Name: Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 38 s
Description: Scopri come isolare eucarioti microbici dal Lago Bonney in Antartide e valutarne la fissazione del carbonio mediante saggi radioisotopici per l'attività della RubisCO. Questo metodo rivela la diversità metabolica.

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Gli autori ringraziano J. Priscu, A. Chiuchiolo e il team di McMurdo LTER limnologia per l&#39;assistenza nella raccolta e conservazione dei campioni in Antartide. Ringraziamo Ratheon Servizi polari PHI ed elicotteri per il supporto logistico. Micrografie luce sono stati generati nel Centro di Miami per la microscopia avanzata e Centro Imaging. Questo lavoro è stato supportato dall&#39;Ufficio NSF di Polar Grants Programmi 0631659 e 1056396.

1. Esempio di acquisizione <ol><li> Scegli e prepara il sito di campionamento un giorno prima campionamento della colonna d&#39;acqua. Ciò consentirà alle stratificazioni della colonna d&#39;acqua di riformare dopo disturbo a causa di perforazione e ghiaccio foro di fusione. Identificare la posizione del sito di perforazione attraverso GPS. </li><li> Per accedere alla colonna d&#39;acqua, iniziare praticando un foro attraverso il ghiaccio con una coclea ghiaccio Jiffy attaccato ad una da 4 pollici di estensione Jiffy po &#39;di volo e di taglio. Per evitare il congelamento del trapano nel foro, cercare di evitare di perforazione in acqua liquida interrompendo perforazione di circa 4-6 cm sopra la parte superiore della colonna d&#39;acqua. </li><li> Il foro dovrà essere allargato da un diametro di 15 a 60 cm prima del prelievo. Ciò si ottiene mediante l&#39;uso di un fusore foro (Modello Hotsy) che circola polietilene glicole riscaldata attraverso un tubo di rame. Hole di fusione richiede in genere fino a 18 ore. </li><li> Prima di campionamento della colonna d&#39;acqua, in modo che tutte le attrezzature necessarie e st campioneorage vasi sono assemblati presso il sito di campionamento. Materiali di campionamento sono: bottiglia Niskin (capacità L 5-10), Winch con profondità calibrata cavo, Messenger, bottiglie di un campione sufficiente per ogni profondità di campionamento e scambiatori di calore per il trasporto del campione. </li><li> Inizia campionamento nelle prime ore del giorno (~ 5 del mattino), il filtraggio delle acque del lago dovrebbe essere completata il giorno del prelievo. Raccogliere campioni di acqua (1-5 L) dalla profondità desiderata (per questo studio: 6-m, 15 me 18 m profondità di campionamento, misurata dal livello dell&#39;acqua piezometrico nel buco del ghiaccio) utilizzando un campionatore Niskin collegata a un calibrato argano a mano. Per evitare disturbi della colonna d&#39;acqua raccolgono basse profondità prima di quelli più profondi. </li><li> Conservare i campioni di lago in dispositivi di raffreddamento e dei trasporti dal sito del campione al laboratorio campo utilizzando una slitta attaccato ad un ATV (All Terrain Vehicle). I campioni devono essere trattati o stabilizzati (ad es: freeze flash in azoto liquido) presso il laboratorio di campionamento campo immediatamente successivo. </li></ol> 2. SVILUPPOnt di colture di arricchimento <ol><li> Per la coltivazione di colture di arricchimento, concentrato 0,5-1 litri di acqua del lago sul 47 mm a 0,45 micron filtri dalle dimensioni dei pori polietersolfone con filtrazione leggera (&lt;0,3 atm). Se la diversità della comunità naturale si desidera, filtrare un secondo campione su 47 mm 0,45 filtri dimensioni dei pori um polietersolfone e seguire protocolli secondo Bielewicz et al. 4 per diversità filogenetica eucariote. </li><li> Trasferire filtro 50 provetta sterile falcon mL contenente ~ 20 mL di acqua filtrata lago raccolti dalla profondità di campionamento stesso filtro. Lavare delicatamente le cellule dal filtro con una pipetta sterile. </li><li> Trasferire sospensione cellulare in un centimetro 25 2 beuta sterile coltura cellulare. Aggiungere l&#39;acqua filtrata lago raccolto da ciascun campione profondità per aumentare il volume di cultura a 45 mL. Impostare replica multipli per ogni profondità di campionamento se arricchimenti su diversi terreni di coltura si desiderano. </li><li> Supplemento palloni di coltura con 50X sterile soluzioni ad una concentrazione finale di 1X dei seguenti terreni di coltura: Medio Bold Basal, il BG11 e F / 2. Se la coltura di organismi mixotrophic è richiesto, set-up due navi F/2-supplemented e aggiungere 2-3 grani di riso sterile a uno dei fiaschi. </li><li> Incubare fiasche di coltura a bassa temperatura (4 ° C) e basso irraggiamento (20 fotoni micromoli m -2 s -1) a temperatura controllata crescita incubatore per almeno 4 settimane in Antartide prima della spedizione al laboratorio degli Stati Uniti. Se si desiderano isolati, piatto 250 microlitri della coltura di arricchimento su piastre di agar contenenti terreni di coltura appropriati dopo 2 settimane di incubazione. </li><li> Per la spedizione verso gli Stati Uniti, colture di arricchimento di trasferimento a sterili da 50 mL tubi falcon. Richiesta di spedizione requisito &quot;non congelare&quot; e &quot;mantenere la calma&quot; su spedizione richiesta. Mentre il processo di spedizione dall&#39;Antartide è relativamente veloce (2 settimane aereo commerciale) e altamente affidabile, vi è la possibilità di perdita di dell&#39;organo fastidiosoismi durante il processo di trasporto. Così, gli investigatori potrebbero voler mantenere un sottocampione prima della spedizione in modo che la perdita di alcune specie durante il processo di spedizione può essere valutata. </li><li> Al suo arrivo negli Stati Uniti, il trasferimento 5 ml di coltura di arricchimento in 45 ml di terreni di crescita appropriati in un 125 mL beuta sterile ricoperto con una spugna sterile. Colture di arricchimento devono essere mantenute in piedi le culture in una camera di crescita a temperatura controllata ambientale (camera di crescita Diurno, VWR) a 4 ° C/20 fotoni micromoli m -2 s -1. Le colture dovrebbero essere trasferiti in mezzi freschi ogni 30 giorni. </li></ol> 3. Cella Estrazione del lisato da arricchimenti filtrati <ol><li> Filter 5 ml di coltura di arricchimento su un 25 mm Whatman GF / F filtro utilizzando vuoto dolce (&lt;10 psi). Il filtro può essere conservato per diverse settimane a -80 ° C prima di essere analizzati attività RuBisCo. </li><li> Tagliare il filtro in sezioni 4-5 con le forbici in acciaio sterili etrasferire i pezzi con pinza sterile ad un tubo 2 tappo a vite mL riempito un quinto del modo pieno, con 0,1 mm di diametro in ossido di zirconio / silice perline. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di tampone di estrazione filtro (50 bicina mM, 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, e 0,1% Triton X-100; aggiungere fresco: 10 mM NaHCO 3, 10 mM DTT, 3,3 mM aminocaproico acido, 0,7 benzammidina mM, pH 7.8) 13 e distruggere le cellule utilizzando un battitore Minibead tre volte per 30 secondi su regolazione della velocità 48. Per evitare il riscaldamento del campione, beadbeating alternano con 1 min di incubazione su ghiaccio. </li><li> Centrifugare slurry filtro per 2 min a 3000 xga 4 ° C per formare un pellet sciolto di GF / F fibre del filtro e della parete detriti cellulari. </li><li> Rimuovere a 200 microlitri un&#39;aliquota e immergerli in 800 microlitri di ghiacciata acetone 90%. Misurare clorofilla estraibile (CHL) in uno spettrofotometro a valori di lunghezza d&#39;onda di 664 nm e 647 nm 14. Trasferire il supernatante in una provetta 1,5 ml. </li><li> Centrifugare remaining surnatante a 4 ° C per 2 min a 15.000 xg e trasferire il supernatante (evitare il pellet insolubili di membrane cellulari e rimanenti GF / F fibre del filtro) ad una provetta pulita 1,5 mL microcentrifuga. Questo lisato cellulare solubile può ora essere usato nel saggio di attività carbossilasi Rubisco. </li><li> Lisato può essere conservato a -80 ° C dopo l&#39;aggiunta di 12,5% glicerolo e congelamento flash in azoto liquido. Una perdita di attività può verificarsi dopo diversi cicli gelo / disgelo a seconda della sensibilità degli enzimi del lisato. Pertanto, l&#39;attività di lisato fresco rispetto congelato dovrebbe essere testato prima su larga scala delle cellule estrazioni lisato. </li></ol> 4. RuBisCo carbossilasi Activity Assay Filter <ol><li> Trasferire 125 pl di lisato solubile in una provetta da microcentrifuga tappo a vite 15 mL (tappo non necessario) che è stata raffreddata su ghiaccio. Per i campioni di controllo negativi, aggiungere 125 microlitri lisato solubile a 15 provetta da microcentrifuga tappo a vite mL, ma non aggiungere substrato (nel passo 4.7). Correreduplicato reazioni per tutti i campioni ei controlli negativi. </li><li> Preparare 10 mL di tampone fresco (50 mM bicina-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO 3, 25 mM MgCl 2) e congelati su ghiaccio. Aliquotare abbastanza del tampone di saggio per tutti i campioni e dei controlli negativi (100 pl per campione / controllo supplementare più 100 mL) a un tubo 5 ml. Eseguire tutti i passaggi successivi sotto una cappa aspirante. </li><li> Aggiungere 40 microlitri NaH 14 CO 3 (500 uCi / mL) per mL di tampone al buffer aliquotate e mantenere il buffer su ghiaccio. </li><li> Rimuovere 10 L del tampone di saggio contenente 14 C e diluirlo in 1 ml di tampone. Dopo l&#39;inversione di mescolare, aggiungere 100 microlitri della miscela diluita 1:100 a 3 ml di Bio-Safe scintillazione II conteggio cocktail in una fiala di scintillazione. Capovolgere. Conta scintillazione (Beckman LS6500) dovrebbero essere oltre 18.000 cpm prima di continuare con il dosaggio. </li><li> Quando abbastanza NaH 14 CO 3 è stato aggiunto al tampone di saggio,spostare le provette di reazione ad un bagno di preset secco a 25 ° C e incubare per 3-5 minuti. </li><li> Aggiungere 100 pl tampone di saggio per i lisati e incubare per 5 minuti a 25 ° C. </li><li> Aggiungere 20 pl di 15 mM ribulosio difosfato, per campioni e permettere la reazione per 5-10 minuti a 25 ° C. </li><li> Aggiungere 100 pl di acido propionico (100%) (Fisher) per arrestare la reazione. Centrifugare per 1 ora a 2000 xg per esaurire unincorporated 14 C. </li><li> Trasferire il volume totale dei campioni di flaconi di scintillazione contenente 3 ml Bio-sicura di cocktail di scintillazione II conteggio. Determinare il cpm di prodotti finali acidi stabili mediante conteggio a scintillazione (B. Witte, R. Tabita comunicazione personale). </li><li> Calcolare i tassi di attività RuBisCo su Chl a base 14. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Abbiamo utilizzato coltura di arricchimento per isolare fototrofi freddo adattato e protisti mixotrophic residenti nella L AntartideAke Bonney. Per acquisire una maggiore diversità di organismi, abbiamo provato tre tipi di terreni di coltura: Medio basale Bold (BBM) 15, F/2-Si Marine Media 16, 17 e BG11 Media 18. L&#39;ispezione visiva delle colture di arricchimento al microscopio ottico ha rivelato che le colture sono state dominate dal protisti fototrofi (indicata dalla presenza del pigmento clorofilla nella maggior parte delle cellule) e alloggiata una varietà di morfologie cellule a seconda della profondità di campionamento dal quale è stata presa l&#39;inoculo e la tipo di supporto utilizzato nella coltura (Fig. 1). Abbiamo misurato i tassi massimi di attività carbossilasi catalizzate dalla RuBisCo enzima come proxy per il potenziale fissazione del carbonio. Chl a abbondanza è stato anche monitorato come una stima della biomassa fototrofi protista (Fig. 2). Nonostante la coltivazione di tutte le culture sotto la stessa temperatura / luce regime (es. 4 ° C/20 mmol m -2 s -1), fissazione del carbonio potenzialee biomasse fototrofi varia drasticamente tra le culture di arricchimento. Massima attività Rubisco è stata osservata in colture di arricchimento in crescita o BBM (arricchimenti 4 e 6) o BG11 (arricchimenti 13 e 14) mezzi di crescita, mentre le colture arricchito in F / 2 mezzo di crescita (arricchimenti 19, 21, 23) esposto a 4 - alle attività minori di 34 volte carbossilasi massimi. Queste differenze non erano dovuti a bassi livelli di biomassa nelle F / 2 culture, come l&#39;attività carbossilasi è stata espressa su una base Chl. Inoltre, l&#39;attività RuBisCo non correlavano con CHL una concentrazione (r = -0,023, p&gt; 0.1;. Fig. 2, inserto). Le culture BBM inoculate con l&#39;acqua del lago da 6 e 15 m (arricchimenti 4 e 5) aveva la più alta Chl a livelli, mentre tutte le altre culture esposti CHL relativamente bassa a, indipendentemente dall&#39;attività enzimatica RuBisCo (Fig. 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> Figura 1.Rappresentativi microbiche eucarioti colture di arricchimento che sono selezionati per la crescita di organismi diversi. Identità della cultura è data in basso a sinistra dei pannelli. Tutte le immagini rappresentano micrografie luminosi generati utilizzando olio da immersione ingrandimento 1000X. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> Figura 2. Potenziale capacità di fissazione del carbonio e la clorofilla estraibile alcuni livelli in colture microbiche eucarioti arricchimento antartici isolati dal lago di Bonney e coltivati ​​in vari terreni di coltura. Vedi Tabella 1 per i dettagli cultura Inset:. Correlazione di Pearson tra clorofilla un potenziale di fissazione di carbonio in abbondanza e colture microbiche eucarioti arricchimento antartiche.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Recenti studi molecolari hanno riportato alta diversità di eucarioti unicellulari in una serie di ambienti 3, 19, 20, tuttavia, a causa della mancanza di isolati tutta la gamma di habitat protisti i ruoli funzionali di queste singole specie in reti alimentari sono largamente sconosciuto. In questo studio, abbiamo descritto le metodologie di arricchire di specie microbiche eucarioti espositrici versatilità metabolica da un ambiente relativamente sottocampionato, uno permanentemente coperta di ghiaccio antartic...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> BBM </td><td> Sigma </td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td> Sigma </td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td> Sigma </td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtro, 25 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtro, 47 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td> Polietersulfone filtro, pori 0,45 micron, 47 mm </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 61854 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile coltura cellulare pallone, 25 cm 2 </td><td> Corning </td><td> 430639 </td><td></td></tr><tr><td> Diurnal camera di crescita </td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td> Zirconia / sfere di silice, 0,1 millimetri diametro non </td><td> Biospec Prodotti </td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Bead beater </td><td> Biospec Prodotti </td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td> Con tappo a vite provetta (1,5 pl) </td><td> USA Scientific </td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 14 CO 3 </td><td> ViTrax </td><td> VC 194 </td><td> Conservare in aliquote di 400 microlitri a -20 ° C </td></tr><tr><td> RuBP </td><td> Sigma </td><td> R0878-100mg </td><td> Sciogliere in 10 mM Tris-propionico (pH 6,5) </td></tr></tbody></table>

istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente stratificati antarctic lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Bonney Lake è uno dei numerosi permanente coperti di ghiaccio laghi situati nelle McMurdo Dry Valleys, Antartide. La copertura di ghiaccio perenne mantiene una colonna d&#39;acqua stratificata chimicamente e, a differenza di altri organi interni d&#39;acqua, impedisce in gran parte input esterno di carbonio e sostanze nutritive dai flussi. Biota sono esposti a numerosi stress ambientali, tra cui tutto l&#39;anno grave carenza di nutrienti, basse temperature, ombra estrema, hypersalinity, e 24 ore buio durante l&#39;inverno 1. Queste condizioni ambientali estreme limitare il biota in Bonney Lake quasi esclusivamente ai microrganismi 2. Unicellulari eucarioti microbica (chiamati &quot;protisti&quot;) sono attori importanti cicli biogeochimici globali 3 e svolgono importanti ruoli ecologici del ciclo del carbonio nei laghi asciutti valle, occupando entrambi i ruoli primari e terziario nella catena alimentare acquatica. Nelle secche alimentari valle acquatici web, protisti, che fissano inorganic carbonio (autotrophy) sono i maggiori produttori di carbonio organico per gli organismi organotrophic 4, 2. Phagotrophic o protisti eterotrofi capaci di ingerire batteri e piccoli protisti agire come i predatori al vertice della rete alimentare 5. Infine, una percentuale sconosciuta della popolazione protista è in grado di combinata metabolismo mixotrophic 6, 7. Mixotrophy in protisti implica la capacità di combinare la capacità fotosintetica con l&#39;ingestione di microrganismi phagotrophic preda. Questa forma di mixotrophy differisce dal metabolismo mixotrophic in specie batteriche, che in genere comporta l&#39;assorbimento di molecole di carbonio disciolto. Ci sono attualmente isolati protisti poche in posti di ghiaccio-capped laghi polari, e gli studi della diversità protista ed ecologia in questo ambiente estremo sono stati limitati 8, 4, 9, 10, 5. Una migliore comprensione di protista versatilità metabolica nel semplice cibo secco web Valle del Lago sarà di aiuto nello sviluppo di modelli per la role di protisti nel ciclo globale del carbonio. Abbiamo utilizzato un approccio coltura di arricchimento per isolare protisti potenzialmente fototrofi mixotrophic e dal Lago di Bonney. Profondità di campionamento nella colonna d&#39;acqua sono stati scelti in base alla localizzazione della produzione primaria e massimi protista diversità filogenetica 4, 11, nonché alla variabilità nelle principali fattori abiotici che influenzano le modalità trofiche protisti: profondità di campionamento basse sono limitati per i nutrienti più importanti, mentre più profonde profondità di campionamento sono limitati dalla disponibilità luce. Inoltre, campioni di acqua lago sono stati integrati con diversi tipi di supporto di crescita per promuovere la crescita di una varietà di organismi fototrofi. RuBisCo catalizza il fattore limitante nella Benson Calvin Bassham (CBB) il ciclo, la via principale attraverso il quale gli organismi autotrofi fissare il carbonio inorganico in carbonio organico e di fornire per i livelli trofici superiori nelle reti trofiche acquatiche e terrestri 12. In questo studio, we applicato un saggio di radioisotopo modificato per campioni filtrati da 13 a monitorare massima attività carbossilasi come proxy per il potenziale fissazione del carbonio e la versatilità metabolica nelle colture di arricchimento Bonney Lake.

