Name: Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Scopri la registrazione extracellulare mirata da neuroni identificati in vivo mediante etichettatura fluorescente retrograda. Questa tecnica consente di studiare i circuiti neuronali in sistemi non genetici con precisione.

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I finanziamenti forniti dalla National Science Foundation (IOS-1050701 a BAC), il National Institutes of Health (NS54174 di SM e F30DC0111907 di AML-W.), Il Uehara Memorial Foundation e la Japan Society per la promozione della scienza (G2205 di TK ). Ringraziamo Julian Meeks per il suo sostegno e la guida in tema di registrazioni extracellulari assonale. Ringraziamo Carl Hopkins per la fornitura di una camera di registrazione prototipo.

<ol><li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control%3A+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li>
<li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li>
<li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099(2009).</li>
<li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li>
<li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dogged+pursuit+of+coincidence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li>
<li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish%3A+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li>
<li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li>
<li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li>
<li>Hitschfeld, ÉM., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR.+J%22%5BJournal%5D)">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li>
<li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li>
<li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%3A+Neuroethol+Sens+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li>
<li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li>
<li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain%3A+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li>
<li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li>
<li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li>
<li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li>
<li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
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<li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
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<li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons%3A+applications+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li>
<li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na%2B+current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li>
<li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li>
<li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li>
<li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una volta padroneggiata, questa tecnica permetterà uno a bersaglio i neuroni identificati, tra cui i singoli assoni, per registrazioni in vivo in molti sistemi modello. Inoltre, questa tecnica permette di registrare attendibilmente uscita spike da neuroni con caratteristiche anatomiche uniche che rendono tradizionali metodi di registrazione in vivo impegnativo. Abbiamo utilizzato questa tecnica per registrare da Ela &quot;piccole cellule&quot; in mormyrid pesci debolmente elettrico. I precedenti tentativi di studiare le proprietà di sintonia di &quot;piccole celle&quot; non hanno avuto successo a causa di condizioni di ripresa difficili 11, 14. Caratteristiche anatomiche simili creano ostacoli all&#39;ottenimento di registrazioni singola unità da molti uditivo vertebrati diversi e neuroni electrosensory 8-10. Per superare queste sfide nel nostro sistema, abbiamo approfittato del fatto che &quot;piccole celle&quot; sono le uniche cellule in ELA che proiettano a Elp. Così, trasporto retrogrado di colorante collocato in Elp limita etichettatura in ELA &quot;piccolocellulari &quot;somas e assoni. etichettatura fluorescente degli assoni consentito il posizionamento degli elettrodi preciso vicino al assoni etichettati, effettuare registrazioni singola unità di cellule identificate possibili nonostante somas inaccessibili. Abbiamo tentato registrazioni somatiche, ma non hanno avuto successo, probabilmente a causa delle circostanti sinapsi engulfing 11 , 17. Tuttavia il marchio somatica era chiaramente visibile suggerendo che questa tecnica potrebbe essere utilizzato per mirare registrazioni somatiche in altri tipi cellulari e altri circuiti. etichettatura fluorescente di neuroni attraverso trasporto retrogrado in vivo è stato usato per guidare registrazioni mirate in vitro 19-21 . Una tecnica simile è stata utilizzata per la mirata in registrazioni dal vivo motoneuroni zebrafish midollo spinale 