Name: Lutilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine di membrana in mesofasi lipidici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 21 s
Description: Scopri la cristallizzazione robotizzata ad alto throughput di proteine di membrana in mesofasi lipidiche. Questo metodo automatizzato migliora velocità, precisione e riproducibilità nella ricerca strutturale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ci sono molti che hanno contribuito a questo lavoro e la maggior parte sono della membrana Biologia Strutturale e Funzionale del Gruppo, sia i membri passati e presenti. A tutti rivolgiamo i nostri più sentiti ringraziamenti e apprezzamento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), il National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e 7 ° PQ CM0902 Azione COST.

1. Preparazione della piastra di cristallizzazione Impostazione di fare un processo di cristallizzazione robot inizia con la preparazione della piastra di base della piastra di cristallizzazione vetro sandwich (Figura 2), descritti in dettaglio in riferimento 2. La piastra di base deve prima essere silanizzata e il perforato doppio bastone distanziatore che crea i pozzetti, deve essere applicata alla piastra. I materiali e le forniture necessarie per questo sono dettagliati in Materiali. <ol><li> Posizionare la piastra su un tovagliolo di carta, applicare alcune gocce di soluzione di silanizzazione e distribuirlo uniformemente su tutta la superficie della piastra con un fazzoletto di carta. </li><li> Togliere l&#39;eccesso di soluzione silanizzazione immergendo la lastra in un bicchiere d&#39;acqua. </li><li> Prendere la piastra di fuori del bicchiere, posarlo su un tovagliolo di carta asciutto, lato silanizzata, e asciugare la superficie esposta strofinando leggermente con un tovagliolo di carta. </li><li> Rimuovere la pellicola protettiva sul forato, doppio bastone distanziatoree applicare il, lato adesivo distanziatore verso il basso, alla superficie asciutta e silanizzata della lastra di vetro. Assicurarsi che il distanziale è posizionata correttamente sulla piastra di base, con l&#39;angolo superiore sinistro e due lati adiacenti del distanziale e la piastra, coincidente. </li><li> Utilizzare un rullo o brayer di appiattire il distanziatore sul basamento e creare una chiusura a tenuta tra loro. </li></ol> Premontati piastre sono disponibili in commercio (HR3-151, Hampton Ricerca; MD11-55-100, dimensioni molecolari e LCP96T-UVP70U, Swissci). Per ragioni di costo, si preferisce montare i piatti stessi seguendo il protocollo sopra. 2. Nel Meso Robot 1 Il primo robot meso essere dimostrata in questo articolo video è quello attualmente in uso nella MS e FB Group (Figura 3). I dettagli completi del robot può essere trovato in Materiali e nella sezione di riferimento 5. I materiali e equipment tenuti a istituire un processo di cristallizzazione uso del robot sono riportati in dettaglio Materiali. <ol><li> Posizionare la piastra di base con distanziale preparato in sezione 1 sul ponte del robot. Essa ha una propria piattaforma contrassegnati con posizioni anche per finalità di base piastra di allineamento. La piastra deve essere etichettati per l&#39;identificazione. </li><li> Fissare il blocco a 96 pozzetti precipitante nella propria piattaforma sul ponte del robot vicino alla piastra cristallizzazione. </li><li> Aprire il blocco con attenzione da staccando il tappo di plastica di chiusura. </li><li> Accendere l&#39;umidificatore e dirigere il flusso di aria umida sopra e attraverso il basamento sul ponte del robot. L&#39;umidificatore è stato dimostrato per ridurre l&#39;evaporazione della soluzione precipitante e migliorare la riproducibilità tra la piastra 5 cristallizzazione. Può essere attivata prima di set-up pre-umidificare l&#39;ambiente zona quando l&#39;umidità relativa è bassa, o in altro modo, poco prima della somministrazione di mesofase inizio. </li><li> Inizializzare il robot seguendo le istruzioni del produttore. Istruzioni specifiche dello strumento non sarà descritto qui in dettaglio, perché le procedure esatte cambiano nel tempo. Essenzialmente, ciò che accade durante l&#39;inizializzazione è che l&#39;erogazione mesofase braccio del robot è dotato di posizioni di riferimento in tre direzioni