L'utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Ciao e benvenuto nel Gruppo di Biologia Strutturale e Funzionale delle Membrane. Mi chiamo Martin Caffery. Questo è un altro di una serie di articoli sulla cristallizzazione delle proteine di membrana per la determinazione strutturata utilizzando il metodo della fase cubica in meso o lipica.

Nel primo articolo, JoVE 1 7 1 2, abbiamo dimostrato come viene preparata la fase cubica carica di proteine e come la fase misa viscosa e appiccicosa viene dispensata manualmente in piastre sandwich di vetro per prove di cristallizzazione. Questo articolo video descriverà i metodi per l'utilizzo di un robot di cristallizzazione in meso. Un robot offre i vantaggi della velocità, dell'accuratezza, della miniaturizzazione di precisione e della capacità di lavorare per lunghi periodi in condizioni scomode, come al buio o a basse temperature.

I robot, se usati correttamente, possono migliorare notevolmente la produttività della struttura delle proteine di membrana e la ricerca sulla funzione. In questo articolo video, dimostriamo l'uso di tre robot disponibili in commercio. Il primo robot è stato sviluppato nel gruppo di biologia strutturale e funzionale delle membrane ed è descritto in dettaglio nel primo punto di riferimento.

Gli altri due sono stati resi disponibili di recente e sono inclusi qui per completezza. La preparazione della piastra di cristallizzazione L'impostazione per eseguire una prova di cristallizzazione in modo robotico inizia con la preparazione della piastra di base della piastra di cristallizzazione a sandwich di vetro, descritta in dettaglio in riferimento alla piastra di base, deve essere prima siloizzata e il distanziatore a doppio bastoncino perforato che crea i pozzetti deve essere applicato alla piastra. I materiali necessari per questo sono mostrati qui.

Includono una piastra di base per la cristallizzazione del vetro, una soluzione di distanziamento a doppia stecca perforata, un fazzoletto di carta a rullo o brayer e un becher di acqua UE. Il piatto viene posizionato su un tovagliolo di carta su un piano di lavoro. Vengono applicate alcune gocce di soluzione silente e poi distribuite uniformemente sulla superficie della lastra con un fazzoletto di carta.

La piastra viene lavata dalla soluzione di emulsione immergendola completamente in un becher d'acqua. Il piatto viene tolto dal becher posto su un tovagliolo di carta asciutto. Il lato siloizzato rivolto verso l'alto e la sua superficie esposta viene asciugata strofinando leggermente con carta assorbente.

Successivamente, il coperchio protettivo sul distanziatore a doppio bastoncino perforato viene rimosso e il distanziatore viene applicato sulla superficie siloizzata della lastra di vetro. È importante che il distanziatore sia posizionato correttamente sulla piastra di base con l'angolo superiore sinistro e i due lati adiacenti del distanziatore e della piastra coincidenti. Un rullo o un braciere viene utilizzato per appiattire il distanziatore sulla piastra di base e per creare una tenuta ermetica tra di loro.

Tra parentesi, notiamo che le piastre siloizzate complete di distanziatori forati sono disponibili in commercio come descritto nella sezione di riferimento. Dopo aver preparato la piastra di base di cristallizzazione, passiamo quindi all'impostazione e all'utilizzo del robot in meso. Come notato in quanto segue, dimostriamo l'uso di tre nei robot meso.

In tutti i casi mostrati, i robot sono installati e utilizzati in una stanza a temperatura controllata impostata a 20 gradi Celsius nel robot meso uno, il primo nel robot meso ad essere dimostrato in questo video. L'articolo è stato sviluppato nel laboratorio del PI ed è ora disponibile in commercio. Tutti i dettagli sono disponibili nella sezione di riferimento.

Di seguito sono illustrati i materiali e le attrezzature necessarie per l'impostazione robotizzata di una prova di cristallizzazione. Includono un quaderno di laboratorio, una malattia carica di proteine, preparato al momento come descritto nella legge dell'articolo 1 7 1 2 e contenuto in una siringa di Hamilton. Piastre di base siloizzate con distanziatori e vetro di copertura, bottiglia d'acqua e fazzoletti abbinati e il robot in miso.