22. nostro lavoro rappresenta una nuova espansione di questo approccio, in cui sia l&#39;etichettatura e la registrazione sono fatte in vivo all&#39;interno del cervello. nostro metodo dimostra che in vivo etichettatura delle aree del sistema nervoso centrale con un retrogrado tcorridore può essere ampliato per lo studio di altri circuiti intatti con i neuroni di proiezione allo stesso modo selettivo. Per esempio, in elaborazione uditiva mammiferi, il collicolo inferiore (IC) serve come un centro importante relè per ingressi da più strutture rhombencephalic 23. Iniezione di colorante nella IC avrebbe etichettare selettivamente le cellule di proiezione da ciascuno di questi nuclei. Il collicolo superiore (SC) ha una funzione simile per la visione 24. Preparazioni midollo spinale sono particolarmente adatti per questa tecnica, come il midollo spinale è facilmente accessibile, iniezione colorante può verificarsi lontano dal sito di registrazione, e può essere combinato con registrazione intracellulare e riempimento dei neuroni selezionati per acquisire informazioni più dettagliate anatomico 25. Infine, tratto-tracing è una tecnica ben consolidata utilizzata in tutto il sistema nervoso centrale per mappare circuiteria complessa 26. Il nostro metodo può essere utilizzato per aggiungere informazioni funzionali a questi studi come è stato fatto wIndicatori di calcio-sensibili esima in gatto corteccia visiva 27. L&#39;intervento, che è ben stabilita, affidabile, e regolarmente utilizzati per ciechi in vivo registrazioni 16, deve essere completato con minimo sanguinamento e nessun danneggiamento della superficie del cervello per consentire l&#39;animale e il tessuto di sopravvivere. Con la pratica, l&#39;applicazione chirurgia e colorante può essere completato in 30-45 minuti. Abbiamo etichettato con successo &quot;piccole cellule&quot; assoni nel 67% dei preparativi. La maggior parte dei preparativi sono solo 1 o 2 assoni etichettati visibili, ma alcuni hanno ben 8. Delle 119 unità etichettati tentato, abbiamo ottenuto le registrazioni singola unità da 26 unità distribuite su 12 preparati (Tabella 2). Pertanto, i dati sono stati raccolti da 41% di preparazioni assoni etichettati per una percentuale di successo del 28%. L&#39;aspetto critico di applicazione colorante viene etichettando profondità. Inserimento superficiale del filo di tungsteno comporterà il colorante essendo aw lavatoay. Tuttavia, se la penetrazione è troppo profonda, assoni etichettati non saranno visibili per il targeting. Inoltre, alcuni danni meccanici alla cella deve verificarsi per la tintura di essere adeguatamente ripreso 25, 28. Tuttavia, troppi danni uccide le cellule. Abbiamo tentato di etichettatura con altri coloranti e altri metodi (Tabella 2), tra cui l&#39;etichettatura anterograda attraverso iniezione colorante in ELA in coppia con la registrazione da assoni etichettati a Elp (Tabella 3). Ipotizziamo che l&#39;etichettatura anterograda non è riuscita perché l&#39;etichettatura è stata limitata alle cellule con danni somatici, rendendoli insensibili. Inoltre, i terminali presinaptici possono essere stati disturbati. Al contrario, marcatura retrograda minimizza sia di queste preoccupazioni. La quantità e la posizione di applicazione colorante possono essere modificati secondo la particolare circuito studiato. Etichettatura massima si verifica con la maggiore concentrazione di colorante, che abbiamo realizzato con fili di tungsteno rivestiti. Tuttavia, per l&#39;etichettatura di assoni con deproiezioni ep, colorante può venire fuori un ago di tungsteno in quanto è avanzato. In questi casi, la pressione di iniezione sarebbe più appropriato. Assorbimento della tintura e il trasporto sono rapidi, con assoni etichettato la nostra preparazione e sia ben visibile fin da 2 ore dopo l&#39;iniezione e ulteriori assoni etichettati appaiono più tardi sei ore dopo l&#39;iniezione. Pertanto, l&#39;etichettatura e la registrazione può essere realizzato in un solo giorno, eliminando le difficoltà tecniche connesse con la chirurgia sopravvivenza. Timing varierà per ogni applicazione a seconda della distanza necessaria per il trasporto colorante. Un altro aspetto critico è il posizionamento degli elettrodi. È importante immettere il tessuto vicino al sito dell&#39;assone marcato per evitare l&#39;ostruzione della punta. Per il tessuto denso come in ELA, un lungo, gambo sottile sulla elettrodo di registrazione minimizza eccesso movimento del tessuto circostante. Se una registrazione di successo non si ottiene al primo tentativo, ripetere con elettrodi freschi fino a una registrazione si ottiene o il papue è interrotto al punto in cui l&#39;assone non è più visibile. Tuttavia, è anche importante per velocemente l&#39;elettrodo