Name: Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Impara a monitorare cellule e tessuti senza contatto mediante spettroscopia Raman. Questa tecnica laser label-free consente l'analisi biochimica in tempo reale per applicazioni in ingegneria tissutale e diagnostica clinica.

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Ringraziamo Steffen Koch per il suo supporto tecnico e Shannon Lee Layland (sia IGB Fraunhofer di Stoccarda) per i suoi utili suggerimenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Attrarre programma del Fraunhofer-Gesellschaft e la BMBF (sia per KS-L.).

1. Preparazione del campione biologico <ol><li> Preparazione delle cellule viventi <ol><li> Preparazione delle cellule aderenti <ol><li> Seme in cellule coltivate in vitro, o isolate di fresco su un piatto di vetro inferiore (Greiner BioOne / Germania) e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 fino attaccamento cellulare è completata. </li><li> Togliere terreno di coltura e lavare delicatamente tre volte con PBS misura preventiva. Conservare le cellule coperti sia con PBS o terreno di coltura cellulare durante tutta la procedura di misura. </li></ol></li><li> Preparazione delle cellule in sospensione <ol><li> Staccare in vitro-colture di cellule in base a protocolli comuni (ad esempio, tripsina-EDTA, scraping cella), centrifugare le cellule e risospendere il pellet cellulare ottenuta in PBS o terreno di coltura cellulare. </li><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare (concentrazione: massimo 100.000 cellule / ml) ad un piatto fondo di vetro. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione di native tessuti <ol><li> Dopo la raccolta i tessuti, trasferirli sterile, ghiacciato PBS e tenerli non più di 12 ore a 4 ° C oppure attraverso una misurazione ghiaccio prima. Esperimenti precedenti hanno dimostrato che un tempo prolungato stoccaggio (tempo di ischemia fredda&gt; 12 ore a 4 ° C) determinato cambiamenti spettrali dovute a processi di degradazione naturali. </li><li> Le misurazioni devono essere effettuate con il tessuto rivestito in PBS o mezzo per evitare danneggiamenti delle proteine ​​ECM e le cellule a causa di asciugatura del tessuto. </li></ol></li></ol> 2. Spettrometro Raman Il nostro spettrometro Raman personalizzata combina un microscopio a fluorescenza standard (Olympus IX 71), con uno spettrometro Raman che permette il confronto diretto delle immagini in campo chiaro e fluorescenza con gli spettri Raman. Il set di base è costituito da un diodo laser 784 nm (AG Toptica fotonica / Germania), un filtro notch per la separazione del Raman-luce diffusa dalla luce di eccitazione, un microscopio unond uno spettrografo (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / USA) con un dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) ottimizzato per la rilevazione di informazioni spettrali (F-view from soft Imaging Systems / Germania). 3. Controllo della funzione Laser <ol><li> Avviare il software Andor Solis (Andor / Regno Unito) e impostare la temperatura della camera CCD a -60 ° C per ridurre al minimo il rumore provocato dalle correnti indotte termicamente nella fotocamera. </li><li> Posizionare un wafer di silicio sul palco microscopio per la procedura di calibrazione. </li><li> Accendere il laser e impostare la potenza a 85 mW. </li><li> Utilizzare il software delle cellule B (Olympus / Germania) di focalizzare il laser sul wafer fino XY appare. </li><li> Misurare il wafer di silicio con un unico tempo di integrazione di 1 sec usando un obiettivo 60x aria. </li><li> Modificare l&#39;unità della x-asse da alla variazione del numero di pixel Raman (cm -1) nel software Andor Solis. </li><li> Variare il fuoco del laser al silicio del picco a 520 cm -1 inil raccolto spettro per trovare l&#39;intensità massima possibile per questa banda Raman. La quantità minima di conteggi deve essere maggiore di 11.000 a una riuscita della calibrazione. </li></ol> 4. Raman misure spettroscopiche Tutte le misure sono eseguite a temperatura ambiente. <ol><li> Impostazioni di base <ol><li> Utilizzare un obiettivo ad immersione in acqua 60x (Olympus / Germania) con un&#39;apertura numerica di 1,2 per raccogliere lo spettro dei campioni. </li><li> Modificare le impostazioni di acquisizione integrazioni a 10/10 secondi per un totale di 100 secondi per le misurazioni. </li></ol></li><li> Misurazione di cellule aderenti <ol><li> Prendete il piatto fondo di vetro con le celle e collocarlo sul palco microscopio. </li><li> Per ottenere un segnale migliore e garantire la riproducibilità, focalizzare il laser sul nucleo della cellula, ruotare la luce microscopio e iniziare la raccolta dello spettro. </li><li> Misurare uno spettro di riferimento del fondo emolto 10 spettri spostando il fuoco del laser accanto alla cella. E &#39;importante considerare che quando si cambia la messa a fuoco un nuovo sfondo devono essere raccolti per ogni profondità di messa a fuoco. </li></ol></li><li> Misurazione di cellule