La prima vista è del robot con il ponte libero. La vista successiva è del robot completo di stazione di parcheggio dell'umidificatore, piastra di base di cristallizzazione e blocco di pozzi profondi contenente soluzioni precipitanti. Iniziamo la configurazione posizionando la piastra di base sul ponte del robot.

Ha una propria piattaforma, chiaramente contrassegnata con posizioni dei pozzetti ai fini dell'allineamento della piastra di base. La targhetta deve essere chiaramente etichettata a scopo di identificazione. Il blocco di 96 pozzetti contenente soluzioni precipitanti è fissato nella propria piattaforma sul ponte del robot accanto alla piastra di cristallizzazione.

Il blocco si apre staccando con cura il tappo di plastica del soffitto. Il flusso di umidità dall'umidificatore è diretto a fluire sopra e attraverso la piastra di base sul ponte del robot Impostazione del robot. Il robot viene inizializzato seguendo le istruzioni del produttore.

Non lo dimostreremo in dettaglio qui perché i protocolli esatti cambieranno nel tempo. Essenzialmente ciò che accade durante l'inizializzazione è che il braccio di erogazione della mease sul robot è dotato di posizioni di riferimento in tre direzioni ortogonali, x, Y e Z.Successivamente, la fase meza carica di proteine in una siringa Hamilton completa di ago di dispensazione è attaccata al braccio uno dei dettagli completi del robot su come preparare la fase meza e la siringa sono descritti in Jo dell'articolo 1 7 1 2 e in uno di riferimento, La punta dell'ago della siringa di erogazione deve ora essere allineata con la parte inferiore e il centro del pozzetto più in alto nell'angolo sinistro della piastra di cristallizzazione. Ciò corrisponde all'identificatore del pozzo A uno che si allinea con il fondo del pozzo A uno come primo ordine del giorno.

Questo viene fatto regolando l'altezza o la coordinata Z dopo il braccio di erogazione mentre osservo quanto la punta dell'ago si avvicina al fondo del pozzetto. Il fatto che la punta tocchi appena il fondo del pozzetto può essere giudicato muovendo manualmente la piastra da un lato all'altro sulla piattaforma mentre si regola leggermente l'altezza del braccio di erogazione, la coordinata Z del braccio di erogazione in cui la punta entra in contatto con la piastra viene inserita nel computer l'erogazione è programmata per avvenire con la punta dell'ago a diversi micrometri da questa posizione Z di riferimento, che corrisponde alla superficie della piastra di base. Il robot viene quindi attivato per eseguire una serie di passaggi richiesti dall'utente per posizionare la punta dell'ago al centro del pozzetto A.

La coordinata XY di riferimento del braccio di dosaggio, dove è centrato il puntale, è memorizzata nel computer che controlla il robot. Viene utilizzato per definire il centro dei pozzetti rimanenti sulla piastra. Dopo aver impostato queste coordinate di riferimento nel computer, il braccio di erogazione della masticazione viene istruito a tornare alla posizione iniziale, adescando la siringa.

La siringa di erogazione deve ora essere adescata. Questo viene fatto per garantire che la masticazione fresca riempia l'ago di erogazione e che il primo pozzetto sulla piastra riceva il suo pieno complemento di mastice. C'è un comando di adescamento nel programma che esegue l'attivazione del robot.

Fa avanzare gradualmente lo stantuffo della siringa sotto il controllo dell'utente. Mentre ciò accade, la punta dell'ago viene esaminata per verificare che la fase di meza estrusa appaia venga rimossa con un fazzoletto. Questo completa il processo di adescamento facendo funzionare il robot.

