Cariotipo spettrale allo studio anomalie cromosomiche negli esseri umani e nei topi con malattia del rene policistico

Lo scopo di questa procedura è etichettare i cromosomi con sonde specifiche per identificare aberrazioni cromosomiche e difetti di segregazione in topi e esseri umani affetti da malattia renale policistica. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo cellule da esseri umani o topi e trattandole con smid, seguito da fissazione e preparazione di strisci metafasici su vetrini. Successivamente, il vetrino viene pretrattato per rimuovere l'RNA e il citoplasma in eccesso che potrebbero interferire con l'ibridazione.

Questo viene effettuato rispettivamente mediante digestione con RNAsi e pepsina. Successivamente si esegue la denaturazione di cromosomi e sonda, seguita dall'ibridazione per etichettare i cromosomi. L'ultimo passaggio consiste nel rilevamento della sonda mediante coloranti fluorescenti.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano anomalie numeriche e strutturali dei cromosomi mediante fluorescenza, microscopia e acquisizione delle immagini nonché analisi con il software Skyview. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le tecniche classiche di piegamento dei GIM, è che fornisce informazioni aggiuntive su aberrazioni cromosomiche complesse, come traslocazioni cromosomiche e riarrangiamenti cromosomici complessi, che non possono essere caratterizzati mediante tecniche classiche di piegamento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della malattia renale policistica, come il meccanismo di formazione dei reni cistici.

La procedura sarà dimostrata dal Dott. Wiam Abu, che consentirà a un talentuoso ricercatore post-dottorato senior del nostro laboratorio di iniziare coltivando cellule endoteliali in DMEM contenente dal 10 al 15% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza del 70-80%. Successivamente, trattare le cellule con soluzione di collaghenasi a una concentrazione finale di 0,05 milligrammi per millilitro per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius prima del raccolto. Per raccogliere le cellule, raccogliere innanzitutto il mezzo contenente le eventuali cellule in sospensione in provette centrifughe sterili da 50 millilitri.

Risciacquare le cellule nella piastra con PBS sterile una volta, dopo averle incubate con trips sterile per uno o due minuti, raccogliere e trasferire le cellule rimanenti nello stesso tubo. Dopo aver pellettizzato le cellule mediante centrifugazione a 1000 giri al minuto per cinque minuti, aspirare la maggior parte del surnatante dal tubo lasciando circa 0,5 millilitri sopra il pellet. Sciogliere il pellet cellulare agitando leggermente il tubo.

Successivamente, in base alla dimensione del pellet, aggiungere da cinque a dieci millilitri di una soluzione ipertonica costituita da cloruro di potassio allo 0,56% in acqua distillata e incubare la sospensione a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti. Al termine dell'incubazione, utilizzare una piccola pipetta da un millilitro per aggiungere una goccia di soluzione fissante fredda di ghiaccio per ogni millilitro di sospensione cellulare ipertonica. Quindi capovolgere delicatamente il tubo per mescolare, dopo aver centrifugato le cellule per cinque minuti a una velocità di 1.200 giri al minuto.

Aspirare il soprannatante come in precedenza. Successivamente, aggiungere lentamente un millilitro di soluzione fissativa fresca mentre si colpisce delicatamente il pellet. Poi aggiungere delicatamente altri quattro millilitri di fissativo alla parete del tubo.

Questa procedura è fondamentale per garantire che gli strati metafasici non rimangano intrappolati negli aggregati cellulari. Dopo aver ripetuto il passaggio di centrifugazione ed aver aspirato il soprannatante, sostituire i cinque-dieci millilitri di fissativo pipettando lentamente il fissativo lungo le pareti del tubo. A questo punto, le cellule possono essere conservate in un tubo chiuso ermeticamente a meno 20 gradi Celsius per un periodo breve o a meno 80 gradi Celsius per una conservazione a lungo termine, fino al momento in cui si è pronti per proseguire.