Eucarioti microbiche sono sia una fonte di carbonio fotosinteticamente derivato e le prime specie di predatori in modo permanente coperti di ghiaccio dei laghi antartici. Questo rapporto descrive un approccio coltura di arricchimento per isolare metabolicamente eucarioti microbici versatili dal lago antartico, Bonney Lake, e valuta il potenziale fissazione del carbonio inorganico mediante un saggio di radioisotopi per la ribulosio-1 ,5-bisphophate carbossilasi ossigenasi (RuBisCo) attività.

Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio

Il lago Bonney è uno dei numerosi laghi permanentemente coperti di ghiaccio situati nelle McMurdo Dry Valleys, in Antartide. La copertura di ghiaccio perenne mantiene un...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre colture di arricchimento di protisti dal Lago Bonnie antartico e misurare la fissazione del carbonio come parte di un indicatore iniziale della diversità metabolica. Questo viene ottenuto prelevando inizialmente campioni d'acqua a diverse profondità del Lago Bonnie corrispondenti ai picchi noti di protisti e fitoplancton. I campioni d'acqua vengono quindi inoculati in diversi mezzi di crescita e incubati in una camera di crescita dotata di regolatore di temperatura e illuminazione per quattro-sei settimane.Le colture possono essere trasportate secondo necessità a quattro gradi Celsius. Il passo successivo consiste nell'estrazione di lisati cellulari grezzi dalle colture di arricchimento. L'ultimo passaggio di questa procedura è la valutazione del potenziale di fissazione del carbonio nel lisato cellulare mediante un saggio con radioisotopi per la ribulosio uno cinque Bisfosfato, carbossilasi, ossigenasi, o attività Rubis co.Infine, le colture di arricchimento pro mostrano una variazione del potenziale di fissazione del carbonio nella comunità naturale di protisti. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali riguardanti l'ecologia microbica dei laghi, ad esempio al ruolo dei eucarioti microbici nel ciclo del carbonio in diverse fasi nei laghi antartici stratificati.Sebbene il campionamento della colonna d'acqua per generazioni successive di colture di arricchimento sia una tecnica frequentemente utilizzata, questo metodo include modifiche per operare in un ambiente estremamente freddo in cui possono verificarsi complicazioni impreviste. Ho avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavo pensando a dei modi per testare il saggio Redisco in campioni naturali di lago. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di campionamento sono difficili da immaginare, dato che i siti di campionamento si trovano in un ambiente estraneo a molti ricercatori.I campioni vengono prelevati dal Lago Bonnie, uno dei numerosi laghi permanentemente ricoperti di ghiaccio situati nelle Valli Secche di McMurdo in Antartide, un giorno prima del campionamento della colonna d'acqua. Ciò permetterà ai livelli stratificati della colonna d'acqua di riformarsi dopo il disturbo causato dalla perforazione e dallo scioglimento del foro nel ghiaccio. Identificare la posizione del sito di perforazione mediante GPS per accedere alla colonna d'acqua.Iniziare praticando un foro nel ghiaccio con un trapano Jiffy Ice collegato a un'estensione Jiffy da quattro pollici e a un utensile tagliente per evitare il congelamento del trapano nel foro. Evitare di trapanare nell'acqua liquida fermandosi a circa quattro-sei pollici sopra l'inizio della colonna d'acqua. Il foro praticato deve essere allargato da un diametro di sei pollici a due piedi per consentire il campionamento.Questo viene effettuato utilizzando uno scioglitore di fori basato su un modello ad acqua calda, che circola polietilene glicole riscaldato attraverso un foro in un tubo di rame. La fusione richiede tipicamente fino a 18 ore, il giorno precedente il campionamento della colonna d'acqua. Assicurarsi che tutto l'equipaggiamento necessario e i contenitori per lo stoccaggio dei campioni siano assemblati sul sito di campionamento.Il materiale per il campionamento comprende una bottiglia NICU con capacità da cinque a dieci litri, un argano con cavo calibrato in profondità, un numero sufficiente di contenitori per campioni per ogni profondità di campionamento, un percussore e contenitori termici per il trasporto dei campioni. Iniziare il campionamento presto nella giornata, intorno alle 5:00, poiché la filtrazione dell'acqua del lago deve essere completata nella stessa giornata del campionamento. Utilizzare un campionatore kin collegato a un argano manuale calibrato.Prelevare campioni d'acqua da uno a cinque litri dalle profondità desiderate per questo studio. Le profondità di campionamento sono di sei metri, 15 metri e 18 metri misurate dal livello dell'acqua simmetrico