in sospensione <ol><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare nel piatto inferiore vetro e posizionarlo sul microscopio scena. </li><li> Fuoco del laser al centro della cella, ruotare la luce microscopio e iniziare la raccolta dello spettro. </li><li> Misurare uno spettro di riferimento dello sfondo ogni 10 spettri spostando il fuoco del laser accanto alla cella. Quando si cambia la messa a fuoco, un nuovo sfondo devono essere rilevati per la profondità nuova attenzione. </li></ol></li><li> Misurazione di tessuti nativi <ol><li> Prendete il campione e trasferirli in un piatto fondo di vetro. La regione di interesse (ROI) dovrebbero essere orientati verso il fondo del recipiente. </li><li> Riempire il piatto con PBS a sufficienza per coprire il campione. </li><li> Posizionare un bicchiere di copertura sul campione per evitare qualsiasi movement del campione durante le misurazioni. </li><li> Impostare il fuoco del laser nella struttura di interesse (risoluzione in profondità è laser e tessuto-dipendente) e iniziare a raccogliere gli spettri. </li><li> Raccogliere uno spettro di riferimento dello sfondo ogni 10 spettri spostando il laser fuoco all&#39;esterno della zona di tessuto intero. Quando si cambia la messa a fuoco, un nuovo sfondo devono essere rilevati per la profondità nuova attenzione. </li></ol></li><li> Misura di immunofluorescenza (IF)-etichettati criosezioni <ol><li> Sezione freschi, congelati snap-campioni di tessuto utilizzando un cryotom standard e li montano su silice rivestite con vetri di copertura. </li><li> Colorare le criosezioni secondo un protocollo di routine per IF, impiegando soltanto un piccolo passo di fissaggio (max 10 minuti con paraformaldeide al 4%) e utilizzando anticorpi appropriati per la rilevazione della proteina di interesse. </li><li> Eseguire misurazioni Raman concentrandosi nella zona in cui si verifica fluorescenza. </li></ol></li><li> Elastina degradazione esperimenti <ol><li> Place la ventricularis dei lembi della valvola aortica dissezionati suina (elastina ricco, sangue afflusso strato di lato del lembo della valvola cardiaca) di fronte al fondo del piatto inferiore vetro. </li><li> Misurare il tessuto nativo come un &#39;non-incubate control&#39; a 30 punti casuali in tutta la superficie del tessuto intera messa a fuoco nelle strutture fibrillari. </li><li> Dividere in 3 sezioni e inserirli in separati 2.5 ml provette Eppendorf contenenti 2 ml di una soluzione elastasi (5 U / ml, Worthington / Germania). </li><li> Incubare il tessuto per 15 o 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Dopo incubazione per 15 o 30 minuti, rimuovere i tessuti dalla provetta Eppendorf e lavare accuratamente con PBS al fine di interrompere completamente la reazione enzimatica. </li><li> Misurare ogni campione a 30 punti casuali, concentrandosi nelle strutture fibrillari. </li></ol></li></ol> 5. Elaborazione dati e analisi <ol><li> Spettri Raman di elaborazione Il pre-trattamento deispettri generati è stata eseguita utilizzando il software OPUS (Bruker Optik GmbH / Germania). <ol><li> Al fine di ridurre i segnali interferenti dal vetro e mezzo, nonché per evitare variazioni dovute variazioni del fuoco durante le misure, sottrarre lo spettro corrispondente sfondo dal spettri raccolti. </li><li> Ridurre gli spettri nella regione tra il numero d&#39;onda 400-1800 cm -1, che offre la più alta quantità di informazioni. </li><li> Se necessario, normalizzare gli spettri al picco massimo. Fattori di normalizzazione indica le fluttuazioni di intensità e fallimenti sistematici, semplificando l&#39;individuazione di cambiamenti strutturali nello spettro del campione. </li><li> Eseguire una correzione al basale per aumentare la comparabilità tra i diversi esperimenti. </li></ol></li><li> Analisi di spettri Raman Gli spettri Raman sono stati analizzati utilizzando PCA con la (CAMO / Norvegia) software Unscrambler. L&#39;analisi multivariata rileva le differenze e le somiglianze all&#39;interno dei dati spettraliset. Ogni spettro è tracciata come un unico punto in uno spazio multidimensionale in base ai conteggi raccolti per ogni turno Raman. Ciascun componente principale (PC) descrive una certa quantità di informazioni totale contenute nei dati originali. Il primo PC è quello che contiene la prima fonte di variabilità. Ogni PC che segue contiene, in ordine, meno informazioni rispetto al precedente. Ogni variabile ha un punteggio e un caricamento su ogni PC. Tracciando PC (= punteggi), correlazioni campione importanti possono essere esposti. I caricamenti descrivono il contributo di ciascuna variabile analizzata per la PCA. <ol><li> Etichettare ogni gruppo di misure con la creazione di campi di riga per ogni gruppo di campioni. </li><li> Utilizzare le seguenti impostazioni di base per la PCA: cross di convalida, l&#39;algoritmo NIPALS, nessuna rotazione e avviare l&#39;analisi. Queste impostazioni sono spettri dipendenti. </li><li> Eseguire la PCA. </li></ol></li></ol> 