Quando si è pronti per procedere, verificare il numero di cromosomi in metafase nel preparato cellulare. Pulire il vetrino con etanolo assoluto. Successivamente, immergere il vetrino in acqua distillata circa 10 volte per formare un velo d'acqua sulla superficie del vetrino, appoggiare il vetrino su una lastra di vetro ed aggiungere 15-20 microlitri di sospensione cellulare da un'altezza di 10 pollici sopra il vetrino.

Posizionare il vetrino in un bagnomaria regolato a 65-70 gradi Celsius per uno o due minuti e lasciarlo asciugare. Esaminare il vetrino al microscopio ottico utilizzando gli obiettivi secchi da 10 e da 40 volte. Verificare la presenza di cromosomi in metafase e che le preparazioni siano uniformemente distanziate. Controllare il citoplasma circostante i cromosomi.

Se è presente del citoplasma, come mostrato qui, procedere con il pretrattamento del vetrino. Se non è presente citoplasma e i cromosomi hanno una buona morfologia, allora non è necessario effettuare il pretrattamento del vetrino a 120 microlitri di una soluzione appena preparata da uno a 200 di 20 milligrammi per millilitro. Soluzione di RNA disciolta in due volte SSC in un vetrino a coprioggetto di 24 millimetri per 60 millimetri.

Rovesciare il vetrino metafasico a faccia in giù sul vetrino coprioggetto. Quindi rovesciare delicatamente il vetrino metafasico a faccia in su. Posizionare il vetrino all'interno di una camera umidificata e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti.

Trascorso il tempo di incubazione, rimuovere con attenzione il vetrino coprioggetto senza graffiare il vetrino e lavare due volte con tampone SSC in un barattolo di accoppiamento, tre volte per cinque minuti ciascuno, agitando. Nel frattempo, aggiungere da cinque a 15 microlitri di pepina 100 milligrammi per millilitro in acqua distillata in un becher pulito, quindi aggiungere 100 millilitri di acido cloridrico 0,01 molare preriscaldato a 37 gradi Celsius. È importante aggiungere la pepina nel becher pulito per prima, altrimenti non si scioglierà.

Trasferire questa soluzione in un barattolo Coplan. Incubare il vetrino di lavaggio nel barattolo di accoppiamento a 37 gradi Celsius per non più di tre-cinque minuti dopo la digestione. Lavare il vetrino due volte in un barattolo Copin contenente un XPBS per cinque minuti ciascuno, agitando.

Proseguire con un lavaggio di cinque minuti in un barattolo copin contenente PBS integrato con cloruro di magnesio. Quindi effettuare un'incubazione di 10 minuti in un barattolo copin contenente formaldeide al 1%, seguita da un ultimo lavaggio in un barattolo cochin contenente PBS 1X per cinque minuti. Successivamente disidratare i barattoli cochin contenenti una serie di etanolo al 70%, 80% e 100% per due minuti ciascuno, quindi lasciare asciugare all'aria.

Osservare il vetrino al microscopio ottico utilizzando un obiettivo secco da 40 volte per verificare un'adeguata digestione, l'assenza di citoplasma e la conservazione della morfologia dei cromosomi. Infine, selezionare un'area per l'ibridazione utilizzando una penna a punta di diamante. Dopo aver preparato fresca la soluzione denaturante, versarla in un barattolo Coplin e preriscaldarla a 70 gradi Celsius in un bagno termico.

Quindi posizionare il vetrino nel barattolo di Coplin contenente la soluzione denaturante preriscaldata in un bagno d'acqua a 70 gradi Celsius per 30 secondi fino a un minuto. Dopo l'incubazione, posizionare immediatamente il vetrino in etanolo ghiacciato al 70% per tre minuti, seguito da etanolo all'80% e al 100% per tre minuti ciascuno, quindi lasciare asciugare all'aria. Esaminare il vetrino per valutare la morfologia dei cromosomi, osservando la presenza di cromosomi scuri che non appaiono chiari o lucenti.

