Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati In vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare le risposte di unità singole in vivo da una popolazione identificata di neuroni in un sistema modello non genetico. Questo viene ottenuto innanzitutto eseguendo una craniotomia per esporre la regione cerebrale di interesse. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare fili di tungsteno per depositare il colorante fluorescente nella regione a cui i neuroni bersaglio proiettano.

Successivamente, il colorante viene trasportato in senso retrogrado, determinando un'etichettatura selettiva dei neuroni a proiezione. L'ultimo passaggio consiste nel registrare dall'assone etichettato del singolo neurone a proiezione. Infine, si utilizzano registrazioni extracellulari di unità singole per mostrare come i neuroni sensoriali centrali in un circuito integro rispondano alla stimolazione sensoriale in evo.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali su come i circuiti neurologici rilevino differenze di temporizzazione negli input sinaptici inferiori al millisecondo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la capacità di indirizzare singoli neuroni o persino assoni e sistemi non accessibili geneticamente. I pesci elettrici settimanali utilizzano segnali elettrici per la comunicazione e la navigazione.

Distinguono i segnali provenienti da pesci diversi utilizzando differenze di pochi microsecondi nei tempi di arrivo degli input sinaptici. Ci siamo chiesti come i neuroni comparatori di tempo presumibilmente presenti nel loro circuito elettrosensoriale riescano a rilevare differenze temporali così ridotte. Tuttavia, questa tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi, come le vie sensoriali visive e uditive.

È particolarmente difficile ottenere liquido da queste cellule a causa delle piccole dimensioni, del denso intreccio nei tessuti circostanti e dei terminali presinaptici che ricoprono gran parte del corpo cellulare. L'iniezione intracellulare di colorante durante una registrazione in configurazione whole cell etichetta una singola cellula per guidare registrazioni mirate da quell'assone. Analogamente, il trasporto retrogrado successivo all'iniezione extracellulare di colorante fornisce un mezzo per etichettare selettivamente i neuroni a proiezione nelle regioni superficiali del cervello.

Questo può essere utilizzato per fornire un orientamento visivo per le registrazioni in vivo di singole unità. Per preparare l'ago codificato con D, affilare elettroliticamente la sera prima dell'esperimento un filo di tungsteno con diametro di 160 micrometri fino a ottenere un diametro finale della punta dell'ago compreso tra cinque e 50 micrometri. Successivamente, codificare la punta dell'ago con una soluzione di due millimoli di colorante Alexa floor coniugato alla destrana con peso molecolare di 10.000 per indurre l'anestesia generale.

Posizionare il pesce nell'acqua della vasca con soluzione MS 222 a 300 milligrammi per litro per immobilizzare e silenziare elettricamente il pesce, iniettando 100 microlitri di flail a tre milligrammi per millilitro nel muscolo dorsale del corpo. Successivamente, riempire la camera di registrazione con acqua della vasca e posizionare il pesce con il lato ventrale verso il basso sulla piattaforma al centro della camera. Quindi, somministrare la soluzione MS 222 aerata a 100 milligrammi per litro a una velocità di uno-due millilitri al minuto inserendo la punta di una pipetta nella sua bocca.

Successivamente, stabilizzare il pesce con aste fisse e cera su entrambi i lati del corpo. Monitorare le condizioni di salute del pesce verificando il flusso sanguigno continuo nei vasi oculari e un colore normale del corpo. Quindi ruotare la piattaforma lungo l'asse verticale.

Regolare un'estremità della piattaforma in modo che un lato della superficie dorsale della testa del pesce sia esposto al di sopra della superficie dell'acqua, mentre il resto del corpo del pesce rimane immerso. Posizionare un piccolo pezzo di salvietta Kim sulle parti della pelle non immerse per prevenire l'essiccamento. In questo procedimento, applicare lidocaina allo 0,4% sulla superficie esposta della testa utilizzando un bastoncino cotonato.

Quindi utilizzare una lama di bisturi per tagliare un pezzo di tessuto cutaneo di forma rettangolare di circa tre millimetri per cinque millimetri per un pesce di 6,2 centimetri. Il margine laterale del rettangolo deve essere allineato con il centro dell'occhio. Il margine anteriore del rettangolo deve trovarsi appena posteriormente all'occhio, e il margine mediale del rettangolo deve trovarsi appena lateralmente alla linea mediana.

Successivamente, rimuovere il rettangolo utilizzando una pinzetta. Tagliare un ulteriore quadrato di 2,5 millimetri nella regione anteriore per esporre il cranio. Rimuovere completamente qualsiasi tessuto in eccesso dalla superficie esposta del cranio raschiando con la lama del bisturi.

Quindi asciugare completamente la superficie con un fazzoletto Kim e aria forzata. Successivamente, incollare un perno metallico alla regione anteriore mediale del cranio esposta utilizzando colla cianoacrilica. Attendere fino a quando la colla non sarà completamente asciutta.

Utilizzare un trapano dentale con una punta in carburo a sfera del diametro di 0,5 millimetri per tracciare un rettangolo di circa due millimetri per quattro millimetri sul cranio di un pesce di 6,2 centimetri. Successivamente, tagliare il perimetro del rettangolo con bisturi e pinzette. Quindi staccare il cranio.