6. Risultati rappresentativi Raman spECTRA generata da cellule aderenti spesso rivelano un basso rapporto segnale-rumore e una bassa intensità di segnale globale (Fig. 1). causa del fatto che il fuoco del laser deve essere impostata in prossimità del fondo di vetro, l&#39;influenza del interferire 11 segnale bicchiere è piuttosto elevata, provocando mascheramento del segnale campione effettivo. Di conseguenza, il segnale campione potrebbe essere ridotta o addirittura eliminato durante una successiva sottrazione del fondo. Così, si preferisce utilizzare cellule in sospensione per la nostra analisi spettroscopica Raman, in quanto consentono il rilevamento di informazioni più dettagliate spettrale. Tuttavia, gli spettri di cellule aderenti e le sospensioni presentano le stesse vette principali che differiscono solo nella loro intensità. Per la caratterizzazione di tipi cellulari diversi all&#39;interno di una sospensione, senza pre-trattamento è richiesto. Gli spettri Raman media e la deviazione standard di fibroblasti umani, cellule staminali mesenchimali (MSC), condrociti e cheratinociti misurato in sospensione sonoillustrato nella figura 2. Tutti gli spettri Raman sono strutturati in modo simile, con picchi provenienti da biomolecole tipici quali proteine, acidi nucleici e lipidi (vedi Tabella 1). 12 Per questi tipi di cellule, la regione spettrale fra 600 e 1800 cm -1 contiene più pertinenti informazione spettrale, da chiare differenze che sono individuabili tra i differenti tipi di cellule (Fig. 2A). Esemplare, abbiamo evidenziato una regione spettrale (1280-1350 cm -1) presentano chiari differenze strutturali, che è assegnabile a vibrazioni molecolari di collagene e di lipidi. Al contrario, le analisi morfologiche non sono adatti per l&#39;identificazione e la distinzione delle maggior parte delle cellule (Fig. 2B-I). Mentre la differenza tra condrociti e cellule della pelle è osservabile (Fig. 2D, H contro B, E e F, I), fibroblasti e MSC sono difficili da separare utilizzando esclusivamente in campo chiaro micrsocopia (Fig. 2B, F rispetto a C, G) 13. Raman analisi spettroscopica di tessuto nativo, in particolare di proteine ​​ECM, richiede che una ROI può essere visualizzato in campo chiaro immagini per essere in grado di concentrarsi sulla rispettiva struttura. Per l&#39;assegnazione di una proteina di uno spettro impronta specifica, abbiamo generato spettri Raman di proteine ​​pure disponibili in commercio e criosezioni immunoistologico macchiati. Qui, abbiamo individuato gli spettri delle impronte digitali di fibre elastiche all&#39;interno dei tessuti nativi confronto elastina liofilizzato e immunofluorescenza macchiati criosezioni che impiegano un anticorpo contro l&#39;elastina. Tuttavia, poiché elastina presenta un autofluorescenza alto, che si riflette nella spettri Raman, l&#39;analisi dei dati è impegnativo (Fig. 3A). Per ridurre l&#39;errore sistematico dovuto campione proprietà specifiche, come autofluorescenza, un trattamento adeguato dei set di dati è fondamentale. In uno i nostri datialyses, abbiamo utilizzato la normalizzazione per eliminare l&#39;intensità del segnale significativamente maggiore della proteina pura elastina, e quindi, siamo stati in grado di generare comparabile spettri Raman (fig. 3B). L&#39;elastina è una delle proteine ​​ECM più stabili nel corpo ed è quindi molto difficile da degradare 14. Nel nostro set up sperimentale, abbiamo indotto la degradazione elastina in volantini sani suina della valvola aortica eseguendo una digestione enzimatica. Applicando la analisi multivariata PCA, abbiamo individuato differenze significative tra gli spettri Raman di enzimaticamente trattati con campioni ed i controlli nativi (Fig. 3C). Queste differenze sono state osservate spettrali nello spettro di carico a 861, 1003 e 1664 cm -1. Attesi cambiamenti strutturali nelle fibre a causa di tempi di esposizione prolungati a elastasi elastina contenenti sono stati mostrati mediante colorazione HART (Fig. 4), che sono riflesse anche in più gruppi distinti punteggio separabili (Fig. 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Figura 1. Media spettri Raman dei fibroblasti staccati e aderente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Figura 2. (A) media spettri Raman e deviazioni standard di quattro differenti tipi principali di cellule isolate (fibroblasti, CSM, condrociti e cheratinociti). Il telaio mette in evidenza la regione spettrale di 1280 - 1350 cm -1 con le differenze strutturali. (BE) in campo chiaro immagini di staccate (B), i fibroblasti (C) MSCS, (D) e condrociti (E) cheratinociti. Barra della scala è uguale a 20 micron. (FI) in campo chiaro immagini di aderenti (F), i fibroblasti (G) MSC, (H) e (i condrociti) cheratinociti. Barra della scala equivale a 200 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Figura 3. (A) spettri Raman senza normalizzazione di lyophiliZed elastina (linea blu), immunofluorescenza (IF)-etichettati criosezioni (linea arancione) e le