Miscelatori per lo studio microfluidici Protein Folding

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mescolare rapidamente due soluzioni per avviare una reazione biochimica su scala temporale di microsecondi. Ciò si ottiene fabbricando prima un miscelatore microfluidico. Il secondo passaggio consiste nell'incollare un chip a un vetro di copertura per sigillare i canali.

Successivamente, il chip viene montato su un collettore che contiene i serbatoi della soluzione. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare la soluzione miscelata utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale. In definitiva, la reazione biochimica viene catturata su una scala temporale di microsecondi convertendo la distanza lungo il canale di uscita in tempo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la miscelazione stop flow, è che la miscelazione non è limitata dalla turbolenza e avviene in pochi microsecondi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ripiegamento delle proteine, ad esempio quando si verifica un collasso idrofobico? A dimostrare la procedura sarà ling woo, un postdoc per il mio laboratorio per iniziare la fabbricazione di chip di miscelazione microfluidica.

Per prima cosa pulire i wafer di silice FU da quattro pollici con una soluzione di piranha fresca come descritto nel protocollo scritto che accompagna questo video. Successivamente, utilizzare un forno per la deposizione chimica da vapore a bassa pressione per applicare un rivestimento in polisilicio di circa un micron di spessore per ogni 10 micron di profondità prevista dei canali microfluidici finali. Dopo un ulteriore trattamento dei wafer, come descritto nel testo, rivestire i wafer con uno strato di 900 nanometri di spessore di una Z 52 14 photo Resist, quindi cuocere delicatamente a 90 gradi Celsius direttamente su una piastra calda per un minuto o in forno a 110 gradi Celsius per 30 minuti.

Dopo aver allineato una maschera fotografica, stabilire un contatto duro e sottovuoto esponendo prima il fotoresist alla luce UV per diversi secondi. Quindi sviluppare il modello nel fotoresist come elencato nel protocollo scritto. Ispezionare le caratteristiche del wafer con un microscopio e cuocere a 115 gradi Celsius direttamente su una piastra calda per due minuti.

Successivamente, DCU i wafer con Asher o plasma di ossigeno per 2,5 minuti a 100 watt di potenza RF. Utilizzando un incisore ionico reattivo profondo, incidere lo strato di polisilice fino alla silice fusa sottostante. Spoglia la foto rimanente, resisti e tratta il wafer come indicato nel testo.

Misurare la profondità dell'incisione per assicurarsi che sia completamente attraversata dal rivestimento in polietilene. Utilizzando un incisore ionico reattivo profondo in grado di ossido, incidere silice fusa a una profondità di circa 10 micron per micron di spessore del rivestimento in polietilene. Pulire il wafer con la matrice Asher per quattro minuti, una potenza RF di 100 watt, e rimuovere il polisilicio con un incisore al fluoruro di xeno prima di praticare fori nel rivestimento di rotazione del wafer con un nuovo strato di un micron di fotoresist per proteggere i canali durante la successiva manipolazione.

Quindi montare la funzione wafer con il lato rivolto verso il basso su una lastra di vetro sacrificale utilizzando Aqua Bond 55. Avendo cura di mantenere il bonder privo di bolle, raffreddatore, trapano a punta diamantata controllato da computer con soluzione detergente micro 90. In questo modo si evita che piccoli pezzi di vetro si attacchino ai canali, che poi intasano il chip durante l'uso.

Procedere con la pratica, l'ingresso e l'uscita dei fori in ogni chip. Sciacquare il wafer con acqua deionizzata usando una siringa per iniettare acqua in ogni foro. Quindi immergere in acqua saponata per un'ora dopo la rimozione della foto.

Resist e bonder come descritto nel testo. Sciacquare il wafer con acqua deionizzata e acqua tiepida e sapone. Sciacquare nuovamente ogni foro con una siringa, evitando le caratteristiche incise dopo aver fatto scorrere l'azoto sul wafer.

Continuare ad asciugare in forno sottovuoto impostato a 120 gradi Celsius. Ispeziona i fori per assicurarti che siano privi di sabbia e ripeti i passaggi di pulizia se necessario. I seguenti passaggi devono essere eseguiti nella camera bianca.

Misura la profondità dei canali con un profilatore di superficie ottico o meccanico. Pulire il wafer e un fusibile in silice Coprire il vetro come descritto nel testo in una camera bianca. Asciugare accuratamente il wafer con azoto gassoso per almeno cinque minuti.

Quindi posizionare la funzione wafer con il lato rivolto verso l'alto sopra una pila di tre o quattro salviette per camera bianca posizionate sopra una superficie piana dura come una piccola lastra di vetro. Ripetere con il vetro di copertura. Sollevare il vetro di copertura per il bordo e capovolgerlo in modo che il lato lucido sia tenuto rivolto verso il basso sopra il wafer.

Allineare con cautela i bordi piatti, far cadere il vetro di copertura sul wafer e lasciarlo depositare orizzontalmente solo per regolare l'allineamento. Spingere verso il basso con un dito al centro del wafer. Si dovrebbe vedere un fronte di incollaggio che inizia a irradiarsi verso l'esterno.

Se necessario, applicare una pressione aggiuntiva in altre posizioni attorno al wafer per far avanzare la parte anteriore di incollaggio. Dopo aver posizionato i wafer sigillati in un forno ad alta temperatura programmato con il profilo di temperatura elencato nel testo, tagliare il wafer con una sega per cubetti in singole patatine. Il collettore per contenere il chip di miscelazione e le soluzioni può essere realizzato in materiale plastico come lexan o plexiglass, oppure in alluminio.

