Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

Lo scopo del seguente esperimento è analizzare le proprietà viscoelastiche cellulari in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Questo viene ottenuto applicando una pressione negativa alla membrana cellulare tramite una micropipetta a pressione negativa collegata a un trasduttore di pressione, costruito utilizzando capillari di vetro con un estrattore di micropipette. La micropipetta è montata su un micro manipolatore fine posizionato sul piano di un microscopio invertito, e la punta della micropipetta viene avvicinata a una cellula.

Successivamente, si crea un sigillo tra la punta della pipetta e la membrana cellulare; la deformazione della membrana all'interno della pipetta viene quindi misurata in risposta a un gradino di pressione negativa applicato. Si ottengono risultati che mostrano gli effetti di diversi trattamenti sulle proprietà biomeccaniche cellulari in base al grado di deformazione della membrana in risposta a una forza ben definita. L'obiettivo del nostro laboratorio è studiare l'impatto della dislipidemia sulle proprietà biofisiche e biomeccaniche delle cellule endoteliali vascolari, e oggi vi illustreremo un metodo chiamato aspirazione con micropipetta, che utilizziamo per misurare la rigidità cellulare.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla comprensione fondamentale della biomeccanica cellulare in diversi meccanismi come l'angiogenesi, la percezione meccanica e la migrazione, e altri ancora. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biomeccanica cellulare, può essere applicato anche ad altri sistemi come membrane modello, organelli intracellulari o tessuti. Per visualizzare la membrana cellulare e osservare il protrudersi della membrana all'interno della pipetta, le membrane cellulari endoteliali vascolari vengono colorate con un colorante fluorescente lipofilico.

Per iniziare, diluire il colorante in soluzione con una soluzione di PBS riscaldata per ottenere una concentrazione di lavoro; sottoporre la miscela a sonificazione per cinque minuti al fine di rompere gli aggregati D. Dopo una centrifugazione di cinque minuti nel microcentrifugo, rimuovere il soprannatante e lavare le cellule endoteliali vascolari aggiungendo 0,5 millilitri di PBS. Dopo cinque minuti, aspirare la soluzione e procedere con altri due lavaggi.

Quindi aggiungere la soluzione dice alle cellule e incubare per 30 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare nuovamente le cellule con PBS come in precedenza. Le micropipette sono preparate riscaldando una capillare di vetro nella parte centrale.

Quando il vetro inizia a fondere, le due metà della capillare vengono allontanate per generare due micropipette. Le punte delle pipette utilizzate in questi esperimenti variano tipicamente tra due e sei micron. A seconda delle dimensioni della cellula, il diametro esterno e la forma della punta devono approssimare un tubo cilindrico prima di inserire la capillare di vetro nel tiratore di pipette.

In questa dimostrazione, viene utilizzato il tiratore orizzontale di pipette Suter P 97 con un programma ottimizzato. Questo strumento offre diverse opzioni programmabili per variare la velocità e altri parametri della trazione. Procedere ad attivare il programma di trazione.

Dopo aver tirato ogni micropipetta, verificare la forma della punta al microscopio. Dopo aver levigato la punta con la fiamma, riempire la micropipetta con una soluzione salina fisiologica come PBS o un mezzo di crescita non fluorescente. È importante che la soluzione sia integrata con il 30% di siero, che permetterà alla membrana cellulare di muoversi agevolmente all'interno della pipetta. In questa dimostrazione, si utilizza un microscopio fluorescente invertito dotato di capacità di deconvoluzione 3D, collegato a una videocamera connessa a un computer, un trasduttore di pressione, una stazione priva di vibrazioni e un micromanipolatore per iniziare a montare le cellule in una camera di aspirazione micrometrica sollevando le cellule dai loro substrati e trasferendole con la pipetta in una camera longitudinale poco profonda montata sul microscopio fluorescente invertito.

La ragione per cui si utilizza una camera longitudinale poco profonda è consentire a una micropipetta di avvicinarsi alle cellule con un angolo molto ridotto, il più vicino possibile all'orizzontale. Questo permette di visualizzare la membrana aspirata nella micropipetta su un singolo piano di messa a fuoco. Posizionare una micropipetta riempita in un porta-pipetta collegato a un trasduttore di potenza mediante un tubo flessibile, il cui diametro sia adatto al connettore del porta-pipetta per garantire un'aderenza stretta.

All'inizio di ogni esperimento, si equilibra la pressione nella pipetta con quella atmosferica, quindi si monta la pipetta su un micromanipolatore che permette un controllo fine dei movimenti della pipetta nell'ordine dei micron. Posizionare la pipetta con un angolo poco inclinato rispetto al fondo della camera e portare la punta della pipetta al centro del campo visivo. Il gambo della pipetta, ovvero la parte cilindrica della punta della pipetta in cui viene aspirata la membrana, deve essere allineato orizzontalmente al piano focale.