Indica un buon cromosoma o morfologia. Riscaldare la vernice celeste. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione per 20 minuti.

Quindi vortexare e centrifugare brevemente a 1000 giri per minuto per alcuni minuti. Denaturare la sonda in un termociclatore a 85 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da un'incubazione a 37 gradi Celsius per alcuni secondi. Applicare 10 microlitri della sonda denaturata sull'area di ibridazione e coprire con un vetrino di 22 millimetri per 40 millimetri per un'ora.

Assicurarsi di non intrappolare bolle d'aria e sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con cemento di gomma, quindi incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 48-72 ore. Rimuovere con attenzione il vetrino coprioggetto e posizionare il vetrino in un barattolo portaoggetti contenente una soluzione di lavaggio appena preparata, preriscaldata a 45 gradi Celsius. Lavare per cinque minuti, tre volte a 45 gradi Celsius, in un bagno d'acqua agitato a 45 rotazioni al minuto.

Quindi lavare i vetrini due volte nella soluzione di lavaggio due a 45 gradi Celsius per cinque minuti ciascuno con agitazione, seguiti da cinque minuti nella soluzione di lavaggio tre a 45 gradi Celsius con agitazione. Successivamente, applicare 80 microlitri di reagente bloccante. Poi posizionare un coprivetrino e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Rimuovere il coprivetrino e lasciare defluire il liquido. Applicare 80 microlitri di reagente colorante sci-fi. Applicare un coprivetrino e incubare a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare il vetrino con soluzione di lavaggio tre volte a 45 gradi Celsius per cinque minuti ciascuna, agitando.

Successivamente, applicare 80 microlitri di reagente colorante PS 5,5. Posizionare una lamella e incubare a 37 gradi Celsius per 40 minuti; dopo l'incubazione, lavare tre volte con la soluzione di lavaggio tre, come in precedenza. Infine, inclinare il vetrino e lasciare defluire il liquido.

Applicare 20 microlitri del reagente Antifa dappy e posizionare un vetrino coprioggetto di 24 millimetri per 60 millimetri. Rimuovere con attenzione le bolle d'aria che potrebbero essersi formate. I preparati possono essere analizzati immediatamente oppure conservati a quattro gradi Celsius al buio per non più di una settimana. Questa immagine a cielo di una normale metafase proveniente da un topo di tipo selvatico è stata acquisita utilizzando un microscopio Olympus dotato di un obiettivo ad immersione in olio da 60 volte.

Un filtro personalizzato a tre bande passanti noto come cubo spettrale, un filtro dappy e un modulo interferometro sac con una telecamera CCD. I cariotipi spettrali sono stati eseguiti utilizzando il software Skyview. Il pannello in alto a sinistra mostra la metafase marcata, mentre quello in alto a destra mostra un'immagine in campo chiaro dello strato.

Il pannello inferiore mostra il cromosoma ordinato in modo crescente utilizzando il software skyview. Questa immagine ottenuta con skyview di un allargamento di metafase da un topo knock-out omozigote per pkd mostra un numero anormale di cromosomi, con 68 cromosomi presenti invece di 40. Sono inoltre visibili anomalie cromosomiche come la delezione del cromosoma otto e le traslocazioni cromosomiche, come quelle tra i cromosomi cinque e 16, e anche tra i cromosomi 11 e 19.

Questa immagine a cielo di una metafase di cromosomi umani provenienti dal tessuto vascolare di un paziente non affetto da A-D-P-K-D presenta il cariotipo femminile normale composto da 44 autosomi e due cromosomi sessuali XXX. Questa immagine finale a cielo mostra una metafase proveniente dal tessuto vascolare di un paziente affetto da A-D-P-K-D con un cariotipo anomalo di 88 autosomi e quattro cromosomi sessuali XXXX. Un solo maestro.

Questa tecnica può essere eseguita in cinque giorni se viene effettuata correttamente.