rispetto al PI nel foro nel ghiaccio. Conservare i campioni del lago in contenitori termici e trasportarli dal sito di campionamento al laboratorio di campo.Utilizzando una slitta collegata a un ATV, i campioni devono essere processati o stabilizzati nel laboratorio sul campo. Immediatamente dopo il campionamento, la coltivazione di colture di arricchimento dovrebbe iniziare non appena i campioni sono stati trasportati nel laboratorio sul campo. Concentrare da 0,5 a un litro di acqua di lago su un filtro da 47 millimetri con porosità di 0,45 micron.Filtrare delicatamente utilizzando filtri in polieter solfone. Se si desidera la diversità della comunità naturale, filtrare un secondo campione su un filtro di 47 millimetri con una dimensione dei pori di 0,45 micron.I filtri in polietersolfone vengono congelati rapidamente in azoto liquido. Trasferire ciascun filtro in un tubo sterile da 50 millilitri contenente circa 20 millilitri di acqua di lago filtrata, prelevata dalla stessa profondità di campionamento del filtro.Trasferire la sospensione cellulare in un’aliquota sterile da 25 centimetri quadrati per arricchimenti su diversi mezzi di coltura. Impostare multipli repliche per ogni profondità di campionamento. Aggiungere ad ogni flacone di coltura 50 x soluzioni sterili dei seguenti mezzi di coltura, bold basil, medium, BG 11 e F due.Se è necessaria la coltivazione di organismi mixotrofi atrofici, preparare due contenitori F2 supplementati e aggiungere due o tre chicchi di riso sterile a uno dei flaconi di coltura, quindi incubare a bassa temperatura e ridotta radiazione in un incubatore climatizzato per almeno quattro settimane prima della spedizione al laboratorio statunitense. Trasferire le colture di arricchimento in provette Falcon sterili da 50 millilitri. Nella richiesta di spedizione, indicare esplicitamente di non congelare e mantenere fresco. Al ricevimento negli Stati Uniti, trasferire cinque millilitri di ciascuna coltura di arricchimento in 45 millilitri di terreno di crescita appropriato in un contenitore da 125 millilitri.Flacone erlenmeyer sterile con tappo in spugna sterile. Mantenere le colture di arricchimento come colture stazionarie in una camera di crescita ambientale a controllo termico a quattro gradi Celsius e trasferire con trasferimento a radianza ridotta le colture su mezzo fresco ogni 30 giorni. Per iniziare la procedura di estrazione del lisato cellulare, filtrare cinque litri di coltura di arricchimento su un filtro Watman GFF da 25 millimetri utilizzando un vuoto delicato.Successivamente, tagliare il filtro in quattro o cinque sezioni con forbici sterili di acciaio. Quindi utilizzare pinze sterili per trasferire i pezzi in un tubo con tappo a vite da due millilitri riempito per un quinto con diametro di 0,1 millimetri.Perline di zirconia e silice. Aggiungere 1,25 millilitri di tampone di estrazione per filtrazione nel tubo, quindi rompere le cellule utilizzando un omogeneizzatore a perline miniaturizzato per 30 secondi a una velocità di 48, seguito da un raffreddamento sul ghiaccio per un minuto. Ripetere ulteriormente due volte l'omogeneizzazione a perline, intervallata da incubazioni sul ghiaccio di un minuto ciascuna, per prevenire il surriscaldamento del campione durante la centrifugazione.Filtrare la sospensione per due minuti a 3000 volte G a quattro gradi Celsius. Per formare un aggregato morbido di fibre del filtro GFF e detriti della parete cellulare. Rimuovere un'aliquota di 200 microlitri del surnatante e immergerla in 800 microlitri di acetone al 90% freddo di ghiaccio.Trasferire il surnatante rimanente in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Misurare la clorofilla A estraibile mediante spettrofotometro a valori di lunghezza d'onda di 664 nanometri e 647 nanometri. Centrifugare il surnatante SUP rimanente per due minuti a 15.000 ×g a quattro gradi Celsius.Trasferire l'S in un tubo pulito da 1,5 millilitro per microcentrifuga, evitando il pellet costituito dalle membrane cellulari insolubili e dalle restanti fibre del filtro GFF. Questo lisato cellulare solubile può ora essere utilizzato nel saggio di attività della rubisco carbossilasi, che verrà illustrato successivamente. Per iniziare questo saggio, trasferire 125 microlitri di ciascun lisato solubile in un tubo da microcentrifuga con tappo a vite da 1,5 millilitri precedentemente raffreddato sul ghiaccio.Per i campioni di controllo negativo, aggiungere 125 microlitri di lisato solubile in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro con tappo a vite, ma non aggiungere il substrato. Successivamente eseguire reazioni duplicate per tutti i campioni e i controlli negativi. Preparare 10 millilitri di tampone per il saggio, fresco e raffreddato su ghiaccio.Aggiungere