Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre colture di arricchimento di protisti dal Lago Bonnie antartico e misurare la fissazione del carbonio come parte di un indicatore iniziale della diversità metabolica. Questo viene ottenuto prelevando prima campioni d'acqua a diverse profondità del Lago Bonnie corrispondenti a picchi noti di protisti e fitoplancton. I campioni d'acqua del lago vengono quindi inoculati in diversi mezzi di crescita e incubati in una camera di crescita dotata di regolatore di temperatura e illuminazione per quattro-sei settimane.

Le colture possono essere trasportate secondo necessità a quattro gradi Celsius. Il passo successivo consiste nell'estrazione di lisati cellulari grezzi dalle colture di arricchimento. L'ultimo passaggio di questa procedura è la valutazione del potenziale di fissazione del carbonio nel lisato cellulare mediante un saggio con radioisotopi per la ribulosio uno cinque bisfosfato carbossilasi, ossigenasi, o attività RubisCo.

In definitiva, le colture di arricchimento pro mostrano una variazione del potenziale di fissazione del carbonio nella comunità naturale di protisti. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali riguardo l'ecologia microbica dei laghi. Ad esempio, il ruolo degli eucarioti microbici nel ciclo del carbonio in diverse fasi nei laghi antartici stratificati.

Sebbene il campionamento della colonna d'acqua per generazioni successive di colture di arricchimento sia una tecnica frequentemente utilizzata, questo metodo include modifiche per operare in un ambiente estremamente freddo in cui possono verificarsi complicazioni impreviste. Ho avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavo pensando a dei modi per testare il saggio Redisco in campioni naturali di lago. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di campionamento sono difficili da immaginare, dato che i siti di campionamento si trovano in un ambiente estraneo a molti ricercatori.

I campioni vengono prelevati dal Lago Bonnie, uno dei numerosi laghi permanentemente coperti di ghiaccio situati nelle valli secche di McMurdo in Antartide, un giorno prima del campionamento della colonna d'acqua. Scegliere e preparare il sito di campionamento. Ciò permetterà ai livelli stratificati della colonna d'acqua di riformarsi dopo il disturbo causato dalla perforazione e dallo scioglimento del foro nel ghiaccio. Identificare la posizione del sito di perforazione mediante GPS per accedere alla colonna d'acqua.

Iniziare praticando un foro nel ghiaccio con un trapano Jiffy Ice collegato a un’estensione Jiffy da quattro pollici e a un utensile tagliente per evitare il congelamento del trapano nel foro. Evitare di trapanare nell’acqua liquida fermandosi a circa quattro-sei pollici sopra l’estremità superiore della colonna d’acqua. Il foro deve essere allargato da un diametro di sei pollici a due piedi per il campionamento.

Questo viene realizzato utilizzando un foratore a modello termico che circola polietilene glicole riscaldato attraverso un foro in un tubo di rame. La fusione richiede tipicamente fino a 18 ore, il giorno precedente il campionamento della colonna d'acqua. Assicurarsi che tutto l'equipaggiamento necessario e i contenitori per lo stoccaggio dei campioni siano assemblati sul sito di campionamento.

I materiali per il campionamento includono una bottiglia NICU con capacità da cinque a dieci litri, un argano con cavo calibrato in profondità, un numero sufficiente di bottiglie per campione per ogni profondità di campionamento, un messaggero e contenitori termici per il trasporto dei campioni. Iniziare il campionamento presto nella giornata, verso le 5:00 del mattino, poiché la filtrazione dell'acqua del lago deve essere completata nel giorno stesso del campionamento. Utilizzando un campionatore kin collegato a un argano manuale calibrato.

Raccogliere campioni d'acqua da uno a cinque litri dalle profondità desiderate per questo studio. Le profondità di campionamento sono di sei metri, 15 metri e 18 metri misurate a partire dal livello simmetrico dell'acqua del PI nel foro nel ghiaccio. Conservare i campioni del lago in contenitori termici e trasportarli dal sito di campionamento al laboratorio di campo.

Utilizzando una slitta collegata a un ATV, i campioni devono essere processati o stabilizzati nel laboratorio di campo. Immediatamente dopo il campionamento, la coltivazione di colture di arricchimento dovrebbe iniziare non appena i campioni sono stati trasportati nel laboratorio di campo. Concentrare da 0,5 a un litro di acqua di lago su un filtro da 47 millimetri con porosità di 0,45 micron.