Per raggiungere questa prima posizione, posizionare la pipetta con l'angolo più basso possibile e quindi flettere il gambo della pipetta contro il fondo della camera. Poiché il gambo è molto sottile, è sufficientemente flessibile da scivolare sul fondo della camera mentre ci si avvicina a una cellula. Avvicinare lentamente la micropipetta lateralmente a una singola cellula utilizzando il manipolatore grossolano, fino a quando non si è vicini al piano di fuoco della cellula.

Quindi, utilizzando il micromanipolatore, spostare la micropipetta fino al bordo della cellula finché la punta della pipetta non tocca delicatamente la membrana. Acquisire un'immagine per osservare la posizione della pipetta. I buoni sigilli si formano quando l'intera punta della pipetta è a contatto completo con la superficie della cellula e il contatto risulta stabile.

Successivamente, applicare un passo di pressione negativa utilizzando il trasduttore e mantenerla fino a quando la proiezione della membrana non risulta stabilizzata. La quantità di pressione necessaria per aspirare la membrana all'interno della pipetta varia in base al tipo cellulare e alle specifiche condizioni sperimentali. La deformazione iniziale viene tipicamente osservata applicando una pressione compresa tra meno due e meno 15 millimetri di mercurio.

Quando viene applicata la pressione, la membrana si deforma gradualmente all'interno della pipetta fino a stabilizzarsi a una certa lunghezza. Un processo che richiede tipicamente due o tre minuti, durante il quale è necessario acquisire immagini della deformazione della membrana ogni 30 secondi per monitorarne l'avanzamento all'interno della pipetta. Infine, aumentare la pressione al livello successivo con incrementi di due o cinque millimetri di mercurio.

Ripetere l'intero procedimento fino a quando la protrusione della membrana si stacca dalla cellula e si sposta all'interno della pipetta, momento in cui l'esperimento viene interrotto. Per quantificare il grado di deformazione della membrana, si misura la lunghezza aspirata dalla punta della pipetta fino al vertice della circonferenza della protrusione membranosa. Una pipetta più grande applicherà una forza maggiore sulla membrana cellulare allo stesso livello di pressione, per tenere conto della variabilità tra i diametri delle pipette.

La lunghezza aspirata viene normalizzata rispetto al diametro della pipetta misurato per ogni esperimento al fine di validare l'utilizzo della tecnica di aspirazione microscopica su cellule aderenti al substrato; è stato verificato che la rottura dell'actina F porta a una diminuzione della rigidità delle cellule endoteliali aortiche bovine, come stimato mediante questo approccio. Qui viene mostrata una serie tipica di immagini fluorescenti di una membrana endoteliale che subisce una deformazione progressiva in risposta alla pressione negativa applicata attraverso una micropipetta, come previsto. La membrana viene gradualmente aspirata all'interno della pipetta e la lunghezza aspirata aumenta in funzione della pressione applicata; i tracciati temporali della deformazione mostrano che la rottura dell'actina F aumenta significativamente le lunghezze aspirate delle protrusioni in tutte le condizioni di pressione.

Utilizzando questo approccio, si è scoperto che la rigidità cellulare aumenta quando le membrane cellulari sono impoverite di colesterolo, mentre l'arricchimento di colesterolo non ha avuto alcun effetto. Qui vengono mostrate una cellula arricchita di colesterolo, una cellula di controllo e una cellula priva di colesterolo dopo aver raggiunto lunghezze massime di aspirazione di meno 15 millimetri di mercurio. Le protrusioni tipicamente iniziavano a svilupparsi a meno 10 millimetri di mercurio, e i tempi di insorgenza della deformazione della membrana potevano essere misurati alle pressioni negative di 10, 15 e 20 millimetri di mercurio.

Qui, le lunghezze massime aspirate sono riportate in funzione della pressione applicata. La lunghezza normalizzata massima nelle cellule impoverite era significativamente inferiore rispetto a quella delle cellule di controllo a pressioni di meno 15 millimetri di mercurio e meno 20 millimetri di mercurio. L'applicazione di pressioni negative superiori a 25 millimetri di mercurio ha provocato il distacco della proiezione aspirata, formando un sifone separato.

Il livello di pressione che ha provocato il distacco della membrana è stato simile in diverse condizioni di colesterolo, un'osservazione inaspettata. Come mostrano studi precedenti, l'aumento del colesterolo nella membrana ne accresce la rigidità nei bicchieri lipidici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore se effettuata correttamente. Nel tentativo di applicare questa tecnica, è importante ricordare che l'esperimento viene condotto su cellule singole.

Pertanto, devono essere analizzate da tre a cinque cellule per ogni condizione, per ogni esperimento, per un totale di tre esperimenti complessivi.