una quantità sufficiente del buffer per il saggio per tutti i campioni e i controlli negativi in un tubo da cinque millilitri. Da questo punto in poi, tutti i passaggi devono essere eseguiti sotto cappa. Aggiungere bicarbonato di sodio marcato con C 14 al buffer assegnato e mantenere il buffer sul ghiaccio.Rimuovere 10 microlitri del buffer del saggio contenente C 14 e diluirli in un millilitro di buffer del saggio invertito. Per miscelare, aggiungere 100 microlitri della miscela diluita a tre millilitri di cocktail per conteggio scintillometrico Bios Safe 2 in un vial per scintillazione e capovolgere per miscelare. Misurare i conteggi di C 14 con un contatore Beckman LS 6,500; i conteggi scintillometrici devono essere superiori a 18.000 conteggi al minuto prima di proseguire con il saggio.Una volta aggiunta una quantità sufficiente di bicarbonato di sodio marcato con C 14 al buffer del saggio, trasferire le provette in un bagno asciutto preriscaldato a 25 gradi Celsius e incubare per tre-cinque minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di buffer del saggio ai lisati e incubare a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, aggiungere il ribulosio bifosfato a ciascun campione e lasciare procedere la reazione per cinque-dieci minuti a 25 gradi Celsius.Per arrestare la reazione, aggiungere 100 microlitri di acido probiotico al 100%, centrifugare per un'ora a 2000 ×g per rimuovere il C14 non incorporato. Infine, trasferire il volume totale dei campioni in vial per scintillazione contenenti tre millilitri di bios. Aggiungere due millilitri di cocktail per conteggio a scintillazione e determinare i conteggi al minuto della frazione stabile all'acido.Prodotti finali mediante conteggio con scintillazione. È stata utilizzata una coltura di arricchimento per isolare nuovi protisti fototrofi e mistotrofi adattati al freddo dal lago antartico Bonnie a tre profondità diverse. Sono stati utilizzati diversi tipi di mezzi di crescita per selezionare una maggiore diversità di organismi: mezzo BBMF due si, mezzo marino e mezzo BG 11.La concentrazione di nutrienti e la radiazione fotosinteticamente attiva o PAR mostrate in questa tabella rappresentano le condizioni al momento del prelievo del campione. L'ispezione visiva dei colture arricchite mediante microscopia ottica ha rivelato che le colture erano dominate da protisti fototrofi, come indicato dalla presenza del pigmento clorofilliano nella maggior parte delle cellule. Le colture contenevano inoltre una varietà di morfologie cellulari, a seconda della profondità di campionamento da cui era stato ottenuto l'inoculo e del tipo di mezzo utilizzato nella coltura.Le velocità massime dell'attività della carbossilasi catalizzata dall'enzima rubis sono state misurate nelle colture arricchite come indicatore della fissazione del carbonio. L'abbondanza potenziale di clorofilla A è stata inoltre monitorata come stima della biomassa dei protisti fototrofi, come mostrato qui.Nonostante la coltivazione di tutte le colture alla stessa temperatura, il potenziale di fissazione del carbonio e la biomassa fototrofica variano notevolmente tra le colture arricchite. L'attività massima della rubis O è stata osservata nelle colture arricchite quattro e sei cresciute in mezzo BBM e nelle colture arricchite 13 e 14 cresciute in mezzo BG11. Al contrario, le colture 1921 e 23 arricchite nel mezzo di crescita F2 hanno mostrato attività massime della carbossilasi da quattro a 34 volte inferiori.Queste differenze non erano dovute a livelli più bassi di biomassa nelle colture F2, poiché l'attività della carbossilasi è stata espressa in base alla clorofilla a. Inoltre, un'analisi di correlazione di Pearson ha rivelato che l'attività della rubisco non era correlata alla concentrazione di clorofilla a. Le colture BBM sono state inoculate con acqua di lago prelevata a sei metri e a quindici metri.Il recinto di arricchimento numero cinque ha mostrato i livelli più elevati di clorofilla A, mentre tutte le altre colture hanno mostrato concentrazioni relativamente basse di clorofilla a, indipendentemente dall'attività dell'enzima rubis. Una volta acquisite, le tecniche di campionamento del lago richiedono circa due ore per essere eseguite. A seconda del numero di campioni prelevati, il saggio della carbossilasi richiede anch'esso circa due ore se eseguito correttamente. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il saggio dell'attività enzimatica eterotrofa, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio a quale profondità si verifica l'eterotrofo. Bene, dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come raccogliere campioni di lago, arricchirli per la produzione e sottoporli a saggio per l'attività della carbossilasi rubis.