vicino alla assone per minimizzare la quantità di esposizione fluorescente, che può causare fototossicità, candeggio e possono influenzare le proprietà fisiologiche della cellula 29-31. Una volta che un segmento di assone viene aspirato con successo nella elettrodo di registrazione, le registrazioni possono essere ottenuti per diverse ore. Se le unità sono sempre persi in meno di 1 ora, considerare la possibilità di punte degli elettrodi più piccoli per evitare l&#39;assone di scivolare fuori. D&#39;altra parte, troppo piccola di una punta può provocare l&#39;intasamento, bassa segnale-rumore, o danni al assone. Una diminuzione costante nel picco di ampiezza e il &#39;ritorno&#39; di una unità con l&#39;aggiunta di aspirazione è un&#39;indicazione che la punta è troppo grande. Troppo aspirazione può causare danni irreparabili al assone. Una soluzione è quella di consentire una piccola perdita nella linea aria quindi la pressione lentamente ritorna a zero. Rapidamente equalizzazione Thpressione e si tradurrà in un parente-esteriore &#39;push&#39; transitoria che può espellere l&#39;assone. Sebbene questa tecnica rappresenta un grande vantaggio per l&#39;ottenimento di registrazioni mirate di neuroni di proiezione identificati, non sarà utile per distinguere interneuroni locali, come colorante sarebbe assorbito da tutti i tipi di cellule nel sito di iniezione. Teoricamente, l&#39;uso di più fluorofori con siti di iniezione può consentire questo metodo per essere espanso. Per esempio, il confronto di singolo-versus doppia etichettatura potrebbe essere utilizzata per distinguere interneuroni da neuroni di proiezione successivo alla doppia iniezioni in due punti del circuito 32. Allo stesso modo, traccianti retrogradi può essere combinato con altre tecniche di imaging avanzate, come ad esempio due fotoni di imaging, come è stato fatto recentemente in diamante mandarino Alta centro Vocal (HVC) 32. Inoltre, le regioni di registrazione sono limitate a quelle vicino alla superficie quando si usano microscopi epifluorescenza, come siamo stati solo in grado di risolvere 1 &amp;mu; strutture m entro i primi 30 micron di tessuto. Tuttavia, questa profondità potrebbe essere esteso mediante l&#39;uso di altre tecniche di microscopia, come la microscopia a due fotoni 33 o oggettiva-accoppiato planare illuminazione microscopia 34. Complessivamente, questa tecnica rappresenta un avanzamento importante nello studio dei circuiti neurali in vivo perché può essere utilizzato per registrare da singoli neuroni in molti circuiti diversi in una varietà di sistemi modello - compresi quelli che sono relativamente inaccessibile.

<table><tbody><tr><td>Metanosulfonato di tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Trietioduro di gallamina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8134</td><td>Flaxedil</td></tr><tr><td>Cloridrato di lidocaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di Ringer di Hickman&amp;rsquo;s </td><td>NA</td><td>NA</td><td>NaCl (6,48 g/l), KCl (0,15 g/l), CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (0,29 g/l), MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,12 g/l), NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0,084 g/l), NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,06 g/l)</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson o Rainin</td><td>Minipulse 3 Modello 312; RP-1</td><td>10,0 &amp;plusmn; 1,0 giri/min; in alternativa, una linea alimentata per gravità con un flussimetro</td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione </td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Colla istantanea</td><td>Super Glue Corporation</td><td>SGH2</td><td>tubo da 2 g</td></tr><tr><td>Omni Drill 35</td><td>World Precision Instruments</td><td>503-598</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trapano a sfera in carburo #1/4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860</td><td>0,19 DIA (diametro della punta = 0,48 mm) </td></tr><tr><td>Kit di cauterizzazione a bassa temperatura</td><td>World Precision Instruments</td><td>500391</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipolatore manuale</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Destrano coniugato con Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>D-22912</td><td>concentrazione 2 mM; peso molecolare 10.000; la scelta della lunghezza d'onda del colorante deve essere effettuata in base alle impostazioni del filtro del microscopio</td></tr><tr><td>Microscopio epifluorescente</td><td>Nikon</td><td>E600 FN</td><td>Un accessorio per fuoco remoto è utile per un fuoco preciso; filtro TRITC o filtro appropriato per allineare i piani focali per diverse lunghezze d'onda del colorante</td></tr><tr><td>Obiettivo a basso