ortogonali X, Y e Z. </li><li> Fissare la proteina-carico mesofase in una siringa Hamilton, completo di erogazione ago, a braccio 1 del robot (Figura 3). Tutti i dettagli su come preparare il mesofase e come caricarlo nella siringa sono stati descritti in Riferimenti 3,7-10. </li><li> Rimuovere il coperchio di protezione superiore dal distanziale sulla cristallizzazione basamento e allineare i pozzetti sulla piastra con fiducial sulla piastra base piattaforma. Nota, ai fini di questo video, il coperchio di protezione è stato lasciato sul posto per aiutare il visualizzatore durante la fase di allineamento. </li><li> Allineare la punta dell&#39;ago della syring erogazionee con il fondo del pozzo alto nell&#39;angolo sinistro della piastra di cristallizzazione (Well A1). Questo viene fatto occhio regolare l&#39;altezza o coordinata Z del braccio di erogazione mentre si guarda come chiudere la punta dell&#39;ago viene al fondo del pozzo. Che la punta si sfiora il fondo del pozzo può essere giudicato spostando la piastra da lato a lato sulla piattaforma pur sempre leggermente regolare l&#39;altezza del braccio di erogazione. </li><li> Inserire nel computer la coordinata Z del braccio di distribuzione in cui i contatti punta il piatto. Erogazione è programmata per avvenire con la punta dell&#39;ago 80 micrometri da questo riferimento Z-posizione che corrisponde alla superficie della piastra di base. </li><li> Posizione dell&#39;occhio la punta dell&#39;ago al centro del Well A1. Conservare nel computer di controllo del riferimento X, coordinata Y del braccio di erogazione in cui è centrata la punta. Questo coordinate viene utilizzato per definire il centro rimanenti pozzetti sulla piastra. </li><li> Prime la siringa con il comando appropriato nel computer robot affinché mesofase fresca riempie l&#39;ago di erogazione e che i pozzetti prima e le successive ricevono il loro complemento completo di mesofase. Pulire mesofase estruso sulla punta dell&#39;ago con un fazzoletto. </li><li> Avviare il Run Robot (X-AP) programma di avviare un ciclo di lavaggio passaggi in cui vengono lavati i suggerimenti precipitanti di erogazione sul braccio 2 del robot e sono pronti per aspirare le soluzioni dal blocco precipitante. </li><li> Attivare la funzione di distribuzione del robot per mettere in moto il caricamento sequenziale di pozzi con proteina-mesofase carico (di solito 50 nl) prima, una colonna di otto pozzi alla volta, seguita da soluzioni precipitanti (generalmente 800 nl). Tra colonne di carico, i rendimenti erogazione braccio mesofase ad una posizione di parcheggio dove si trova l&#39;estremità dell&#39;ago in una spugnetta umida per impedire mesofase sulla punta si secchi. Il processo di erogazione mesofase e precipitante viene ripetuto11 volte attraverso la piastra finché la piastra viene riempito. Il caricamento di una piastra a 96 pozzetti con mesofase e precipitante prende 5 minuti per completare. </li><li> Non appena la piastra viene riempito e le braccia del robot sono ritornati nelle loro posizioni parco, rimuovere la piastra dal ponte del robot e posizionarlo su una superficie piana solida. </li><li> Immediatamente, sigillare la piastra con un coperchio di vetro per ridurre il tempo-dipendenti cambiamenti nella composizione ben. È importante garantire che tutti i 96 pozzetti sono integralmente coperti, che il coperchio di vetro è allineato quadrata con la piastra di base e che nessuno dei coprioggetti estende oltre l&#39;ingombro del basamento. Un rullo o brayer viene utilizzato per creare una tenuta e una tenuta uniforme tra il coperchio di vetro e il distanziale. </li><li> Controllare la piastra per essere sicuri che il set up è andato come dovrebbe. Ciò che si è alla ricerca di un &#39;uovo fritto in padella&#39; aspetto in ogni pozzetto. Il tuorlo di uovo fritto corrisponde al mesofase. Il bianco dell&#39;uovo è la soluzione molto precipitantee sul bordo della padella è il perimetro della cristallizzazione bene. Idealmente, i tre sono concentrici. </li><li> Porre la piastra in una temperatura controllata deposito per la crescita di cristalli. </li><li> Se non ci sono più le piastre da istituire, rimuovere il blocco precipitato dal ponte del robot, che sigilla ermeticamente e rimetterlo in deposito. </li><li> Rimuovere