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Fonte: Villela, H. D. M. , et al. Prospezione di ceppi microbici per la biorimediazione e lo sviluppo di probiotici per la ricerca e la conservazione dei metaorganismi. J. Vis. Esp. (2019)Questo video dimostra l'isolamento selettivo dei batteri marini degradanti del petrolio arricchendo campioni di acqua di mare su mezzi a base di petrolio, permettendo il recupero di ceppi puri con potenziali applicazioni nella biorimediazione del petrolio greggio e nella pulizia ambientale.

Arricchimento selettivo e isolamento di batteri marini degradanti del petrolio da campioni di acqua di mare

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Raccolta, isolamento e di arricchimento di batteri naturalmente presenti magnetotactic dall&#39;ambiente

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Emissione di fluorescenza indotta dal laser (L.I.F.E.) come nuovo strumento non invasivo per le misurazioni in-situ dei biomarcatori in Habitat criosferici

L'obiettivo di questo documento è quello di descrivere in dettaglio le migliori pratiche per la produzione di terreni per microrganismi anaerobici fastidiosi acquisiti da un ambiente. Questi metodi aiutano a gestire le colture anaerobiche e possono essere applicati per supportare la crescita di microrganismi non coltivati elusivi, la "materia oscura microbica".

Un insieme di mezzi di comunicazione simulati informati in situ per la coltura di microrganismi anaerobici acquisiti nell'ambiente

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Ecosistema modello basato sull'agarosio per la coltivazione di metanotrofi in un gradiente contatore metano-ossigeno

Scopri come isolare eucarioti microbici dal Lago Bonney in Antartide e valutarne la fissazione del carbonio mediante saggi radioisotopici per l'attività della RubisCO. Questo metodo rivela la diversità metabolica.

Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio (Video) | JoVE Journal

Istituzione di microbiche colture di arricchimento eucariotiche da un chimicamente Stratificati Antarctic Lake e valutazione del potenziale fissazione del carbonio

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