ingrandimento</td><td>Nikon</td><td>93182</td><td>Serie CFI Plan Achromat, 4X NA 0,1, WD 30 mm</td></tr><tr><td>Obiettivo ad alto ingrandimento</td><td>Nikon</td><td>93148</td><td>Serie CFI Fluor, 40X WI NA 0,8, WD 2,0 mm</td></tr><tr><td>Sorgente di luce bianca</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Modello 190</td><td>Illuminatore a fibra ottica</td></tr><tr><td>Sorgente di luce fluorescente </td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120Q</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Telecamera a bassa luminosità</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Manometro digitale</td><td>Omega Engineering</td><td>HHP-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipolatore motorizzato</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Testa amplificatrice (headstage)</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Stimolatore a impulsi isolato</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Impostazioni del programma per la nostra applicazione: Calore: rampa + 1, Trazione: &amp;rsquo;0&amp;rsquo;, Velocità: 60, Tempo: 90; filamento a scatola</td></tr><tr><td>Vetro per pipette</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Vetro capillare borosilicato con filamento (1 mm di diametro esterno, 0,58 mm di diametro interno) </td></tr></tbody></table>

retrograda etichettatura fluorescente consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; in vivo</em

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di registrare le risposte-unità singole da una popolazione di neuroni identificati. Nelle registrazioni elettrofisiologiche in vivo di singoli neuroni sono fondamentali per la comprensione di come i circuiti neurali funzionano in condizioni naturali. Tradizionalmente, queste registrazioni sono state effettuate &#39;cieco&#39;, intendendo l&#39;identità della cellula registrata è sconosciuto all&#39;inizio della registrazione. Identità cellulare può essere determinata successivamente via intracellulare 1, juxtacellular 2 o loose-patch 3 ionoforesi di colorante, ma queste registrazioni non può essere pre-mirati a specifici neuroni in regioni con tipi di cellule funzionalmente eterogenee. Proteine ​​fluorescenti possono essere espressi in modo specifico tipo cellulare permettendo visivamente a guida singola cellula elettrofisiologia 4-6. Tuttavia, ci sono molti sistemi modello per cui questi strumenti genetici non sono disponibili. Anche in sistemi modello geneticamente accessibili, il PRO desideratomoter può essere sconosciuto o neuroni geneticamente omogenee può avere diversi modelli di proiezione. Allo stesso modo, vettori virali sono stati utilizzati per etichettare specifici sottogruppi di neuroni di proiezione 7, ma l&#39;uso di questo metodo è limitato dalla tossicità e la mancanza di specificità trans-sinaptica. Pertanto, sono necessari ulteriori tecniche che offrono specifiche di pre-visualizzazione per registrare da singoli neuroni identificati in vivo. Pre-visualizzazione del neurone bersaglio è particolarmente utile per le difficili condizioni di registrazione, per cui le registrazioni monocellulari classici sono spesso proibitivo 8-11. La nuova tecnica descritta in questo articolo utilizza il trasporto retrogrado di un colorante fluorescente applicato utilizzando aghi di tungsteno per etichettare rapidamente e selettivamente uno specifico sottoinsieme di cellule all&#39;interno di una particolare regione del cervello in base alle loro uniche proiezioni assonali, fornendo in tal modo un segnale visivo per ottenere registrazioni elettrofisiologiche mirate dai neuroni identificati in un intatto circuito withina vertebrato CNS. Il romanzo progresso più significativo del nostro metodo è l&#39;uso di marcatori fluorescenti per indirizzare specifici tipi cellulari in un sistema modello accessibile non geneticamente. Pesci debolmente elettrici sono un sistema ottimo modello per lo studio di circuiti neurali in sveglio, comportandosi animali 12. Abbiamo utilizzato questa tecnica per studiare l&#39;elaborazione sensoriale da &quot;piccole celle&quot; nel nucleo exterolateral anteriore (ELA) di pesci debolmente elettrico mormyrid. &quot;Piccole celle&quot; sono ipotizzate per essere in tempo comparatore neuroni importanti per rilevare differenze submillisecond nei tempi di arrivo dei picchi presinaptici 13. Tuttavia, le caratteristiche anatomiche come mielina denso, sinapsi engulfing, e corpi cellulari piccoli hanno reso estremamente difficile per registrare da queste cellule con metodi tradizionali 11, 14. Qui mostriamo che il nostro nuovo metodo etichette selettivamente queste cellule nel 28% dei preparativi, consentendo affidabili, registrazioni e caratte robustirizzazione delle risposte a stimoli electrosensory.

Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati visivamente<em&gt; In vivo</em&gt;, Permettendo registrazione extracellulare da assoni identificati. Questa tecnica facilita la registrazione quando i neuroni non possono essere etichettati con la manipolazione genetica o sono difficili da isolare con &#39;cieco&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Approcci.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

L'obiettivo generale di questo metodo è registrare le risposte di singole unità da una popolazione identificata di neuroni. Le registrazioni elettrofisiologiche in vivo da...

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare le risposte di unità singole in vivo da una popolazione identificata di neuroni in un sistema modello non genetico. Questo viene ottenuto innanzitutto eseguendo una craniotomia per esporre la regione cerebrale di interesse. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare fili di tungsteno per depositare il colorante fluorescente nella regione a cui i neuroni bersaglio proiettano.Successivamente, il colorante viene trasportato in senso retrogrado, determinando un'etichettatura selettiva dei neuroni a proiezione. L'ultimo passaggio consiste nel registrare dall'assone etichettato del singolo neurone a proiezione. Infine, si utilizzano registrazioni extracellulari di unità singole per mostrare come i neuroni sensoriali centrali in un circuito integro rispondano alla stimolazione sensoriale in evo.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali su come i circuiti neurologici rilevino differenze di temporizzazione negli input sinaptici inferiori al millisecondo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la capacità di indirizzare singoli neuroni o persino assoni e sistemi non accessibili geneticamente. I pesci elettrici settimanali utilizzano segnali elettrici per la comunicazione e la navigazione.Distinguono i segnali provenienti da pesci diversi utilizzando differenze di pochi microsecondi nei tempi di arrivo degli input sinaptici. Ci siamo chiesti come i neuroni comparatori di tempo presumibilmente presenti nel loro circuito elettrosensoriale riescano a rilevare differenze temporali così ridotte. Tuttavia, questa tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi, come le vie sensoriali visive e uditive.È particolarmente difficile ottenere liquido da queste cellule a causa delle piccole dimensioni, del fitto intreccio nei tessuti circostanti e dei terminali presinaptici che ricoprono gran parte del corpo cellulare. L'iniezione intracellulare di colorante durante una registrazione in modalità whole cell permette di etichettare singolarmente una cellula per guidare registrazioni mirate dal suo assone. Analogamente, il trasporto retrogrado successivo all'iniezione extracellulare di colorante fornisce un mezzo per etichettare selettivamente i neuroni a proiezione nelle regioni superficiali del cervello.Questo può essere utilizzato per fornire un orientamento visivo per le registrazioni in vivo di singole unità. Per preparare l'ago codificato con D, affilare elettroliticamente la sera prima dell'esperimento un filo di tungsteno del diametro di 160 micrometri fino a ottenere un diametro finale della punta dell'ago compreso tra cinque e 50 micrometri. Successivamente, codificare la punta dell'ago con una soluzione di due millimoli di colorante Alexa floor coniugato alla destrana di peso molecolare 10.000 per indurre l'anestesia generale.Posizionare il pesce nell'acqua della vasca con soluzione MS 222 a 300 milligrammi per litro per immobilizzare e silenziare elettricamente il pesce mediante iniezione di 100 microlitri di flail a tre milligrammi per millilitro nel muscolo dorsale del corpo. Successivamente, riempire la camera di registrazione con acqua della vasca e posizionare il pesce con il lato ventrale rivolto verso il basso sulla piattaforma al centro della camera. Quindi erogare la soluzione MS 222 aerata a 100 milligrammi per litro a una