la siringa contenente il mesofase dal braccio di erogazione del robot, smontare e lavare le sue parti compresi dell&#39;ago erogatore e boccola, accuratamente con metanolo ed asciutto in preparazione per l&#39;uso successivo. </li></ol> 3. Nel Meso Robot 2. Mosquito LCP Il Mosquito LCP robot (Figura 4) comprende un distributore mesofase simile a quello utilizzato dal robot 1. In contrasto con Robot 1, eroga precipitante per mezzo di puntali monouso. Software di programmazione viene utilizzato per impostare lo strumento per lavorare con piatti particolari e cristallizzazione precipitblocchi di formica, e di dispensare volumi definiti dall&#39;utente di mesofase e precipitante in una sequenza specificata. Tali dettagli sono forniti dal produttore e non verrà qui descritto. <ol><li> Preparare una siringa Hamilton, completo di ago e riempito con proteina-carico mesofase, come descritto sopra in Robot 1 e all&#39;articolo JoVE 1712 1. </li><li> Fissare la siringa in posizione sul braccio del robot di erogazione. </li><li> Utilizzare la piattaforma ha montato sensore laser per stabilire le coordinate X e Y del dell&#39;ago sulla siringa di erogazione. Questo è un importante passo necessario per assicurare che la mesofase viene erogato con precisione al centro di ciascun pozzetto della piastra. </li><li> Con il tocco di un pulsante sul pannello di controllo, adescare la siringa per espellere mesofase dall&#39;ago. Rimuovere mesofase estruso dalla punta dell&#39;ago con un tessuto in preparazione per l&#39;utilizzo del robot per caricare pozzi. </li><li> Prima di posizionare la piastra di cristallizzazione sul ponte del umida roboten la superficie della piattaforma con qualche goccia d&#39;acqua per aiutare a tenere la piastra in posizione per capillarità. </li><li> Togliere il coperchio di protezione dal distanziale sul vetro piastra di base e metterlo sulla sua piattaforma con decisione per garantire una buona aderenza. Utilizzare i tre fiducial sulla piattaforma per allineare i tre pozzetti angolari assicurando così il corretto posizionamento dei pozzetti sulla piastra rispetto alla punta dell&#39;ago erogatore. Lo strumento è comandato per immettere un ciclo di erogazione. </li><li> Il ciclo inizia con una fase di caricamento, secondo cui viene erogata mesofase su una piastra di vetro immediatamente prima di passare a caricare pozzetti con mesofase fresca. I carichi primo robot con mesofase una colonna verticale di 8 pozzetti sulla piastra e poi usa le punte monouso per erogare la soluzione precipitante in cima al bolo mesofase. Il processo viene ripetuto 11 volte lungo la lunghezza della piastra finché tutti i pozzetti vengono riempiti. L&#39;intero processo dura circa 5 minuti per essere completato. </li><li> Rimuoverela piastra riempito dalla piattaforma del robot e sigillarlo con un coperchio di vetro come descritto sopra in Robot 1. </li><li> Posizionare la piastra, etichettati, in un ambiente a temperatura controllata per la crescita di cristalli. </li></ol> 4. Nel Meso Robot 3. Gryphon LCP Il Gryphon LCP robot (Figura 5) incorpora un sistema simile mesofase erogazione a quello sopra descritto per robot 1 e 2. Ciò che distingue dalle altre due è che tutte le soluzioni precipitanti 96 vengono dispensate simultaneamente. <ol><li> Preparare la proteina-carico mesofase e caricarlo nella siringa di erogazione, come descritto sopra, sotto Robots 1 e 2, e all&#39;articolo JoVE 1712 1. </li><li> Fissare la siringa in posizione sul braccio del robot di erogazione. </li><li> Posizionare il blocco di soluzione precipitante e piastra cristallizzazione sul ponte del robot. </li><li> Caricare il 96-punta head con soluzioni precipitanti. Definito dall&#39;utente tempo di ritardo è prevista per facilitare l&#39;aspirazione precipitanti viscosi. </li><li> Comandare lo strumento per immettere un ciclo di erogazione. Il ciclo inizia con la mesofase erogato sequenzialmente nei 96 pozzetti in un processo che richiede circa 1 minuto per completare. Il 96-tip testa eroga quindi tutti 96 soluzioni precipitanti immediatamente sopra i boli mesofase nei pozzetti di cristallizzazione. L&#39;intero processo di caricamento delle lastre è finito in 2 min. </li><li> Rimuovere la piastra riempito dalla piattaforma del robot e sigillarlo con un coperchio di vetro come descritto sopra in Robot 1. </li><li> Posizionare la piastra, etichettati, in un ambiente a temperatura controllata per la crescita di cristalli. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Lo scopo di questo articolo il video è quello di dimostrare come impostare automaticamente le prove di cristallizzazione con un viscoso, proteine ​​di membrana-carico mesofase in vetro sandwich 96 pozzetti cristallizzazione piastre. L&#39;enfasi è sulla automazione attraverso l&#39;uso di robot specializzati che richiedono un minimo intervento manuale. Riproducibilità e precisione, in termini di volumi di mesofase e precipitante erogato e il posizionamento all&#39;interno del pozzo, è previsto quando viene utilizzato un robot. Questi sono importanti dal punto di vista di screening efficace delle condizioni che supportano crystallogenesis. Sono anche critico per il passo successivo nella pipeline di analisi che è di valutare la crescita di cristalli spesso fatto con apparecchiature di imaging. Destinazione finale o bolo è la chiave per il processo di imaging, e la disposizione irregolare e improprio del bolo nel pozzo di solito richiede l&#39;intervento dell&#39;utente per correggere e richiede tempo. Per scopi di illustrazione, esempi di lastre adeguatamente e correttamente caricati sono mostrati in Figura 6. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <html> Figura 1. Il diagramma di flusso sintetizza i passaggi necessari per la raccolta di produzione, e la crio-raffreddamento in cristalli membrana meso-coltivate proteine. Passi circondato dalla linea tratteggiata rossa sono al centro di questo articolo JoVE. I robot sono stati utilizzati per erogare soluzioni mesofase e precipitante nei passaggi 29-32. Da riferimento 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A pieno carico e sigillato a 96 pozzetti a piastra di vetro cristallizzazione. Ogni pozzetto contiene 50 fase cubica nl e 1 ul di soluzione precipitante. Per chiarezza, la fase cubica è stato macchiato con il Sudan rosso e la soluzione precipitante include blu di metilene. Da riferimento 5. _upload/4000/4000fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. La meso in robot (Robot 1). Il robot è dotato di due braccia. Braccio 1 dispensa la proteina carica di mesofase lipidico. Braccio 2 eroga soluzioni precipitanti. Durante il riempimento, la piastra a 96 pozzetti rimane fissato in posizione sul ponte del robot che si è stazionario. Le due braccia si muovono per fornire soluzioni mesofase e precipitante. Da riferimento 3. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La zanzara LCP robot (Robot 2). In contrasto Robot 1, il ponte del LCP Mosquito, su cui siede la piastra a 96 pozzetti e il blocco di soluzione precipitante, si sposta orizzontalmente durante il riempimento. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Il Gryphon LCP robot (Robot 3). Durante unaistituito, il distributore lipidico fase cubica si sposta per fornire proteine ​​carico mesofase sulla piastra a 96 pozzetti. Il ponte si traduce poi in orizzontale per posizionare la piastra sotto la testa precipitante punta soluzione. Tutte le soluzioni precipitanti 96 vengono dispensate simultaneamente. Immagine proveniente dal produttore ( <a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a> ) ed etichettati. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. A pieno carico e sigillato piastra a 96 pozzetti a sandwich di vetro (A) e pozzetti correttamente (B) e impropriamente (C, D) riempito con il meso in robot (Robot 1). L&#39;etichetta del codice a barre sulla piastra in A viene utilizzato per tenere traccia la piastra del dispositivo piastra incubatore / immagini. In pannelli BD, soluzione precipitante e mesofase sono contrassegnati P ed M, rispettivamente. L&#39;atteso &#39;uovo fritto su un piatto&#39;aspetto del bene in B è caratteristica di un correttamente e sigillato bene. In C, il precipitante è stato erogato nel pozzo impropriamente in una posizione decentrata ed è entrato in contatto con il distanziatore. In C, sembrerebbe anche che il volume della mesofase è meno di quanto dovrebbe essere. Un esempio di carico incompleta con soluzione precipitante è mostrato in D. Per scala, il diametro di tutti i pozzetti è di 6 mm.

