Una più veloce, ad alta risoluzione, MTPA-GFP-based test Fusion mitocondriale Acquisizione dati cinetici di più celle in parallelo con microscopia confocale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la fusione mitocondriale in immagini 3D ad alta risoluzione di più cellule in parallelo. Ciò si ottiene esprimendo prima la GFP fotofotofotogenica mitocondriale nelle cellule di interesse. Successivamente, la GFP viene fotoattivata in una piccola regione della popolazione mitocondriale in ciascuna cellula.

Quindi sei sezioni ottiche di ciascuna cellula vengono raccolte ogni 15 minuti fino al raggiungimento dell'equilibrio del segnale al fine di valutare l'entità della fusione mitocondriale, infine può essere valutata una diluizione del fotoattivatore mirato ai mitocondri, l'intensità della GFP nelle cellule sottoposte a fusione mitocondriale in base alla quantificazione del segnale fluorescente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è automatizzata e quindi i dati ad alta risoluzione di più celle possono essere raccolti più rapidamente. Sebbene questo metodo venga dimostrato utilizzando le cellule INS one e fornisca informazioni sul diabete, può essere applicato ad altri tipi di cellule per studiare l'intera fusione mitocondriale nell'invecchiamento e nelle malattie metaboliche e neurodegenerative.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di automazione dell'imaging non sono descritte altrove. Dopo aver coltivato INS, una cellula all'80% di confluenza, staccare le colture con lo 0,05% di tripsina e placcare le cellule risospese su piastre di imaging con fondo coprioggetto rivestite di polide de lisina. Dopo due giorni di coltura, aggiungere alle piastre la GFP con foto-attivazione adenovirale mirata alla matrice mitocondriale.

Quindi, dopo aver coltivato le cellule per 24 ore, sostituire il terreno e lasciare che le cellule crescano per altri due giorni. Il giorno dell'imaging, aggiungere da sette a 15 nanomolari di TMRE alle piastre di imaging ed equilibrare le colture per almeno 45 minuti. Durante questo periodo, accendere l'anidride carbonica al 5%, l'incubatrice e il microscopio dopo che il microscopio si è bilanciato.

Nella scheda di acquisizione, fai clic su mostra strumenti manuali. Aprire il pannello di configurazione dell'imaging, quindi scegliere la modalità canale e cambiare. Tracciate ogni fotogramma nel pannello del percorso della luce.

Scegli LSM e la modalità canale. Quindi, dall'icona del campione che procede verso l'alto, selezionare l'MBS sei 90 plus posteriore e l'MBS 4 88 nella parte inferiore del pannello, controllare il TPMT per abilitare la visualizzazione dei canali in campo chiaro o DIC. Termina la regolazione dei parametri del percorso della luce impostando l'intervallo per il colorante GFP da 490 a 540 nanometri e da 580 a 700 nanometri per il colorante TMRE.

Infine, apri la modalità di acquisizione e imposta un campo di scansione di 512 x 512 pixel nella dimensione del fotogramma, menu a discesa e una media di quattro x nel menu del numero di media. Ora, utilizzando una lente obiettiva, mettere a fuoco le celle con una luce alogena. Aprire il foro stenopeico al massimo ed eseguire la scansione per trovare le cellule che esprimono GFP di foto attivata verde brillante.

Scegli una foto di potenza laser arbitraria, attiva la cella e poi prendi una serie Z di sezioni ottiche attraverso di essa per vedere se l'attivazione è sufficiente. Quindi regolare il laser di imaging a 488 nanometri a bassa potenza senza massimizzare completamente il guadagno del rivelatore per mantenere un buon rapporto segnale/rumore. Dopo essersi assicurati che il segnale non sia saturo, verificare che il segnale GFP di attivazione fotografica sia colocalizzato con il segnale TMRE.

Infine, aprire il foro stenopeico e aumentare il guadagno sul rivelatore, quindi trovare una nuova cellula che esprime GFP per l'attivazione della foto e specificare il fattore di zoom. Quindi impostare l'intervallo della serie Z per raccogliere sei sezioni e salvare il metodo di imaging. Ora apri la finestra multi-tempo nel pannello di sinistra.

Seleziona il pannello di salvataggio e fai clic su seleziona cartella immagini per specificare la posizione in cui verranno salvati i file. Quindi, nel pannello di acquisizione, selezionare il metodo di imaging appena salvato nel menu a discesa della configurazione di scansione. Quindi, seleziona il centro Z contrassegnato della pila Z.

