A Step-by-step Metodo per la ricostituzione di un Transporter ABC in particelle lipidiche Nanodisc

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di incorporare un trasportatore A, b, C. In questo caso, il trasportatore del maltosio malf GK two in particelle di nano disco di membrana solubili. Ciò si ottiene mescolando prima la proteina MSP dell'impalcatura di membrana con il trasportatore e la corretta quantità di lipidi nelle cellule detergenti.

Il secondo passo consiste nell'aggiungere perle di polistirolo e far oscillare delicatamente la miscela durante la notte, il detersivo viene progressivamente assorbito sulle perline, permettendo la formazione delle particelle del nano disco. Successivamente, le perle vengono rimosse per sedimentazione. Il passaggio finale consiste nel separare i dischi correttamente formati dagli aggregati e dalle proteine dell'impalcatura non assemblate mediante cromatografia a filtrazione su gel.

Infine, la qualità dei dischi viene valutata mediante elettroforesi su gel nativo o spettroscopia di diffusione della luce. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi come i liposomi, è che le proteine e i dischi di membrana sono perfettamente solubili in soluzione acquosa. Inoltre, i domini proteici sono ora accessibili da entrambi i lati.

Da ora non c'è più compartimento di membrana Utilizzando proteine di scaffold di membrana di diverse lunghezze, sono stato in grado di intrappolare e studiare i diversi stati legamentosi delle proteine di membrana. Ancora più importante, questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della proteomica di membrana, come l'identificazione di nuovi partner di legame dei trasportatori a, b, C. Infatti, le implicazioni di questa tecnica si estendono ulteriormente verso la terapia perché può aiutare la scoperta di attivatori o inibitori delle proteine di membrana e dei recettori.

Sebbene questo metodo sembri semplice, è necessario prestare attenzione quando si sceglie il corretto rapporto tra proteine e lipidi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo hanno difficoltà a calcolare il corretto rapporto di stampaggio o a eseguire il controllo corretto che garantisce la qualità della preparazione. Pertanto, una dimostrazione visiva di questo metodo è molto utile per un nuovo studente per apprendere i vari passaggi e le potenziali difficoltà.

Per iniziare gro hexa istidina marcata MSP nel ceppo di e coli BL 21 DE tre dal plasmide P MSSP 1D uno ha indotto la produzione di proteine quando la densità ottica misurata a 600 nanometri è di circa 0,5 per tre ore a 37 gradi Celsius, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.000 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet in un tampone TSG 10 contenente 100 pidocchi micromolari PMSF con una pressa francese tre volte a 8.000 PS. Rimuovo il materiale insolubile mediante centrifugazione a 5.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi isolare la frazione solubile contenente l'MSP mediante ultracentrifugazione a 125.000 Gs per 45 minuti.

Purificare l'MSP mediante cromatografia chelante al nichel utilizzando circa 1,5 millilitri di siero di nichel ad alte prestazioni in tampone TSG 10. Lavare via i contaminanti con il tampone T SG 10 contenente 50 millimolari di eluizione ILE. L'MSP con tampone TSG 10 contenente 600 millimolari di midaz I dopo la dialisi.

La proteina purificata nel tampone MSP TSG 10 può essere conservata a meno 70 gradi Celsius e una concentrazione proteica di circa 10-15 milligrammi per millilitro. Il complesso MALF GK due, marcato all'estremità C del MAL K, è espresso dal plasmide. PED 22 FG K coltivato nel ceppo di e coli BL 21 DE tre induce la produzione di proteine quando la densità ottica misurata a 600 nanometri è di circa 0,5 con 0,2% L arabi per tre ore a 37 gradi Celsius dopo lisi cellulare e centrifugazione.

Come in precedenza, sospendiamo il pellet a membrana in tampone TSG 20 a una concentrazione finale di cinque milligrammi per millilitro. Successivamente, solubilizzare il materiale con l'1% in peso per volume GDM per tre ore a quattro gradi Celsius agitando delicatamente. Rimuovere il materiale insolubile mediante ultracentrifugazione come per la purificazione di MAL FTK two.

Quindi raccogliere il surnatante contenente il complesso solubilizzato di mal FTK two e purificare nuovamente con cromatografia chelante al nichel. Purificare ulteriormente il complesso mediante cromatografia di filtrazione su gel in tampone TSGD su una colonna SUEx 200, HR ten trecento a una velocità di flusso di 0,5 millilitri al minuto. Per preparare i fosfolipidi, un estratto lipidico totale di E coli disciolto in cloroformio viene separato in 1000 aliquote anomiali in provette per microfiche con tappo a vite, evapora il solvente sotto un leggero flusso di azoto e viene ulteriormente guidato per una notte nel vuoto.

Essiccare quindi, sciogliere il film lipidico nel tampone TS alla concentrazione finale di cinque NMO e agitare vigorosamente, quindi sonicare a impulsi cinque volte per circa cinque secondi. I lipidi disciolti appariranno leggermente opachi a causa della loro generale insolubilità nel tampone TS acquoso, ma dovrebbero rimanere in sospensione. Aggiungere DDM a una concentrazione finale dello 0,5%A questo punto, la soluzione diventerà chiara, posizionare la miscela lipidica in un bagno d'acqua e pulsare cinque volte per circa cinque secondi.

La miscela lipidica può essere conservata a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per preparare le perle bio, mettere circa 10-15 millilitri di perline bio in un tubo da 50 millilitri. Per prima cosa, lava le perle con 50 millilitri di metanolo al 100%.