<ol><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (45), e1712(2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. (49), e2501(2011).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Bio.l+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Bio.l Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Peddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+automated+system+for+crystallizing+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Autom.+Sci.+Eng%22%5BJournal%5D)">High-throughput automated system for crystallizing membrane proteins in lipidic mesophases.</a> IEEE Trans. Autom. Sci. Eng. 4, 129-140 (2007).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure-function+studies+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure-function studies using lipidic mesophases.</a> Biochem. Soc. Trans. 39, 725-732 (2011).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination%3A+use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 142, 108-132 (2003).</li>
<li>Gushchin, I., Reshetnyak, A., Borshchevskiy, V., Ishchenko, A., Round, E., Grudinin, S., Engelhard, M., Buldt, G., Gordeliy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+State+of+Sensory+Rhodopsin+II%3A+Structural+Determinants+for+Signal+Transfer+and+Proton+Pumping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Active State of Sensory Rhodopsin II: Structural Determinants for Signal Transfer and Proton Pumping.</a> J. Mol. Biol. 412, 591-600 (2011).</li>
<li>Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O., Saenger, W., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+angstrom+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 angstrom resolution.</a> Nature. 411, 909-917 (2001).</li>
<li>Grawert, T., Span, I., Eisenreich, W., Rohdich, F., Eppinger, J., Bacher, A., Groll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+reaction+mechanism+of+IspH+protein+by+x-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Probing the reaction mechanism of IspH protein by x-ray structure analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 1077-1081 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Crystallogr. 39, 604-606 (2006).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+cryo-cooling+crystals+of+membrane+proteins+grown+in+lipidic+mesophases+for+structure+determination+by+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography.</a> J. Vis. Exp. (67), e4001(2012).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo video che abbiamo dimostrato come utilizzare un robot per impostare automaticamente in prove di cristallizzazione meso in lastre di vetro da 96 pozzetti a sandwich con una proteina-mesofase carico lipidico. I robot utilizzati in questo lavoro sono stati progettati per includere una siringa di vetro spostamento positivo per la consegna accurata e riproducibile di volumi di nanolitri mesofase viscoso e appiccicoso, come originariamente descritto 7. Accuratezza e precisione sono le caratteristiche importanti di un robot. Tuttavia, queste caratteristiche sono solo buono come il grado di regolarità e di cui viene valutato le prestazioni del robot e taratura. Inutile dire che le prestazioni del robot deve essere valutato quando singole piastre vengono costituiti. Non è corretto pensare che il robot funzionerà senza problemi e di lasciare il robot per l&#39;esecuzione automatica. L&#39;operatore attento e attento dovrebbe essere in position notare da un suono o un aspetto quando qualcosa non funziona correttamente e di correggere immediatamente. Inoltre, ogni piastra deve essere attentamente controllata da occhio per uniformità di contenuto e non appena la piastra è sigillata e prima di essere messo fuori per prove di cristallizzazione. Questo richiede solo pochi secondi per eseguire e può essere eseguita mentre la piastra successiva viene caricata. Notare, per esempio, che i pozzetti particolari non sono adeguatamente riempiti può evidenziare il fatto che una certa punta di erogazione precipitante viene malfunzionamento. Se la consegna di mesofase essere visto per essere irregolare, il relativo elemento difettoso avrebbe bisogno di