Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati In vivo
June 26th, 2013
Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati visivamente In vivo, Permettendo registrazione extracellulare da assoni identificati. Questa tecnica facilita la registrazione quando i neuroni non possono essere etichettati con la manipolazione genetica o sono difficili da isolare con 'cieco' In vivo Approcci.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare le risposte di singole unità in vivo da una popolazione identificata di neuroni in un sistema modello non genetico. Ciò si ottiene eseguendo prima una craniotomia per esporre la regione cerebrale di interesse. Il secondo passo consiste nell'utilizzare fili di tungsteno per posizionare il colorante fluorescente nella regione in cui proiettano i neuroni bersaglio.
Successivamente, il colorante viene trasportato retrogrado, con conseguente marcatura selettiva dei neuroni di proiezione. Il passaggio finale consiste nel registrare dall'assone marcato del singolo neurone di proiezione. In definitiva, le registrazioni extracellulari di singole unità vengono utilizzate per mostrare come i neuroni sensoriali centrali in un circuito intatto rispondono alla stimolazione sensoriale in evo.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come i circuiti neurologici rilevano differenze inferiori al millisecondo nella tempistica degli input sinaptici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la capacità di colpire singoli neuroni o anche assoni e sistemi non geneticamente accessibili. I pesci elettrici settimanali utilizzano segnali elettrici per la comunicazione e la navigazione.
Distinguono i segnali provenienti da pesci diversi utilizzando differenze inferiori al millisecondo nella temporizzazione degli input sinaptici. Abbiamo chiesto come i presunti neuroni di confronto del tempo nel loro circuito elettrosensoriale siano in grado di rilevare differenze di tempo così piccole. Ma questa tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi come i percorsi sensoriali visivi e uditivi.
È particolarmente difficile liquidare da queste cellule a causa delle piccole dimensioni e del denso miring nel tessuto circostante e dei terminali presinaptici che coprono la maggior parte del ventre cellulare Iniezione di colorante intracellulare durante una registrazione dell'intera cellula. In vitro etichetta una singola cellula per guidare registrazioni mirate da quell'assone. Allo stesso modo, il trasporto retrogrado dopo l'iniezione di colorante extracellulare fornisce un mezzo per etichettare selettivamente i neuroni di proiezione nelle regioni superficiali del cervello.
Questo può essere utilizzato per fornire una guida visiva per le registrazioni in vivo di singole unità. Per preparare l'ago con codifica D, affilare prima elettroliticamente un filo di tungsteno di 160 micrometri di diametro fino al diametro finale della punta dell'ago da cinque a 50 micrometri. Quindi, la notte prima dell'esperimento, codificare la punta dell'ago con una soluzione di due millimolari di destrano coniugato con 10.000 pesi molecolari di colorante per pavimenti Alexa per indurre l'anestesia generale.
Mettere il pesce in acqua della vasca con la soluzione MS 2 22 a 300 milligrammi per litro, immobilizzare e silenziare elettricamente il pesce iniettando 100 microlitri di flagello a tre milligrammi per millilitro nella muscolatura dorsale del corpo. Quindi, riempi la camera di registrazione con l'acqua del serbatoio e posiziona il pesce con il lato ventrale rivolto verso il basso sulla piattaforma al centro della camera. Quindi erogare la soluzione aerata MS 2 22 a 100 milligrammi per litro in uno o due millilitri al minuto inserendo un puntale di pipetta nella sua bocca.
Successivamente, stabilizzare il pesce con canne fisse e cera su entrambi i lati del corpo. Monitorare le condizioni di salute del pesce controllando il flusso sanguigno continuo nei vasi oculari e un colore corporeo normale. Quindi ruotare la piattaforma lungo l'asse verticale.
Regolare un'estremità della piattaforma in modo che un lato della superficie dorsale della testa del pesce sia esposto sopra l'acqua mentre il resto del corpo del pesce rimane sommerso. Metti un pezzetto di salvietta Kim su qualsiasi parte non sommersa della pelle per evitare che si secchi. In questa procedura, applicare lo 0,4% di lidocaina sulla superficie esposta della testa utilizzando un cotton fioc.
Quindi usa una lama di bisturi per tagliare un pezzo rettangolare di tessuto cutaneo di circa tre millimetri per cinque millimetri per un pesce di 6,2 centimetri. Il bordo laterale del rettangolo dovrebbe essere allineato con il centro dell'occhio. Il bordo anteriore del rettangolo dovrebbe essere appena posteriore all'occhio e il bordo mediale del rettangolo dovrebbe essere appena laterale alla linea mediana.
Successivamente, rimuovere il rettangolo utilizzando un paio di pinze. Tagliare un ulteriore mely quadrato anteriore di 2,5 millimetri per esporre il cranio. Pulisci completamente la superficie esposta del cranio raschiando via il tessuto in eccesso usando la lama del bisturi.
Quindi asciugare completamente la superficie con una salvietta Kim e aria forzata. Quindi, incolla un perno di metallo alla regione anteriore mediale esposta del cranio con la super colla. Attendere che la colla sia completamente asciutta.