fibre elastiche (linea rossa) misurati all&#39;interno lembi della valvola aortica nativa. L&#39;intensità di segnale alto liofilizzata elastina è causato da autofluorescenza. (B) spettri Raman dopo la normalizzazione per eliminare guasti sistemici. (C) I punteggi ed i caricamenti del confronto tra i non-trattata di controllo (rosso) e-enzimaticamente degradata (blu e verde) fibre elastiche nel tessuto nativo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Figura 4. HART&#39;s macchiati suina lembi valvolari aortici. Le fibre elastiche sono visualizzati in nero. (A) e (B) mostrano non trattati e di controllo (C) e (D) rappresentano campioni di tessuto che sono stati esposti alla elastina-enzima degradante elastasi per 30 minuti. <table border="1"><tbody><tr><td> Numero d&#39;onda in cm -1 </strong&gt; </td><td colspan="2"> Assegnazione 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Fosfolipidi </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> DNA / RNA basi, OPO backbone </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Fenilalanina </td><td> Proteina </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Ammide III </td><td> Proteina </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH 2 </td><td> Proteine ​​/ lipidi </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amide IC = C </td><td> Protein lipidi </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Bande Raman che vengono rilevati in spettri di tutti i tipi cellulari (fibroblasti, CSM, condrociti e cheratinociti).

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Spettroscopia Raman è un attrezzo adatto per analizzare campioni biologici, come in vitro-colture di cellule e proteine ​​ECM così come le cellule all&#39;interno dei tessuti nativi. 11,15,16 Qui, abbiamo dimostrato che questo non-contatto, privo di etichetta tecnica permette discriminazione di differenti tipi di cellule e la rilevazione della degradazione proteica ECM esclusivamente in base alla composizione biomolecolare intrinseca di questi campioni biologici. Il principale vantaggio della spettroscopia Raman è la capacità di non-invasivo quantificare l&#39;impronta digitale biochimica di un campione dalla sua spettri Raman risultante. In contrasto con spettroscopia infrarossa, che produce informazioni simili, spettri Raman può essere raccolto da campioni acquosi, come la dispersione Raman dall&#39;acqua è debole. Inoltre, spettroscopia Raman si basa unicamente sulla rilevazione di backscattering di luce monocromatica, pertanto, non è richiesta l&#39;elaborazione del campione precedente misura. Questi attributi rendono Raspettroscopia uomo una promettente alternativa per il potenziale in applicazioni di imaging in vivo. A questo proposito, coerente anti-Stokes spettroscopia Raman (CARS) è una tecnica molto interessante in quanto permette l&#39;acquisizione veloce e più sensibile dei dati in base ai segnali vibrazionali stessi utilizzati nei nostri esperimenti. 15,16 Altri metodi alternativi tra cui multiphoton indotta autofluorescenza e seconda immagini generazione armonica sono stati precedentemente dimostrato di essere adatto per il monitoraggio di campioni biologici non invasivo o minima. 17 Tuttavia, queste modalità di imaging sono associati con costi molto elevati e sono limitati a autofluorescenza generatrici molecole. Inoltre, spettrometro Raman è facile da abbinare con tradizionali microscopi ottici. Queste caratteristiche rendono la spettroscopia Raman uno strumento prezioso per studiare campioni biologici in ambienti fisiologici. Uno dei limiti attuali della nostra spettroscopia Raman è istituitoil fuoco del laser relativamente piccola (250 nm intero massimo metà larghezza (FWHM) laterale e 700 nm FWHM assiale) che viene creato da un obiettivo ad alta apertura numerica (NA = 1,2). Sebbene un elevato apertura numerica permette di coprire una buona quantità di luce emessa Raman cedere in un alto rapporto segnale-a-rumore, l&#39;elevata NA produce solo un piccolo fuoco raccolta all&#39;interno del campione che è in genere molto più piccola di una cella. Per confrontare gli spettri Raman di cellule differenti, la raccolta di uno spettro rappresentativo è essenziale, che è difficile da ottenere con una piccola area di messa. Per risolvere questo problema, stiamo lavorando su un processo per automatizzare la raccolta del segnale in diversi punti all&#39;interno della cellula (= mappatura spettroscopica Raman), con un conseguente spettrale media e cedere ad uno spettro rappresentativo. Inoltre, questa tecnica fornisce una panoramica della distribuzione delle specifiche bande Raman, ad esempio della distribuzione proteina all&#39;interno di una cellula. BiolI campioni ogical sono estremamente complessi e costituiti da una miscela eterogenea di biomolecole che contribuiscono alla raccolta spettri Raman. Pertanto, il modello spettrale è molto complessa e il controllo di un singolo tipo di una molecola all&#39;interno di uno spettro Raman è difficile da realizzare con la sovrapposizione di segnali molecolari diversi. Inoltre, fluorescenza intrinseca del campione può mascherare preziose informazioni di deboli segnali Raman. È interessante notare che in alcuni dei nostri studi precedenti, abbiamo individuato in autofluorescenza gli spettri Raman come il principale fattore di differenziazione tra i tipi di cellule (fibroblasti e MSC) utilizzando uno strumento adeguato di analisi 13. Abbiamo anche individuato che i cambiamenti di intensità complessiva del segnale Raman può servire come un indicatore per lo stato di collagene e le fibre di collagene all&#39;interno della ECM di lembi valvolari aortici. 