velocità di uno-due millilitri al minuto inserendo la punta di una pipetta nella sua bocca.Successivamente, stabilizzare il pesce con aste fisse e cera su entrambi i lati del corpo. Monitorare lo stato di salute del pesce verificando il flusso sanguigno continuo nei vasi oculari e un colore normale del corpo. Quindi ruotare la piattaforma lungo l'asse verticale.Regolare un'estremità della piattaforma in modo che un lato della superficie dorsale della testa del pesce sia esposto al di sopra dell'acqua, mentre il resto del corpo del pesce rimane immerso. Posizionare un piccolo pezzo di salvietta Kim sulle parti della pelle non immerse per prevenire l'essiccamento. In questo procedimento, applicare lidocaina allo 0,4% sulla superficie esposta della testa utilizzando un bastoncino cotonato.Quindi utilizzare una lama di bisturi per tagliare un pezzo di tessuto cutaneo di forma rettangolare di circa tre millimetri per cinque millimetri per un pesce di 6,2 centimetri. Il margine laterale del rettangolo deve essere allineato con il centro dell'occhio. Il margine anteriore del rettangolo deve trovarsi appena posteriormente all'occhio, e il margine mediale del rettangolo deve trovarsi appena lateralmente alla linea mediana.Successivamente, rimuovere il rettangolo utilizzando una pinzetta. Tagliare un ulteriore quadrato di 2,5 millimetri nella regione anteriore per esporre il cranio. Rimuovere completamente qualsiasi tessuto in eccesso dalla superficie esposta del cranio, raschiandolo via con la lama del bisturi.Quindi asciugare completamente la superficie con un fazzoletto Kim e aria forzata. Successivamente, incollare un perno metallico alla regione anteriore mediale del cranio esposta utilizzando colla cianoacrilica. Attendere finché la colla non sarà completamente asciutta.Utilizzare un trapano dentale con una punta in carburo a sfera del diametro di 0,5 millimetri per tracciare un rettangolo di circa due millimetri per quattro millimetri sul cranio di un pesce lungo 6,2 centimetri. Successivamente, tagliare il perimetro del rettangolo con bisturi e pinzette. Quindi staccare il cranio.Per esporre il cervello, tagliare sia la dura madre pigmentata sia la pia madre trasparente utilizzando un paio di forbici a molla o un ago. Quindi rimuovere le porzioni tagliate con un paio di pinzette per esporre il nucleo laterale esterno anteriore e il nucleo laterale esterno posteriore. Posizionare ora un manipolatore con un ago rivestito di D preparato in precedenza sopra la regione bersaglio contenente gli assoni di interesse.Nel nostro caso, il nucleo posteriore laterale esterno inserisce rapidamente l'ago di circa 25 micrometri nel tessuto. Dopo che il colorante si è diffuso per 15-30 secondi, ritirare l'ago. Ripetere l'operazione con aghi freschi aggiuntivi secondo necessità.Posizionarne ciascuno in un punto diverso in modo che il colorante si distribuisca in tutta la regione bersaglio. Risciacquare quindi il colorante in eccesso dalla cavità con soluzione di Ringer di Hickman e attendere almeno due ore per il ripristino e il trasporto del colorante. Per visualizzare gli assoni di interesse, posizionare la camera di registrazione con il pesce al di sotto dell'obiettivo di un microscopio epi a fluorescenza con piatto fisso verticale.Passare alla soluzione di respirazione con acqua fresca del serbatoio e mantenere lo stesso flusso. Quindi inserire un'estremità del filo di massa nella cavità cerebrale esposta e collegare l'altra estremità alla messa a terra dello stadio della testa di registrazione. Successivamente, posizionare una coppia di elettrodi di registrazione accanto alla base della coda.Quindi collegare gli elettrodi a un amplificatore differenziale e a un dispositivo di registrazione. Per monitorare il comando di scarica dell'organo elettrico (EODC), preparare un disegno in scala della regione cerebrale osservata a basso ingrandimento, includendo i principali vasi sanguigni come punti di riferimento per identificare la posizione esatta