Per esporre il cervello, tagliare sia la dura madre pigmentata sia la pia madre trasparente utilizzando un paio di forbici a molla o un ago. Quindi rimuovere le porzioni tagliate con un paio di pinzette per esporre il nucleo laterale esterno anteriore e il nucleo laterale esterno posteriore. Posizionare ora un manipolatore con un ago rivestito di D preparato in precedenza sopra la regione bersaglio contenente gli assoni di interesse.

Nel nostro caso, il nucleo posteriore extra laterale inserisce rapidamente l'ago di circa 25 micrometri nel tessuto. Dopo che il colorante si è diffuso per 15-30 secondi, ritirare l'ago. Ripetere l'operazione con aghi freschi aggiuntivi secondo necessità.

Posizionarne ciascuno in un punto diverso in modo che il colorante si distribuisca in tutta la regione bersaglio. Quindi rimuovere il colorante in eccesso dalla cavità con soluzione di Ringer di Hickman e attendere almeno due ore per il captazione e il trasporto del colorante. Per visualizzare gli assoni di interesse, posizionare la camera di registrazione con il pesce al di sotto dell'obiettivo di un microscopio epi a fluorescenza con piatto fisso verticale.

Passare alla soluzione di respirazione con acqua fresca del serbatoio e mantenere la stessa velocità di flusso. Quindi inserire un'estremità del filo di massa nella cavità cerebrale esposta e collegare l'altra estremità alla massa della testa del registratore. Successivamente, posizionare una coppia di elettrodi di registrazione accanto alla base della coda.

Quindi collegare gli elettrodi a un amplificatore differenziale e a un dispositivo di registrazione. Per monitorare il comando di scarica dell'organo elettrico (EODC), preparare un disegno in scala della regione cerebrale osservata a basso ingrandimento, includendo i principali vasi sanguigni come punti di riferimento per identificare la posizione esatta degli assoni marcati. Per confermare prima la posizione di D, osservare l'intero tessuto con illuminazione in campo chiaro per l'orientamento.

Quindi osservatelo con illuminazione fluorescente. Il nucleo laterale esterno posteriore deve mostrare una marcatura diffusa. Successivamente, a ingrandimento elevato, localizzate il nucleo laterale esterno anteriore utilizzando i vasi come punti di riferimento.

Illuminalo con luce fluorescente mentre cerchi un assone marcato in prossimità della superficie, utilizzando un capillare di vetro in borosilicato con un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,58 millimetri, dotato di filamento. Tira un elettrodo di registrazione con un gambo stretto lungo cinque millimetri e un diametro della punta compreso tra uno e 2,4 micrometri.

Riempire l'elettrodo con soluzione di Ringer filtrata di Hickman. La resistenza finale della punta deve essere compresa tra 16 e 155 megaohm. Posizionare l'elettrodo in un supporto per elettrodi dotato di un attacco per la pressione.

Collegarlo alla testa montata su un manipolatore. Successivamente, collegare la testa a un amplificatore. Un dispositivo di acquisizione da analogico a digitale, non mostrato, collega l'amplificatore al computer.

In seguito, applicare una pressione positiva di 30 millibar alla linea dell'elettrodo. Avanzare lentamente l'elettrodo verso l'assone dalla superficie del tessuto. Quando l'elettrodo si avvicina all'assone, la pressione positiva dovrebbe causare un lieve ma percettibile movimento dell'assone mentre l'elettrodo si trova accanto ad esso.

Registrare l'attività durante la presentazione degli stimoli di prova. Sebbene un artefatto elettrico confermi una corretta registrazione e stimolazione, non dovrebbero verificarsi potenziali d'azione. Rilasciare la pressione esterna sull'elettrodo e ripetere la stimolazione e la registrazione.

Quindi applicare una leggera aspirazione in modo che l'assone entri nell'elettrodo. Ripetere la stimolazione e la registrazione. A questo punto si dovrebbero osservare alcuni potenziali d'azione in risposta alle stimolazioni.

Una volta visibili i potenziali d'azione, chiudere la linea della pressione. Quando tutte le registrazioni desiderate sono completate, riportare l'acqua del serbatoio alla soluzione di respirazione con MS 2 22 a cento milligrammi per litro per assicurare un'anestesia completa del pesce. Nessun EODC dovrebbe essere rilevato per almeno 10 minuti prima di eutanasizzare il pesce.

Di seguito sono riportati cinque tracciati campione che mostrano i potenziali d'azione evocati da uno stimolo quadrato trasversale monofasico contralaterale positivo di 0,1 millisecondi e sei millivolt per centimetro, e qui è mostrato un grafico a rastrello che illustra i tempi degli impulsi durante 20 ripetizioni di una finestra di registrazione di 75 millisecondi per la stessa unità stimolata all'istante zero con stimoli di sei millivolt per centimetro. L'intervallo delle durate è indicato a destra. Qui è mostrata una curva di sintonizzazione della durata dello stimolo che quantifica le risposte in termini di impulsi per ripetizione dello stimolo.

Una volta acquisita padronanza, l'intervento chirurgico e l'iniezione del colorante mostrati in questa tecnica possono essere eseguiti in un'ora se effettuati correttamente, e le registrazioni possono iniziare da due a tre ore dopo l'iniezione del colorante. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare attentamente lo stato di salute dell'animale sperimentale dopo l'intervento. Altri metodi, come l'immagine a due fotoni, possono essere eseguiti al fine di registrare l'attività di neuroni situati in strutture cerebrali ancora più profonde.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e registrare le risposte di unità singole da una popolazione identificata di neuroni.