9 Tuttavia, quando si analizza lo stato di elastina in questi tessuti, non siamo stati in grado di rilevare risultati simili. Come indicato nel risultatosezione s, si è invece in grado di rilevare alterazioni specifiche bande Raman elastasi nei campioni trattati rispetto ai controlli nativi. Non abbiamo visto una diminuzione complessiva del segnale Raman nei enzimaticamente trattati con campioni come previsto. Queste osservazioni portato in una trama punteggio che non ha rivelato una formazione di cluster chiaro come si vede nello studio precedente. 9 Al contrario, l&#39;influenza del trattamento enzimatico è rilevabile nei risultati PCA. Partiamo dal presupposto che queste differenze tra i due proteine ​​ECM, elastina e il collagene, si basano sulle differenze morfologiche e diversi processi di degradazione enzimatica: all&#39;interno del lembo della valvola aortica, il collagene ricco di zone (fibrosa) è uno strato continuo che viene allentato a causa della trattamento enzimatico, per cui la zona contenente elastina (ventricularis) ha una configurazione di rete che appare frammentato dopo l&#39;esposizione a elastasi (Fig. 4). Le misurazioni in loco singoli stati, pertanto, non approprimangiava per rilevare tali rotture piccoli all&#39;interno della rete elastina. Qui, una mappatura Raman del tessuto aiuterebbe a identificare i guasti nelle reti. Un&#39;ulteriore sfida in spettroscopia Raman di campioni biologici è quello di ridurre i tempi di misura. Una soluzione è quella di aumentare la potenza del laser, che è adatto finché i campioni biologici non sono interessati da foto-danni. Tutti i nostri esperimenti in corso sono la prova di principio studi incentrati sulla ricerca di base, tuttavia, il nostro obiettivo generale è quello di implementare la spettroscopia Raman per applicazioni cliniche compresa la medicina rigenerativa (ad esempio: controllo della qualità dei prodotti dell&#39;ingegneria tissutale), pre-trapianto e trapianto di monitoraggio la diagnostica del cancro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> elastasi </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> anticorpi anti-elastina </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75; tampone citrato </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> fondo di vetro piatti </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> Il Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

senza contatto, label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante spettroscopia raman

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non distruttivo, non-contatto e label-free tecnologie per monitorare colture cellulari e tissutali sono necessari nel campo della ricerca biomedica. 1-5 metodi di routine, tuttavia, attualmente disponibili richiedono fasi di elaborazione e alterare l&#39;integrità del campione. Spettroscopia Raman è un metodo rapido che permette la misurazione di campioni biologici senza necessità di ulteriori fasi di lavorazione. . Questo laser-tecnologia basata rileva la diffusione anelastica di luce monocromatica 6 In ogni vibrazione chimica è assegnato ad una specifica banda Raman (numero d&#39;onda in cm -1), ciascun campione biologico presenta un tipico andamento spettrale a causa della loro intrinseca composizione biochimica 7. - 9 Entro spettri Raman, l&#39;intensità dei picchi in correlazione con l&#39;ammontare delle obbligazioni presenti molecolari. 1 Analogie e differenze dei set di dati spettrali possono essere rilevati utilizzando un&#39;analisi multivariata (es. analisi delle componenti principali (PCA)) 10. </sup&gt; Qui, noi dobbiamo fare spettroscopia Raman di cellule e tessuti viventi native. Le cellule sono seminate o sulle antenne fondo di vetro o mantenuto in sospensione in condizioni normali colture cellulari (37 ° C, 5% CO 2) prima della misurazione. Tessuti nativi sono sezionati e memorizzati in salina tamponata con fosfato (PBS) a 4 ° C misurazioni precedenti. A seconda del nostro set up sperimentale, abbiamo quindi sia focalizzata sul nucleo della cellula o della matrice extracellulare (ECM) proteine, quali il collagene e l&#39;elastina. Per tutti gli studi, un minimo di 30 celle o 30 punti casuali di interesse all&#39;interno del ECM vengono misurate. Fasi di elaborazione dei dati inclusi sottrazione del fondo e la normalizzazione.