Lasciare che le perle si depositino per gravità e poi versare delicatamente la soluzione. Ripetere il processo una volta per il metanolo e poi due volte ciascuno per il 95% di etanolo milli Q di acqua e infine il tampone TS. Iniziare la costituzione nano discreta diluendo l'MSP nel tampone TSGD alla concentrazione finale di circa sette milligrammi per millilitro o 0,3 millimolari.

Per garantire il successo dell'esperimento, è importante scegliere i rapporti corretti tra lipidi e proteine da miscelare insieme. Mescolare circa due M di malf purificato GK due complesso a una proteina a MS P a rapporto lipidico da uno a tre a 60 in tampone TSGD per un volume finale di 300 microlitri qui, un campione di lipidi in eccesso nel rapporto da uno a tre a 400 viene anche preparato come controllo negativo a 50 microlitri di sospensione di bio bead al tubo e incubare la miscela durante la notte su un tavolo a dondolo a quattro gradi Celsius il giorno seguente, sedimentare le perle per gravità. Una volta che le perle si sono depositate, passare alla soluzione attraverso una punta stretta per evitare il più possibile le bio perline.

Rimuovere i precipitati di grandi dimensioni mediante ultracentrifugazione a 100.000 GS per 20 minuti. Procedere alla purificazione dei dischi mediante cromatografia con filtrazione su gel come eseguito in precedenza nel tampone TSG 10. Successivamente, iniettare un Eloqua sulla stessa colonna di filtrazione su gel per testare la stabilità del preparato.

Quindi raggruppare le frazioni contenenti i dischi. La qualità del preparato viene valutata mediante elettroforesi su gel nativo. Analizzare un micromolare di nano dischi per valutare la qualità della ricostituzione.

Valutare anche il legame di mal E al complesso mal ftk two ricostituito in nano dischi. Dopo l'elettroforesi, colorare il gel con il blu kumasi per 10 minuti e trattenere per circa un'ora. Per eseguire la diffusione dinamica della luce o DLS, purificare prima i nano dischi mediante cromatografia a filtrazione su gel come in precedenza, utilizzando una colonna SUEx 200 HR ten threehundred a una velocità di flusso di 0,1 millilitri al minuto.

Raggruppare frazioni contenenti nano dischi e concentrare a circa 10 milligrammi per millilitro con un filtro centrifugo AmCon. Quindi filtrare il campione due volte. Esecuzione dell'analisi mediante DLS utilizzando uno strumento dynapro nano star in un volume interno di un microlitro di quarzo vete fit data.

Utilizzando il software dinamico per stimare il diametro e il peso molecolare delle particelle, determinare l'attività di A TPAs di due nanodischi ricostituiti mal FTK utilizzando un saggio metrico chole. Per prima cosa mescolare un micromolare di dischi purificati e un millimolare a TP con quantità crescenti di mal e. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi misurare il rilascio di fosfato inorganico a 660 nanometri. Confrontare la quantità di fosfato rilasciata con una curva standard generata con una soluzione standard di fosforo. I nano dischi vengono purificati mediante cromatografia con filtrazione su gel.

Il cromatogramma mostra che la maggior parte dei dischi ricostituiti eluisce come un singolo picco, mentre i dischi realizzati con lipidi in eccesso eluiscono nel volume vuoto, e come una serie di picchi larghi, la qualità della preparazione del disco viene ulteriormente analizzata da dischi per elettroforesi su gel nativi ricostituiti con una quantità limitata di lipidi migrano come una banda tagliente sul gel nativo, mentre quelli ricostituiti in presenza di un eccesso di lipidi migrano sotto forma di strisci. L'analisi del DLS mostra che la popolazione del disco è omogenea con un raggio medio di 5,0 nanometri. Sulla base dell'approssimazione DLS, i dischi ricostituiti hanno un peso molecolare apparente di 215 kilodalton. I campioni ricostituiti in presenza di lipidi in eccesso mostrano raggi ampiamente distribuiti intorno ai 100 nanometri, tipico per i campioni non omogenei.

L'attività del complesso MAL FTK two viene valutata misurando la velocità di idrolisi di un TP e l'affinità per partner interagenti come la proteina legante il maltosio, MAL E, la proteina legante il maltosio. MAL E si lega con un'elevata affinità al trasportatore MAL FTK two utilizzando l'elettroforesi su gel non denaturante. È possibile rilevare un complesso tra MAL E e MAL ftk due, la stimolazione dell'attività MAL KA TPA da parte di MAL E è mostrata qui in funzione della concentrazione di MAL e.

La realizzazione del nanodisco è relativamente semplice, ma piccole deviazioni dalle condizioni ottimali possono portare a un'aggregazione proteica irreversibile una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare l'importanza di scegliere un corretto rapporto lipidico proteico perché una quantità eccessiva di lipidi porterà alla produzione di particelle simili a liposomi polidispersi di grandi dimensioni. È fondamentale analizzare attentamente la qualità del materiale ricostituito utilizzando tecniche diverse dalla filtrazione su gel, come la spettroscopia di diffusione della luce, l'ultracentrifugazione analitica o più semplicemente l'elettroforesi su gel nativo.

Ricorda, il tipo di fosfolipide che incorpora il disco e la proteina dell'impalcatura di membrana possono contribuire all'efficienza della ricostituzione. Dopo aver visto questo video, speriamo che tu abbia una buona comprensione di come generare nano dischi solubili e omogenei contenenti la tua proteina di membrana preferita. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.