Filtrare delicatamente utilizzando filtri in polieter solfone. Se si desidera la diversità della comunità naturale, filtrare un secondo campione su un filtro di 47 millimetri con una dimensione dei pori di 0,45 micron.

I filtri in polieter solfone congelano rapidamente i filtri in azoto liquido. Trasferire ciascun filtro in un tubo falcon sterile da 50 millilitri contenente circa 20 millilitri di acqua di lago filtrata, raccolta alla stessa profondità di campionamento del filtro.

Trasferire la sospensione cellulare in un’aliquota sterile da 25 centimetri quadrati per arricchimenti su diversi mezzi di coltura. Impostare più repliche per ogni profondità di campionamento. Aggiungere a ciascun flacone di coltura 50 x soluzioni sterili dei seguenti mezzi di coltura, bold basil, medium, BG 11 e F due.

Se è necessaria la coltivazione di organismi atrofici misti, preparare due contenitori F2 supplementati e aggiungere da due a tre chicchi di riso sterile a uno dei flaconi di coltura da incubare a bassa temperatura e ridotta luminosità in un incubatore per crescita controllata per almeno quattro settimane prima della spedizione al laboratorio statunitense. Trasferire le colture di arricchimento in provette sterili Falcon da 50 millilitri. Richiedere nella richiesta di spedizione di non congelare e mantenere fresco. Al ricevimento negli Stati Uniti, trasferire cinque millilitri di ciascuna coltura di arricchimento in 45 millilitri di apposito terreno di crescita in un contenitore da 125 millilitri.

Flacone erlenmeyer sterile tappato con una spugna sterile. Mantenere le colture di arricchimento come colture stazionarie in una camera di crescita ambientale a temperatura controllata a quattro gradi Celsius e trasferire con bassa irradiazione le colture su terreno fresco ogni 30 giorni. Per iniziare la procedura di estrazione del lisato cellulare, filtrare cinque litri di coltura di arricchimento su un filtro Watman GFF da 25 millimetri utilizzando un vuoto delicato.

Successivamente, tagliare il filtro in quattro o cinque sezioni con forbici sterili di acciaio. Quindi utilizzare pinze sterili per trasferire i pezzi in una provetta con tappo a vite da due millilitri riempita per un quinto con diametro di 0,1 millimetri.

Perle di zirconia e silice. Aggiungere 1,25 millilitri di tampone di estrazione filtrato al tubo, quindi rompere le cellule utilizzando un mini bead beater per 30 secondi a una velocità di 48, seguiti da un minuto su ghiaccio. Ripetere l'omogeneizzazione con le perle altre due volte, con incubazioni di un minuto su ghiaccio tra un ciclo e l'altro, per evitare il surriscaldamento del campione durante la centrifugazione.

Filtrare la sospensione per due minuti a 3000 ×g a quattro gradi Celsius. Per formare un aggregato morbido di fibre del filtro GFF e detriti della parete cellulare. Prelevare un'aliquota di 200 microlitri del soprannatante e immergerla in 800 microlitri di acetone al 90% freddo di ghiaccio.

Trasferire il surnatante rimanente in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri. Misurare la clorofilla A estraibile mediante spettrofotometro a lunghezze d'onda di 664 nanometri e 647 nanometri. Centrifugare il surnatante rimanente per due minuti a 15.000 ×g a quattro gradi Celsius.

Trasferire l'S in una provetta pulita da 1,5 millilitro per microcentrifuga, evitando il pellet costituito dalle membrane cellulari insolubili e dalle restanti fibre del filtro GFF. Questo lisato cellulare solubile può ora essere utilizzato nel saggio di attività della rubisco carbossilasi, che verrà dimostrato successivamente. Per iniziare questo saggio, trasferire 125 microlitri di ciascun lisato solubile in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con tappo a vite, precedentemente raffreddata in ghiaccio.

Per i campioni di controllo negativo, aggiungere 125 microlitri di lisato solubile in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro con tappo a vite, ma non aggiungere il substrato. Successivamente eseguire reazioni duplicate per tutti i campioni e i controlli negativi. Preparare 10 millilitri di tampone per il saggio, fresco e raffreddato su ghiaccio.

Aggiungere una quantità sufficiente del buffer per il saggio per tutti i campioni e i controlli negativi in un tubo da cinque millilitri. Da questo punto in avanti, tutti i passaggi devono essere eseguiti sotto cappa. Aggiungere bicarbonato di sodio marcato con C 14 al buffer assegnato e mantenere il buffer sul ghiaccio.