Spettroscopia Raman è una tecnica adatta per il non-contatto, label-free analisi di cellule viventi, dell&#39;ingegneria tissutale costrutti e tessuti nativi. Fonte specifici per le impronte digitali spettrali possono essere generati ed analizzati utilizzando l&#39;analisi multivariata.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Nel campo della ricerca biomedica, sussiste la necessità di tecnologie non distruttive, non a contatto e prive di marcatori per il monitoraggio di colture cellulari e tissutali.1-5 Tuttavia, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare cellule e tessuti attraverso un metodo non invasivo e privo di marcatori. Questo risultato si ottiene mediante la spettroscopia Raman, una tecnologia basata su laser che rileva la diffusione anelastica della luce monocromatica, producendo un profilo spettrale tipico per ogni campione biologico in base alla sua composizione biochimica intrinseca, utilizzando un microscopio a fluorescenza standard abbinato a uno spettrometro Raman. Il confronto diretto tra immagini in campo chiaro e immagini a fluorescenza con gli spettri Raman viene utilizzato per monitorare numerosi campioni biologici.Ogni vibrazione chimica è assegnata a una specifica banda Raman, e l'intensità del picco è correlata alla quantità di legami molecolari presenti. Vengono rilevate somiglianze e differenze tra i set di dati spettrali. Mediante l'impiego di un'analisi multivariata, gli spettri ottenuti possono essere utilizzati per verificare l'integrità dei tessuti dopo il prelievo di un campione bioptico o per attestare la sterilità di cellule isolate.Inoltre, questa tecnica consente la caratterizzazione e l'identificazione di diversi tipi cellulari in vitro. In definitiva, la spettroscopia ramen è una tecnica basata su laser promettente per applicazioni nell'ingegneria tissutale e in campo clinico. Grazie a un'analisi senza contatto e priva di marcatori, il procedimento sarà dimostrato da Daniel Cabal Barrio, tecnico, e da Miriam Tala, studentessa di dottorato del mio laboratorio. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi di routine esistenti, come l'istologia e l'immagine di immunofluorescenza, è che non richiede alcuna preparazione del campione.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo stato delle singole cellule e sui componenti della matrice, può essere applicato anche a tessuti e organi pluricellulari. Per preparare spettri Raman personalizzati, un microscopio a fluorescenza standard viene abbinato a uno spettrometro Raman che consente il confronto diretto tra immagini a fluorescenza e spettri Raman. La configurazione di base comprende un laser a diodo da 784 nanometri, un filtro notch per separare la luce Raman dispersa dalla luce di eccitazione, un microscopio e uno spettrografo con un dispositivo a accoppiamento di carica ottimizzato per la rilevazione delle informazioni spettrali.Per controllare la funzione del laser, avviare il software e/o solace e impostare la temperatura della camera CCD a meno 60 gradi Celsius per minimizzare il rumore causato dalle correnti indotte termicamente nella camera. Posizionare una piastrina di silicio sul palchetto del microscopio per la procedura di calibrazione. Accendere il laser e impostarne la potenza a 85 milliwatt.Utilizzare la cella software B per focalizzare il laser sul wafer fino a quando non appare XY. Misurare il wafer di silicio con un singolo tempo di integrazione di un secondo. Utilizzando un obiettivo a immersione aerea da 60 X, modificare l'unità dell'asse X dal numero di pixel a ramen.La variazione nel software Shift in the and or Soli modifica il fuoco del laser relativo al picco del silicio a numero d'onda 520 nello spettro raccolto. Per individuare l'intensità massima possibile per questa banda Raman, il numero minimo di conteggi deve essere superiore a 11.000 per ottenere una calibrazione corretta prima della misurazione spettrale; preparare i campioni biologici seguendo le istruzioni indicate nel protocollo scritto. Tutte le misurazioni, descritte anche nel video allegato, vengono effettuate a temperatura ambiente.Utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua 60x con un'apertura numerica di 1,2, gli spettri devono essere raccolti con 10 integrazioni per 10 secondi, per un totale di 100 secondi per ogni misurazione. Per effettuare la misurazione di cellule aderenti, posizionare una piastra con fondo in vetro contenente le cellule sul palchetto del microscopio. Al fine di ottenere un segnale migliore e garantire la riproducibilità, focalizzare il laser sul nucleo cellulare, spegnere la luce del microscopio e iniziare a raccogliere lo