Il robot è ora pronto per funzionare in modalità automatica avviando la corsa. Il programma XAP del robot avvia un ciclo di fasi di lavaggio in cui le punte di erogazione del precipitante sul braccio due del robot vengono lavate e sono preparate ad aspirare le soluzioni precipitanti dal blocco del pozzo profondo attivando la funzione di erogazione sul robot mette in moto, il caricamento sequenziale dei pozzi con la mease carica di proteine primi otto pozzi alla volta, seguito da soluzioni precipitose tra le consegne. Il braccio di erogazione della mease ritorna in una posizione di parcheggio in cui l'estremità dell'ago viene posta in una spugna inumidita per evitare che la mease sulla punta si secchi.

Più comunemente, i valori utilizzati nelle prove di cristallizzazione effettuate nella membrana. Il gruppo di biologia strutturale e funzionale è composto da 50 nanolitri di mease e 800 nanolitri di soluzione precipitante. Il programma che esegue il robot in questa dimostrazione è stato impostato in modo che i due bracci si muovano contemporaneamente.

In questo modo, è possibile completare il caricamento di una piastra a 96 pozzetti con mease e precipitante in cinque minuti. Immediatamente la piastra viene riempita e i bracci del robot sono tornati alle loro posizioni di parcheggio. La piastra viene rimossa dal ponte del robot e posizionata su una superficie piana e solida.

Un vetro di copertura viene adagiato delicatamente sulla parte superiore della piastra di base a contatto con la superficie adesiva superiore del distanziatore. È importante assicurarsi che tutti i 96 pozzetti siano completamente coperti, che il vetro di copertura sia allineato perpendicolarmente alla piastra di base e che nessuno dei vetri di copertura si estenda oltre l'ingombro della piastra di base. Un rullo o un braciere viene utilizzato per creare una tenuta ermetica e uniforme tra il vetro di copertura e il distanziatore.

La piastra deve essere ispezionata in questa fase per essere sicuri che l'installazione sia andata come dovrebbe. Quello che si sta cercando è un uovo fritto in padella. In ogni pozzo, il giogo dell'uovo corrisponde alla fase di meza.

L'albume dell'uovo è la soluzione precipitante e il bordo della padella è il perimetro della cristallizzazione. Beh, idealmente, i tre sono concentrici. La piastra è ora pronta per essere collocata in un'area di stoccaggio a temperatura controllata per la crescita dei cristalli.

Se non devono essere installate altre piastre, il blocco del precipitante deve essere rimosso dal ponte del robot, adeguatamente sigillato e rimesso in magazzino. La siringa contenente la mease viene rimossa dal braccio di erogazione del robot, smontata nelle sue varie parti, tra cui ago di erogazione e feriale. Lavato accuratamente con metanolo e asciugato in preparazione per il prossimo utilizzo in Meso robot due zanzare LCP.

Il prossimo video mostra il robot LCP a zanzara che può essere utilizzato nell'impostazione di prove di meso cristallizzazione. Incorpora un sistema di erogazione in fase meph simile a quello descritto in precedenza in questo articolo. Per il robot uno, invece, il precipitante viene erogato utilizzando puntali monouso.

Lo strumento stesso è mostrato qui. Comprende un ponte su cui la piastra di cristallizzazione e il blocco precipitante collocano una camera finestrata per il controllo dell'umidità. In questa vista, le finestre della camera di umidità sono state aperte: una bobina con punte di erogazione, un braccio di erogazione mease, un sensore basato su laser per stabilire la posizione dell'ago di erogazione della fase meph.

Una piattaforma rialzata su cui si trova la piastra di cristallizzazione, una piattaforma incassata per sostenere il blocco del vaglio precipitante. In questa sequenza, il robot ha visto passare attraverso una sequenza di inizializzazione di azioni quando lo strumento viene acceso. Il software di programmazione viene utilizzato per impostare lo strumento per lavorare con particolari piastre di cristallizzazione e blocchi di precipitante e per erogare volumi impostati di mease e precipitante in una sequenza specificata.

Tali dettagli sono forniti dal produttore e non verranno mostrati qui. L'uso del robot per impostare una piastra di cristallizzazione inizia come segue, Una siringa di Hamilton completa di ago e riempita di masi carica di proteine viene preparata come descritto sopra sotto in meso robot one e in Jo di 1 7 1 2. La siringa è bloccata in posizione sotto il braccio di erogazione del robot.