degli assoni marcati. Per confermare prima la posizione di D, osservare l'intero tessuto con illuminazione in campo chiaro per l'orientamento.Quindi osservatelo con illuminazione fluorescente. Il nucleo laterale posteriore dovrebbe mostrare una marcatura diffusa. Successivamente, a ingrandimento elevato, localizzate il nucleo laterale anteriore utilizzando i vasi come punti di riferimento.Illuminalo con luce fluorescente mentre cerchi un assone marcato in prossimit&agrave; della superficie, utilizzando un capillare di vetro in borosilicato con un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,58 millimetri, dotato di filamento. Tira un elettrodo di registrazione con un gambo stretto lungo cinque millimetri e un diametro della punta compreso tra uno e 2,4 micrometri.Riempire l'elettrodo con soluzione di Ringer di Hickman filtrata. La resistenza finale della punta deve essere compresa tra 16 e 155 megaohm. Posizionare l'elettrodo in un supporto per elettrodi dotato di un attacco per la pressione.Collegarlo alla testa montata su un manipolatore. Successivamente, collegare la testa a un amplificatore. Un dispositivo di acquisizione da analogico a digitale, non mostrato, collega l'amplificatore al computer.In seguito, applicare una pressione positiva di 30 millibar alla linea dell'elettrodo. Avanzare lentamente l'elettrodo verso l'assone dalla superficie del tessuto. Quando l'elettrodo si avvicina all'assone, la pressione positiva dovrebbe provocare un lieve ma percettibile movimento dell'assone mentre l'elettrodo si trova accanto ad esso.Registrare l'attività durante la presentazione degli stimoli di prova. Sebbene un artefatto elettrico confermi una corretta registrazione e stimolazione, non dovrebbero essere presenti potenziali d'azione. Rilasciare la pressione esterna sull'elettrodo e ripetere la stimolazione e la registrazione.Quindi applicare una leggera aspirazione in modo che l'assone entri nell'elettrodo. Ripetere la stimolazione e la registrazione. A questo punto si dovrebbero osservare alcuni potenziali d'azione in risposta alle stimolazioni.Una volta che i potenziali d'azione sono visibili, chiudere la linea di pressione. Quando tutte le registrazioni desiderate sono completate, riportare l'acqua del serbatoio alla soluzione di respirazione con MS 2 22 a cento milligrammi per litro per assicurare un'anestesia completa del pesce. Nessun EODC dovrebbe essere rilevato per almeno 10 minuti prima di eutanasizzare il pesce.Ecco cinque tracce campione che mostrano i potenziali d'azione evocati da uno stimolo quadrato trasversale monofasico contralaterale positivo di 0,1 millisecondi e sei millivolt per centimetro, e qui è riportato un grafico a rastrello che mostra i tempi degli impulsi durante 20 ripetizioni di una finestra di registrazione di 75 millisecondi per la stessa unità stimolata all'istante zero con stimoli di sei millivolt per centimetro. L'intervallo delle durate è indicato a destra. Qui viene mostrata una curva di sintonizzazione della durata dello stimolo che quantifica le risposte in termini di impulsi per ripetizione dello stimolo.Una volta padroneggiata, l'intervento chirurgico e l'iniezione del colorante mostrati in questa tecnica possono essere eseguiti in un'ora se effettuati correttamente, e le registrazioni possono iniziare da due a tre ore dopo l'iniezione del colorante. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare attentamente lo stato di salute dell'animale sperimentale dopo il trattamento. Altri metodi, come l'immagine a due fotoni, possono essere eseguiti al fine di registrare l'attività di neuroni situati in strutture cerebrali ancora più profonde.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e registrare le risposte di unità singole da una popolazione identificata di neuroni.

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Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati In vivo (Video) | JoVE Journal

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