatoio dell'HIV

Questo manoscritto descrive un protocollo per determinare se l'esposizione all'ozono, un criterio di inquinante dell'aria, imponga l'efferocitosi alveolar in vivo. Questo protocollo utilizza reagenti e tecniche di uso comune e può essere adattato a più modelli di lesione polmonare per determinare gli effetti sull'efferocitosi del macrofagio alveolar.

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Qui è presentato un protocollo per l'isolamento primario del sangue monocito umano, nonché la loro differenziazione in macrofagi e cellule dendritiche e assemblaggio con cellule epiteliali in un modello polmonare umano multicellulare. Vengono confrontate le risposte biologiche delle coculture composte da cellule immunitarie differenziate dai monociti appena isolati o scongelati, dopo l'esposizione a stimoli proinfiammatori.

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Impara a isolare macrofagi alveolari murini e valutarne l'attivazione indotta da nanoparticelle polianidride. Questo protocollo combina lavaggio broncoalveolare e citometria a flusso per studiare le risposte immunitarie polmonari.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l'attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

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