Le coordinate X e y dell'ago sulla siringa di erogazione vengono stabilite utilizzando il sensore laser montato sul ponte. Questo è un passaggio importante necessario per garantire che la malattia venga erogata accuratamente al centro di ciascun pozzetto sulla piastra di cristallizzazione. Con il semplice tocco di un pulsante sul pannello di controllo, la siringa è pronta ad espellere la malattia dalla punta dell'ago.

La masticazione estrusa viene quindi rimossa con un fazzoletto in preparazione all'utilizzo del robot per caricare i pozzetti prima di montare la piastra di cristallizzazione sul ponte del robot. La superficie della piattaforma viene inumidita con alcune gocce d'acqua per tenere in posizione la piastra. Per capillare, il coperchio di protezione viene rimosso dalla piastra e la placca viene posizionata saldamente sulla sua piattaforma per garantire una buona aderenza.

Ci sono tre fiduciali sulla piattaforma su cui i tre pozzetti angolari vengono centrati presto per garantire il corretto posizionamento della piastra rispetto alla punta dell'ago di erogazione, lo strumento è ora pronto per entrare in un ciclo di configurazione. Questo inizia con una seconda fase di adescamento in cui Mease viene erogato su una piccola lastra di vetro immediatamente prima di passare al caricamento della lastra con Mease fresco. In questa sequenza, vediamo il robot caricare prima con mease, una colonna verticale di otto pozzetti sulla piastra, e poi utilizzare le punte usa e getta per erogare la soluzione precipitante sopra il bolo mease.

Questo processo viene ripetuto 11 volte lungo la lunghezza della piastra fino a riempire tutti i pozzetti. L'intero processo richiede circa cinque minuti per essere completato. In questo particolare video, in ogni pozzetto sono stati erogati 50 nanolitri di Mease e 800 nanolitri di soluzione precipitante.

La piastra riempita viene rimossa dalla piattaforma del robot posta su un banco. Viene applicato il vetro di copertura e la piastra viene sigillata con un reggiseno come descritto sopra in miso robot one. La piastra, correttamente etichettata, può ora essere collocata in un ambiente a temperatura controllata per la crescita dei cristalli nel robot Meso tre, il Griffin LCP.

Questo video finale mostra il robot LCP Griffin in uso durante le prove di mesocristallizzazione. Il Griffin incorpora un sistema di erogazione in fase meph simile a quello descritto sopra per il robot uno. In questo caso, tuttavia, tutte le 96 soluzioni precipitanti vengono erogate contemporaneamente.

Lo strumento stesso è mostrato qui. Comprende un ponte su cui si trovano la piastra di cristallizzazione e il blocco precipitante, un braccio di erogazione mease e una testa di punta Phoenix 96. Per l'erogazione di soluzioni precipitanti, il robot in azione viene mostrato in questa sequenza video finale.

La testa della punta 96 viene prima caricata con una soluzione precipitante. Viene fornito un ritardo definito dall'utente per facilitare l'aspirazione di precipitanti viscosi. La fase MEA viene erogata in sequenza nei 96 pozzi in un processo che richiede circa un minuto per essere completato.

Infine, la testa a 96 punte eroga simultaneamente tutte le 96 soluzioni precipitanti sopra i boli della fase MEA nei pozzetti di cristallizzazione. L'intero processo di caricamento delle lastre viene completato in due minuti. La piastra riempita viene rimossa dal piano del robot e la piastra viene sigillata con un vetro di copertura e posta in stoccaggio in condizioni di temperatura controllata per la crescita dei cristalli.

I prossimi passi nel processo complessivo di determinazione strutturata mediante cristallografia macromolecolare sono la raccolta e il crioraffreddamento dei cristalli e la registrazione e l'elaborazione della diffrazione dei raggi X da essi. Questi argomenti sono trattati in articoli di lavoro separati in questa serie.