Rimuovere 10 microlitri di tampone per saggio contenente C 14 e diluirli in un millilitro di tampone per saggio invertito. Per miscelare, aggiungere 100 microlitri della miscela diluita a tre millilitri di cocktail per conteggio scintillometrico Bios Safe 2 in un vial per scintillazione e capovolgere per miscelare. Misurare i conteggi di C 14 con un contatore Beckman LS 6,500; i conteggi scintillometrici devono essere superiori a 18.000 conteggi al minuto prima di proseguire con il saggio.

Quando è stato aggiunto al buffer del saggio una quantità sufficiente di bicarbonato di sodio marcato con C 14, trasferire le provette di reazione in un bagno a secco preimpostato a 25 gradi Celsius e incubare per tre-cinque minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di buffer del saggio ai lisati e incubare a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo cinque minuti, aggiungere il ribulosio bisfosfato a ciascun campione e lasciare procedere la reazione per cinque-dieci minuti a 25 gradi Celsius.

Per arrestare la reazione, aggiungere 100 microlitri di acido probiotico al 100%, centrifugare per un'ora a 2000 ×g per rimuovere il C14 non incorporato. Infine, trasferire il volume totale dei campioni in vial per scintillazione contenenti tre millilitri di bios. Aggiungere due millilitri di cocktail per conteggio a scintillazione e determinare i conteggi al minuto della frazione stabile all'acido.

Prodotti finali mediante conteggio a scintillazione. La coltura di arricchimento è stata utilizzata per isolare nuovi protisti fototrofi e mistotrofi adattati al freddo dal Lago Antartico Bonnie a tre profondità diverse. Sono stati utilizzati vari tipi di terreni di coltura per selezionare una maggiore diversità di organismi: terreno BBMF, terreno marino due si e terreno BG 11.

La concentrazione di nutrienti e la radiazione fotosinteticamente attiva o PAR mostrate in questa tabella rappresentano le condizioni al momento del prelievo del campione. L'ispezione visiva delle colture arricchite mediante microscopia ottica ha rivelato che le colture erano dominate da protisti fototrofi, come indicato dalla presenza del pigmento clorofilliano nella maggior parte delle cellule. Le colture ospitavano inoltre una varietà di morfologie cellulari, a seconda della profondità di campionamento da cui era stato prelevato l'inoculo e del tipo di mezzo utilizzato nella coltura.

Sono state misurate le velocità massime dell'attività della carbossilasi catalizzata dall'enzima rubis nelle colture arricchite come indicatore del fissaggio del carbonio. L'abbondanza potenziale di clorofilla A è stata inoltre monitorata come stima della biomassa dei protisti fototrofi, come mostrato qui.

Nonostante la coltivazione di tutte le colture alla stessa temperatura, il potenziale di fissazione del carbonio e la biomassa fototrofica variano notevolmente tra le colture arricchite. L'attività massima di rubis O è stata osservata nelle colture arricchite quattro e sei cresciute in mezzo BBM e nelle colture arricchite 13 e 14 cresciute in mezzo BG 11. Al contrario, le colture 1921 e 23 arricchite in mezzo di crescita F due hanno mostrato attività massime della carbossilasi da quattro a 34 volte inferiori.

Queste differenze non erano dovute a livelli inferiori di biomassa nelle colture F2, poiché l'attività della carbossilasi è stata espressa in base alla clorofilla a. Inoltre, un'analisi di correlazione di Pearson ha rivelato che l'attività della rubisco non era correlata alla concentrazione di clorofilla a. Le colture BBM sono state inoculate con acqua di lago prelevata a sei metri e a quindici metri.

Il recinto di arricchimento numero cinque ha mostrato i livelli più elevati di clorofilla A, mentre tutte le altre colture hanno mostrato concentrazioni relativamente basse di clorofilla a, indipendentemente dall'attività dell'enzima rubis. Una volta acquisite, le tecniche di campionamento del lago richiedono circa due ore per essere eseguite. A seconda del numero di campioni prelevati, il saggio della carbossilasi richiede anch'esso circa due ore se eseguito correttamente. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il saggio dell'attività enzimatica eterotrofa, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio a quale profondità si verifica l'eterotrofo. Bene, dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come raccogliere campioni di lago, arricchirli per la produzione e sottoporli a saggio per l'attività della carbossilasi rubis.