Per il controllo della temperatura, collegare il chip al collettore con piccoli o-ring e tenerlo in posizione con un anello di ritegno che consente una chiara visione ottica del centro del chip. Le scanalature dell'O-ring devono essere meno profonde dello standard per garantire un buon accoppiamento senza applicare troppa pressione al chip. Una volta montato il chip, aggiungere le soluzioni ai serbatoi centrale e laterale, avendo cura di rilasciare eventuali bolle intrappolate sul fondo dei pozzetti.

Posizionare il collettore su un microscopio invertito ed esaminare la regione di miscelazione con l'oculare o l'uscita della fotocamera. Una torcia a incandescenza posizionata sopra il collettore fornirà luce sufficiente. Utilizzare un colorante o una soluzione ad alto indice di rifrazione nel canale centrale per visualizzare il getto.

Poiché i volumi utilizzati in questo miscelatore sono così piccoli, il flusso può essere controllato con la pressione dell'aria applicata sopra i pozzetti della soluzione. Per visualizzare il getto, iniziare con la pressione del canale laterale a zero libbre per pollice quadrato e aumentare lentamente fino a raggiungere la stessa pressione con il canale centrale. Se un canale laterale è ostruito, il getto verrà spinto contro una delle pareti del canale di uscita.

Se appare un intasamento visibile, può essere rimosso applicando pressione o vuoto al canale di uscita con una siringa. Se le proteine o altro materiale organico ostruiscono il chip, può essere pulito immergendolo e utilizzando una soluzione di piranha durante la notte. Inserire un raggio laser rivestito in un microscopio per la ricerca utilizzando uno specchio dicroico all'interno o all'esterno del microscopio.

Allineare il laser in modo che la messa a fuoco possa essere vista nell'oculare o nella fotocamera un po' vicino alla regione di miscelazione. La fluorescenza della proteina nel miscelatore viene raccolta dall'obiettivo e inviata attraverso lo specchio dicroico focalizzato da una lente a un foro stenopeico e riprodotta su un contatore di fotoni. Scansiona il chip utilizzando uno scanner elettrico pizo in x e y per visualizzare la regione di miscelazione.

Scegliere una posizione sul getto ed eseguire la scansione in X e Y per trovare la messa a fuoco al centro del canale verticalmente. La profondità di campo del microscopio è molto inferiore alla profondità del canale e la portata è uniforme nel canale tranne che entro un micron dalle pareti. Pertanto, la risoluzione temporale della fluorescenza osservata è determinata principalmente dalla dimensione del punto confocale.

Scansiona orizzontalmente all'interno del canale di uscita con incrementi di 100 micron lungo il getto osservando per circa un millisecondo per posizione. Spostare il tavolino del microscopio di 80-90 micron lungo il getto per catturare i tempi successivi. In alternativa, la luce può essere rilevata da uno spettrografo e da un CCD dopo lo specchio dicroico utilizzando una lente per focalizzare la luce sulla fessura d'ingresso.

Poiché la raccolta dei dati è più lenta rispetto al contatore di fotoni, in genere il getto viene ripreso prima con il contatore di fotoni e poi i punti lungo il getto vengono misurati con lo spettrografo. I dati del contatore di fotoni vengono analizzati sommando da tre a cinque pixel attorno al getto in ogni posizione per creare un grafico dell'intensità rispetto alla distanza. Il tempo viene calcolato dalla distanza utilizzando una velocità calcolata in base alle pressioni applicate.

Come passaggio finale, analizzare i dati dello spettrografo utilizzando uno dei metodi descritti nel testo. Qui è mostrato un grafico di contorno dell'intensità nella regione di miscelazione misurata dal contatore di fotoni. Il fondo nel canale di uscita all'esterno del getto deve essere vicino al rumore di fondo del rivelatore e in genere non viene sottratto.

Uno sfondo più alto può indicare uno scarso allineamento o che la proteina si sta attaccando alle pareti del canale. Al contrario, un getto che sembra attorcigliato o storto, soprattutto vicino alla regione di miscelazione, indica una scarsa incisione degli ugelli. Uno spettro risolto nel tempo è mostrato dalla proteina ACell, coenzima A, una proteina legante o A CBP marcato con Alexa 4, 88 e Alexa 6, 47.

I rettangoli verde e rosso mostrano le lunghezze d'onda designate rispettivamente come canali donatori e accettati. Questi dati sono stati sottratti in background per rimuovere la carica oscura e il segnale laser. Il segnale di fondo è stato preso con la pressione del canale centrale, ad esempio zero libbre per pollice quadrato.

Il tempo di miscelazione può essere misurato misurando una reazione rapida molto più veloce della miscelazione, come l'estinzione in fluorescenza del triptofano mediante ioduro di potassio. Poiché il getto è più piccolo della risoluzione ottica del microscopio, c'è un grande calo di intensità nella regione di miscelazione. Man mano che il getto si forma, questa risposta dello strumento può essere rimossa effettuando una misurazione di controllo in cui non cambiano le condizioni della soluzione.

In questa figura è mostrato il rapporto tra gli esperimenti di miscelazione e non miscelazione della fluorescenza dell'ammide N-acetil triptofano. La linea mostra la concentrazione prevista di ioduro di potassio dalla modellazione e dalle simulazioni multifisiche della console. Il tempo di miscelazione, misurato nel tempo necessario per la diminuzione della concentrazione dell'80%, è di otto microsecondi.

Questo grafico mostra le variazioni di fret nella proteina A CBP dopo la diluizione della denatura da sei molari a 0,06 molari. Questi dati non necessitano di un esperimento di controllo. Poiché il tasto è già un rapporto e la risposta dello strumento è già rimossa, il salto rapido vicino a T uguale a zero rappresenta un rapido cambiamento nel segnale del tasto entro il tempo di miscelazione.

Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del ripiegamento delle proteine per esplorare le prime fasi della formazione della struttura proteica.