spettro.Misurare uno spettro di riferimento dello sfondo ogni 10 spettri spostando il fuoco del laser accanto alla cellula. È importante considerare che, quando si modifica il fuoco, è necessario acquisire un nuovo sfondo per ogni profondità di fuoco. In alternativa, per misurare cellule e sospensioni, trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare in una piastra con fondo in vetro.Dopo aver posizionato il campione sul palchetto del microscopio, focalizzare il laser al centro della cellula, spegnere la luce del microscopio e iniziare nuovamente la raccolta dello spettro. Misurare uno spettro di riferimento dello sfondo ogni 10 spettri spostando il fuoco del laser accanto alla cellula. Per misurare gli spettri di tessuti nativi, posizionare il campione in una piastra con fondo in vetro.La regione di interesse deve essere orientata verso il fondo della piastra. Riempire la piastra con PBS sufficiente a coprire il campione. Posizionare un vetrino coprioggetto sopra il campione per evitare qualsiasi movimento del campione.Durante le misurazioni, impostare il fuoco del laser sulla struttura di interesse e iniziare a raccogliere gli spettri. Raccogliere uno spettro di riferimento del fondo ogni 10 spettri spostando il fuoco del laser al di fuori dell'intera area del tessuto, assicurandosi di raccogliere sempre un nuovo fondo per ogni profondità di fuoco durante la misurazione spettrale di sezioni criostatiche marcate con immunofluorescenza. Tagliare campioni di tessuto appena congelati rapidamente.Utilizzando un criostato standard, montare i campioni su vetrini coprioggetto rivestiti di silice. Colorare le sezioni criostatiche seguendo un protocollo di routine per l'immunofluorescenza, applicando unicamente un breve passaggio di fissazione e utilizzando anticorpi appropriati per la rilevazione della proteina di interesse. Effettuare misurazioni con spettroscopia Raman concentrandosi sull'area in cui si verifica la fluorescenza.Per dimostrare esperimenti di degradazione dell'elastina, i ventricoli dei lembi valvolari aortici suini dissecati vengono posizionati rivolti verso il fondo del vetrino. Piatto inferiore. Misurare il tessuto nativo come controllo non incubato in 30 punti casuali distribuiti su tutta la superficie del tessuto.Concentrandosi sulle strutture fibrillari, dividere il campione in due sezioni e posizionarle in due provette da 2,5 millilitri separate, contenenti ciascuna due millilitri di soluzione di elastasi. Incubare il tessuto per 15 o 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, rimuovere i tessuti dalla provetta e lavarli accuratamente con PBS per arrestare completamente la reazione enzimatica.Misurare ogni campione in 30 punti casuali concentrandosi sulle strutture fibrillari. L'elaborazione degli spettri Raman inizia con il pretrattamento degli spettri generati utilizzando il software Opus. In primo luogo, sottrarre lo spettro di fondo corrispondente dagli spettri raccolti per ridurre i segnali interferenti provenienti dal vetro e dal mezzo, nonché per evitare variazioni causate da cambiamenti nel fuoco.Durante le misurazioni, ridurre gli spettri alla regione del numero d'onda compresa tra 401 e 800, che offre la quantità maggiore di informazioni, se necessario. Normalizzare gli spettri mediante normalizzazione al picco massimo, eliminando le fluttuazioni di intensità in caso di guasti sistematici, semplificando così il rilevamento dei cambiamenti strutturali negli spettri del campione. Eseguire una correzione della linea di base per aumentare la comparabilità tra esperimenti diversi.Analizzare gli spettri Raman utilizzando l'analisi delle componenti principali, o PCA, con il software Unscrambler. Questa analisi multivariata rileva differenze e somiglianze all'interno dei set di dati spettrali. Ogni spettro viene rappresentato come un singolo punto in uno spazio multidimensionale basato sui conteggi raccolti per ogni spostamento Raman.Ogni componente principale, abbreviata in CP, descrive una certa quantità dell'informazione totale contenuta nei dati originali. La prima CP è quella che contiene la fonte maggiore di variazione. Ogni CP successiva contiene in ordine meno informazione rispetto alla precedente.Ogni variabile ha un punteggio e un coefficiente di caricamento per ogni componente principale. Tramite la rappresentazione grafica delle componenti principali, è possibile evidenziare importanti correlazioni tra i campioni. I coefficienti di caricamento descrivono il contributo di ciascuna variabile analizzata all'analisi delle componenti principali (PCA). Etichettare ogni gruppo di misurazioni creando intervalli di righe per ogni gruppo