essere corretti immediatamente. Da notare questi problemi e fare le relative rettifiche durante il set up farà risparmiare tempo e materiali, tra cui lipidi prezioso e proteina di membrana. Se un imager viene utilizzato per monitorare la crescita dei cristalli, l&#39;accuratezza e la precisione possono essere monitorati durante l&#39;esposizione. Ad esempio, problemi sistematici con goccia o boloposizione dalla termocamera indicano che qualcosa non è giusto e che le azioni correttive da qualche parte a monte del protocollo è necessario. Per motivi di prestazioni affidabili, pertanto il robot deve essere calibrato a intervalli regolari e, se necessario. Calibrazioni dovrebbe includere il volume di precipitante e mesofase pronunciata quanto posizionamento bolo e precipitato nel pozzo. Ovviamente, per quanto possibile, la taratura deve essere effettuata utilizzando i volumi e materiali simili a quelli che verranno utilizzati in studi condotti nel periodo di riferimento l&#39;esercizio di controllo della qualità. Importante come calibrazione è così anche sta avendo in magazzino una quantità adeguata di parti del robot e forniture. Guasti catastrofici e inaspettati, blocchi e crash possono e si verificano. In tal caso, avendo a disposizione una punta di erogazione precipitante sostituzione, per esempio, potrebbe significare che un prezioso preparazione proteina di membrana viene utilizzata come dovrebbe enon è sprecato. Alcuni dei vantaggi di un robot includono il fatto che funzionerà sostanzialmente continuo e che non soffre di o &#39;lamentare&#39; affaticamento. Un robot può essere utilizzato anche in condizioni che non sono considerati human-friendly, come al buio, in condizioni di illuminazione e di condizioni ambientali controllate, ed a temperature estreme. I robot hanno dimostrato in questo articolo sono stati tutti utilizzati in condizioni ambientali a ~ 20 ° C. Tuttavia, ci sono proteine ​​e progetti che richiedono temperature non ambientali, luce controllata 11,12 e un ossidante o un ambiente riducente 13. Tutti questi possono essere soddisfatti, con relativa facilità, quando un robot cristallizzazione viene utilizzato. In un articolo precedente video JoVE abbiamo dimostrato come prove di cristallizzazione per il metodo in meso sono impostati manualmente 1. Il volume minimo di mesofase che può essere erogato affidabile a mano è limitata by manualità la acutezza visiva e costante della persona che l&#39;impostazione dei processi. Nella nostra esperienza, i volumi di mesofase a partire da 100 nl sono facilmente gestite. Sappiamo di un laboratorio in cui il volume predefinito erogato manualmente è di circa 40 nl. Tuttavia, volumi notevolmente più piccoli sono possibili usando un robot. Separatamente, abbiamo dimostrato che i volumi mesofase a partire da 550 picolitri può fare a meno robot 14. Da quel lavoro era chiaro che miniaturizzazione dal robot è possibile che, se attuato, porterebbe ad una notevole riduzione della quantità di proteina di membrana valore necessario per effettuare un processo di cristallizzazione. In questo articolo video, tre robot disponibili in commercio sono stati utilizzati per dimostrare high-throughput cristallizzazione della proteina di membrana con mesofasi lipidiche. Il primo di questi è stato sviluppato nel gruppo MS &amp; FB basata sulla nostra esperienza impostare manualmente prove, come descritto in JoVE 1712 1. Questo è lo strumentomento abbiamo più familiarità con e la maggior parte dell&#39;attuale articolo è dedicato al suo utilizzo. Gli altri due robot erano in dimostrazione nel MS &amp; Gruppo FB al momento è stato scritto l&#39;articolo e il filmato in questione è incluso qui nell&#39;interesse di completezza. Tutti e tre i robot utilizzano molto lo stesso sistema mesofase di erogazione, la caratteristica essenziale di che è un positivo siringa di vetro spostamento 5,7. Essi differiscono significativamente più rispetto alla consegna precipitante. Robot 1 e 2 può erogare contemporaneamente precipitante in 8 pozzetti, una singola colonna su una piastra cristallizzazione alla volta. Al contrario, Robot 3 dispensa tutti i 96 