Ora apri il pannello dei blocchi e seleziona il singolo blocco in ogni posizione. Quindi fare clic su aggiungi blocchi per ogni intervallo da misurare, aprire il pannello di cronometraggio, selezionare l'intervallo di peso, quindi digitare zero nella casella dell'intervallo di peso prima del blocco nella prima posizione. Dopo aver selezionato il pannello della posizione, scegliere sposta lo stato attivo sulla posizione di caricamento tra le posizioni e la configurazione della scansione del carico quando si fa clic su LO o sul LO successivo nell'elenco di modifica posizioni, scegliere Cancella tutto e quindi scegliere più posizioni Fase motorizzata sotto il pannello di sbiancamento, fare clic sulla casella di candeggina e designare il file di configurazione nel menu a discesa di configurazione.

Quindi, nella finestra di sbiancamento del software principale, salvare il metodo di attivazione della foto appropriato nel pannello della regione. Scegli il ROI per questa particolare cella e aggiungi questo ROI al multiplo scegliendo aggiungi regione corrente alla finestra dell'elenco ROI. Assicurati di selezionare la stessa posizione nel menu a discesa ROI.

Infine, per ognuna delle 10 celle da seguire nel tempo, eseguire la seguente sequenza. Innanzitutto, quando si trova una cella, indicare la sua posizione scenica nel pannello di posizione e specificare il suo particolare metodo di configurazione della scansione nel pannello di acquisizione. Assicurarsi di specificare la configurazione di scansione per tutti i blocchi.

Quindi, nel pannello delle regioni principali, scegli la regione di interesse da attivare con la foto. Successivamente, nel pannello bleach, salva il ROI e caricalo nella finestra ROI. Quindi cancella la ROI nella finestra delle regioni principali e ripristina la scansione.

Ingrandisci su uno, infine trova la cella successiva e imposta lo zoom. Dopo aver ripetuto il processo per le successive nove celle, verificare che ogni posizione della fase e tutti i blocchi abbiano la configurazione di scansione appropriata designata e che il primo blocco in ogni posizione corrisponda al metodo di attivazione fotografica appropriato, mentre il resto contenga un metodo simulato. Quindi selezionare esegui per le celle in cui il segnale GFP di fotoattivazione si colocalizza principalmente con il segnale TMRE rosso.

Sottrarre lo sfondo nelle immagini GFP dell'attivazione fotografica, quindi configurare le misurazioni della regione per riportare l'intensità media. Quindi esporta i dati in un file Excel per ogni sezione dello stack ZS. Dopo aver omesso i piani che non hanno un segnale, dividere l'intensità dello stack ZS di ciascun punto temporale per l'intensità iniziale attivata dalla foto e ottenere la percentuale del segnale originale nella cella INS one.

Una diminuzione significativa dell'intensità del segnale si verifica ogni 15 minuti per un'ora fino a quando non è stato raggiunto l'equilibrio della fusione mitocondriale. Come dimostrato in queste immagini proiettate di sei sezioni ottiche quantificate ogni 15 minuti durante un tipico saggio di fusione mitocondriale. In questi saggi, una concentrazione molto bassa di TMRE viene utilizzata per aiutare a indirizzare la fotoattivazione della GFP e per monitorare la salute delle cellule.

Si noti che la colocalizzazione quasi completa della cellula attiva la GFP in verde e i segnali TMRE in rosso, e che la colorazione con cos dei coloranti dimostra che i mitocondri sono attivi e non depolarizzati a basse concentrazioni millimolari. Il palmitato frammenta i mitocondri e inibisce la fusione mitocondriale. Pertanto, come si vede in queste sezioni ottiche di una cellula trattata con palmitato, i mitocondri sono frammentati e l'intensità del segnale della GFP fotoattivata mirata alla matrice non è cambiata tanto quanto in condizioni normali, come dimostrato nella figura precedente.

Pertanto, la diluizione del segnale GFP fotoattivo osservata in questa figura è probabilmente dovuta alla fusione mitocondriale piuttosto che alla fissione Durante l'impostazione di questo metodo, tenere presente di scegliere cellule co-localizzanti GFP e TMRE per fotoattivare una quantità sufficiente di GFP per sostenere un segnale, ma non troppo in modo da non perdere gli eventi di fusione mitocondriale e raccogliere l'intero volume mitocondriale all'interno delle sezioni ottiche Per determinare cosa succede alle reti mitocondriali. In assenza di alcune proteine regolatorie o molecole di segnalazione, questo test può essere eseguito in un certo numero di gruppi sperimentali in cui i geni sono silenziati o le cellule sono trattate con vari agenti. La capacità di quantificare la fusione mitocondriale e di analizzare statisticamente i parametri consente lo studio della dinamica mitocondriale negli stati patologici e consente lo sviluppo di trattamenti terapeutici.