Usa un trapano dentale con una punta in metallo duro a sfere di 0,5 millimetri di diametro per disegnare un rettangolo di circa due millimetri per quattro millimetri sul cranio per un pesce di 6,2 centimetri. Successivamente, taglia il perimetro del rettangolo con il bisturi e la pinza. Quindi staccare il cranio.
Per esporre il cervello, taglia sia la dura madre pigmentata che la pia madre trasparente usando un paio di forbici a molla o un ago. Quindi rimuovere le parti tagliate con un paio di pinze per esporre il nucleo extra laterale anteriore e il nucleo extra laterale posteriore. Ora posiziona un manipolatore con un ago rivestito in D preparato in precedenza sopra la regione target contenente gli assoni di interesse.
Il nucleo extra laterale posteriore nel nostro caso inserisce rapidamente l'ago a circa 25 micrometri nel tessuto. Dopo che il colorante si è diffuso per 15-30 secondi, ritrarre l'ago. Ripetere con altri aghi freschi se necessario.
Posiziona ciascuno di essi in una posizione diversa in modo che il colorante sia distribuito in tutta la regione di destinazione. Quindi sciacquare il colorante in eccesso dalla cavità con la soluzione di hickman's ringer e attendere almeno due ore per l'assorbimento e il trasporto del colorante. Per visualizzare gli assoni di interesse, posizionare la camera di registrazione con il pesce sotto l'obiettivo di un microscopio a epifluorescenza verticale a tavolino fisso.
Passare la soluzione di respirazione all'acqua fresca del serbatoio e mantenere la stessa portata. Quindi posizionare un'estremità del filo di terra nella cavità cerebrale esposta e collegare l'altra estremità alla massa dello stadio della testina di registrazione. Quindi, posiziona un paio di elettrodi di registrazione accanto alla base della coda.
Quindi collegare gli elettrodi a un amplificatore differenziale e a un dispositivo di registrazione. Al fine di monitorare il comando di scarica dell'organo elettrico o EODC, preparare uno schizzo in scala della regione del cervello vista a basso ingrandimento, compresi i principali vasi sanguigni come punti di riferimento per identificare la posizione esatta degli assoni etichettati. Per confermare prima il posizionamento D, visualizzare l'intero tessuto con l'illuminazione a campo chiaro per l'orientamento.
Quindi guardalo con l'illuminazione fluorescente. Il nucleo extralaterale posteriore dovrebbe mostrare una marcatura diffusa. Dopodiché, ad alto ingrandimento, individuare il nucleo extralaterale anteriore con i vasi come punti di riferimento.
Illuminalo con luce fluorescente mentre cerchi un assone marcato vicino alla superficie, utilizzando un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,58 millimetri. Vetro capillare in silicato Bo con filamento. Estrarre un elettrodo di registrazione con un gambo stretto lungo cinque millimetri e un diametro della punta compreso tra circa uno e 2,4 micrometri.
Riempire l'elettrodo con una soluzione filtrata di hickman's ringer. La resistenza finale della punta dovrebbe essere compresa tra 16 e 155 mega ohm. Posizionare l'elettrodo in un portaelettrodo con una porta di pressione.
Collegarlo allo stadio di testa montato su un manipolatore. Quindi collegare lo stadio principale a un amplificatore. Un dispositivo di acquisizione da analogico a digitale non mostrato collega l'amplificatore al computer.
Successivamente, applicare una pressione positiva di 30 millibar alla linea dell'elettrodo. Far avanzare lentamente l'elettrodo verso l'assone dalla superficie del tessuto. Poiché l'elettrodo è vicino all'assone, la pressione positiva dovrebbe causare un movimento leggero ma evidente dell'assone mentre l'elettrodo è vicino all'assone.
Registra l'attività durante la presentazione degli stimoli del test. Sebbene un artefatto elettrico confermi la corretta registrazione e stimolazione, non dovrebbero esserci potenziali d'azione. Rilasciare la pressione verso l'esterno nell'elettrodo e ripetere la stimolazione e la registrazione.
Quindi applicare una leggera aspirazione facendo muovere l'assone nell'elettrodo. Ripetere nuovamente la stimolazione e la registrazione. Ora dovreste vedere alcuni potenziali d'azione in risposta alle stimolazioni.
Una volta che i potenziali d'azione sono visibili, chiudere la linea di pressione. Quando tutte le registrazioni desiderate sono complete, riportare l'acqua della vasca nella soluzione di respirazione con MS 2 22 a cento milligrammi per litro per garantire che il pesce sia completamente anestetizzato. Nessun EODC deve essere rilevato per almeno 10 minuti prima dell'eutanasia del pesce.
Qui ci sono cinque tracce di esempio che mostrano i potenziali d'azione evocati da uno stimolo di impulso quadrato trasversale positivo controlaterale monofasico di 0,1 millisecondi per centimetro, e qui c'è un grafico raster che mostra i tempi di picco durante 20 ripetizioni di una finestra di registrazione di 75 millisecondi per la stessa unità stimolata a volte zero con stimoli di sei millivolt per centimetro. L'intervallo di durate è elencato a destra. Qui è mostrata una curva di regolazione della durata dello stimolo che quantifica le risposte come picchi per ripetizione dello stimolo.