di campioni; utilizzare le seguenti impostazioni di base per la validazione incrociata della PCA: algoritmo Nip Al, nessuna rotazione e avviare l'analisi.Queste impostazioni dipendono dagli spettri. Infine, eseguire l'ACP su spettri ramani grezzi generati da cellule aderenti rivela spesso un basso rapporto segnale-rumore e una bassa intensità complessiva del segnale. Il fuoco del laser deve essere impostato vicino al fondo in vetro, il che maschera il segnale effettivo del campione.Di conseguenza, il segnale del campione potrebbe essere ridotto al minimo o addirittura eliminato durante una successiva sottrazione del fondo. Al contrario, le cellule in sospensione consentono la rilevazione di informazioni spettrali più dettagliate. Tuttavia, gli spettri di cellule aderenti e in sospensione mostrano gli stessi picchi principali, che differiscono solo nelle loro intensità entità per la caratterizzazione di diversi tipi cellulari all'interno di una sospensione, non è richiesto alcun pretrattamento.Gli spettri Raman medi e le deviazioni standard di fibroblasti umani, cellule staminali mesenchimali, condrociti e cheratinociti misurati in sospensione sono rappresentati qui. Tutti gli spettri Raman presentano una struttura simile con picchi derivanti da biomolecole tipiche come proteine, acidi nucleici e lipidi. Per questi tipi cellulari, la regione spettrale compresa tra il numero d'onda 601 e 800 contiene le informazioni spettrali più rilevanti, in base alle quali si possono rilevare chiare differenze tra i diversi tipi cellulari.Una regione spettrale esemplare mostra chiare differenze strutturali, attribuibili a vibrazioni molecolari del collagene e dei lipidi. Al contrario, le analisi morfologiche non sono adatte all'identificazione e alla distinzione della maggior parte delle cellule. Mentre la differenza tra condrociti e cellule della pelle è osservabile, fibroblasti e cellule staminali mesenchimali sono difficili da distinguere.Utilizzando esclusivamente la microscopia in campo chiaro per l'assegnazione del tessuto nativo a uno spettro caratteristico specifico, sono stati generati spettri Raman di proteine pure disponibili in commercio e di sezioni crioistologiche colorate mediante immunoistochimica. In questo caso, gli spettri caratteristici delle fibre elastiche sono stati identificati nei tessuti nativi confrontandoli con sezioni crioistologiche liofilizzate, contenenti elastina, e con sezioni crioistologiche marcate con colorazione immunofluorescente mediante un anticorpo specifico per l'elastina. Tuttavia, poiché l'elastina presenta una marcata autofluorescenza, che si riflette negli spettri Raman, l'analisi dei dati risulta complessa e la riduzione degli errori sistematici dovuti a proprietà specifiche del campione, come l'autofluorescenza, richiede un'opportuna elaborazione dei set di dati, la quale risulta fondamentale.Nell'analisi dei dati, è stata utilizzata una normalizzazione per eliminare l'intensità del segnale significativamente più elevata della proteina pura di elastina, ottenendo spettri Raman comparabili. L'elastina è una delle proteine della matrice extracellulare più stabili del corpo ed è pertanto molto difficile da degradare. Qui.La degradazione dell'elastina è stata indotta in foglietti valvolari aortici porcini sani mediante digestione enzimatica; applicando l'analisi multivariata PCA, sono state identificate differenze significative tra gli spettri Raman dei campioni trattati enzimaticamente e i controlli nativi. Queste differenze spettrali sono state osservate nello spettro di loading a numeri d'onda di 861, 1003 e 1.664. I cambiamenti strutturali attesi nelle fibre contenenti elastina, dovuti a tempi prolungati di esposizione all'elastasi, si riflettono in cluster di punteggi più distinti e separabili. Qui vengono mostrati i punteggi del confronto tra controllo non trattato e fibre elastiche degradate enzimaticamente all'interno del tessuto nativo. Questi cambiamenti strutturali attesi sono evidenti anche nei foglietti valvolari aortici porcini colorati, come visualizzato nell'insetto confrontando il controllo non trattato con i campioni di tessuto esposti all'enzima integrante l'elastina, l'elastasi, per 30 minuti.Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nei campi della biologia cellulare e della matrice, nonché della medicina rigenerativa e dell'ingegneria tissutale, permettendo loro di eseguire non solo l'analisi in tempo reale del fenotipo cellulare, ma anche di identificare le interazioni cruciali tra cellula-cellula e tra cellula-matrice in Z due all'interno di un ambiente nativo.

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