Una volta padroneggiati, l'intervento chirurgico e l'iniezione di colorante mostrati in questa tecnica possono essere eseguiti in un'ora se eseguiti correttamente e le registrazioni possono essere avviate due o tre ore dopo l'iniezione di colorante. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare attentamente la salute dell'animale da esperimento Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'imaging a due fotoni, possono essere eseguiti per registrare dai neuroni in strutture cerebrali ancora più profonde.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare e registrare le risposte di singole unità da una popolazione identificata di neuroni.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per registrare risposte di unità singole da neuroni identificati in vivo utilizzando il trasporto retrogrado di colorante fluorescente. Questa tecnica permette la marcatura selettiva di neuroni di proiezione, facilitando registrazioni extracellulari mirate in sistemi modello non genetici.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Eletrofisiologia
- Circuiti neuronali
Background
- La registrazione da neuroni specifici è cruciale per comprendere i circuiti neurali.
- I metodi tradizionali potrebbero non marcare efficacemente i neuroni in sistemi non genetici.
- Il colorante fluorescente può essere utilizzato per marcare i neuroni in base alle loro proiezioni anatomiche.
- Questo approccio è particolarmente utile per studiare i neuroni sensoriali nei pesci elettrici.
Scopo dello studio
- Sviluppare una tecnica per la registrazione in vivo da neuroni identificati.
- Investigare come i neuroni sensoriali rispondono agli stimoli.
- Migliorare la capacità di prendere di mira singoli neuroni in tessuti complessi.
Metodi utilizzati
- Craniotomia per esporre la regione cerebrale di interesse.
- Iniezione di colorante fluorescente nelle aree target per marcare i neuroni di proiezione.
- Utilizzo di fili di tungsteno per un posizionamento preciso del colorante.
- Registrazione extracellulare da assoni marcati per valutare le risposte neuronali.
Risultati principali
- Marcatura riuscita di neuroni di proiezione utilizzando il trasporto retrogrado del colorante.
- Capacità di registrare risposte di unità singole da neuroni identificati.
- Dimostrazione dell'applicabilità della tecnica allo studio delle differenze di temporizzazione nei circuiti sensoriali.
- Fornitura di guida visiva per registrazioni mirate in vivo.
Conclusioni
- Il metodo permette registrazioni mirate da neuroni specifici in sistemi non genetici.
- Questo approccio può essere applicato a varie vie sensoriali oltre ai pesci elettrici.
- Offre un significativo vantaggio rispetto ai metodi tradizionali in ambienti di tessuto complesso.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables targeted single-unit recordings from identified neurons in non-genetic model systems, addressing a key challenge in neuroscience research where genetic tools are unavailable. By using retrograde fluorescent labeling based on axonal projections, researchers can pre-visualize and selectively record from specific neuronal populations, improving the reliability and interpretability of electrophysiological data. This capability supports mechanistic de-risking in target validation by linking neuronal identity to function in intact circuits, which is valuable for preclinical neuroscience and translational biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking neuronal identity to electrophysiological function in vivo.
- Operational Value: Provides a visual cue for targeted recordings, reducing blind sampling and increasing data quality in heterogeneous tissues.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking by confirming that recorded signals originate from anatomically defined projection neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates a standardized, reproducible system for preparing labeled neurons for downstream electrophysiological assessment.
- Quantitative Output: Enables measurement of single-unit responses to sensory stimuli, providing actionable data for compound screening.
- Platform Reuse: The retrograde labeling approach can be adapted across brain regions and model systems, supporting scalable use in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to sensory processing circuits, offering insight into neural mechanisms of stimulus detection and timing discrimination.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling consistent identification of neuronal targets across experimental sessions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces false positives in target validation by ensuring recordings are obtained from the intended neuronal population.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven interrogation of neural circuits before moving to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing researchers to record from neurons defined by their projection patterns, clarifying functional roles in sensory processing.
- Screening: Generates reproducible, quantifiable electrophysiological readouts that can be used to assess neuronal responses under controlled conditions.
- Analytics: Produces spike timing and duration tuning curves that enable quantitative comparison of neuronal responses across stimuli or conditions.
- Translational Research: Supports continuity from circuit-level discovery to preclinical models by providing a reliable method to identify and re-target specific neurons.
- Enterprise Reuse: The core technique of retrograde dye labeling is adaptable to various brain regions and species, making it a reusable capability across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through anatomically precise targeting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of single-unit recordings via pre-visualization of target neurons.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in early discovery by increasing the likelihood that observed phenotypes are linked to the intended neuronal target.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated neuronal identity and function in intact circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microsurgery, and in vivo electrophysiology.
- Depends on access to fluorescence microscopy, micromanipulators, and extracellular recording equipment.
- Necessitates standardization of dye injection parameters and transport times across users and labs.
- Must account for variability in axonal projection patterns when applying the method to new model systems or brain regions.
- Practical limitations include dependence on successful retrograde transport, which may vary by tissue health and dye properties.