soluzioni precipitanti in una singola azione. Robot 2 è l&#39;unico strumento con puntali precipitanti di erogazione. Ci sono vantaggi e svantaggi associati con i diversi strumenti che dipendono dalla particolare applicazione, questi non saranno elaborati qui. Basti dire che tutti e tre di lavoro e hanno prodotto cristalli di meproteine ​​mbrane dal metodo in meso. I passi successivi nel processo generale di determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare sono di raccogliere e di crio-cool cristalli piatti installati come descritto in questo articolo video e di registrare e di processo diffrazione di raggi X da loro. Questi argomenti sono trattati in articoli separati Giove in questa serie 1,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Componenti </td></tr><tr><td> Brayer (rullo) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820937 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Siringhe a tenuta di gas </td><td> Hamilton </td><td> 81030 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Vetro coprioggetti </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Lastre di vetro </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Gryphon LCP Robot </td><td> Art Robbins </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> In meso robot </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Lab notebook </td><td> Vario </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Mosquito LCP Robot </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Forata a doppio bastone distanziatore nastro </td><td> Saunders Corporation (foro perforata) </td><td> su misura </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Soluzioni precipitante </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Acqua depurata </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Rain-X </td><td> Shell Car Care </td><td> 80199200 </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Siringa consigli </td><td> Hamilton </td><td> 7770-020 (calibro 22) </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Tessuti </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Borraccia </td><td> vario </td><td> NA </td><td> Reagente </td></tr></tbody></table>

l&#39;utilizzo di un robot per high-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Studi struttura-funzione di proteine ​​di membrana grande beneficio da avere disponibili ad alta risoluzione strutture 3-D del tipo dotato macromolecolare tramite cristallografia a raggi X (MX). Un ingrediente essenziale di MX è un rifornimento costante di diffrazione idealmente qualità cristalli. Il meso o in fase lipidica cubica (LCP) metodo per cristallizzare proteine ​​di membrana è uno dei diversi metodi disponibili per cristallizzare proteine ​​di membrana. Si fa uso di una mesofase bicontinue in cui crescere cristalli. Come metodo, ha avuto alcuni successi spettacolari in ritardo e ha attirato molta attenzione con i gruppi di ricerca ormai da molti interessati ad utilizzarlo. Una delle sfide connesse con il metodo è che il mesofase hosting è estremamente viscoso e appiccicoso, che ricorda un dentifricio di spessore. Quindi, erogazione manualmente in modo riproducibile in piccoli volumi in pozzi di cristallizzazione richiede abilità, pazienza e una mano ferma. Un protocollo per fare just che è stato sviluppato nel Membrane Strutturale e Funzionale Biologia (MS &amp; FB) Gruppo 1-3. Video Articoli Giove che descrivono il metodo sono disponibili 1,4. L&#39;approccio manuale a creare in meso studi presenta evidenti vantaggi con applicazioni speciali, quali l&#39;ottimizzazione cristallo e derivatizzazione. Ha, tuttavia soffre di essere un metodo con bassa produttività. Qui, dimostriamo un protocollo per l&#39;esecuzione di prove di cristallizzazione in meso robot. Un robot offre i vantaggi di velocità, accuratezza, precisione, miniaturizzazione e la possibilità di lavorare in continuo per lunghi periodi in quello che potrebbe essere considerato come condizioni ostili come al buio, in una atmosfera riducente o a temperature basse o alte. Un robot in meso, se usato correttamente, può migliorare notevolmente la produttività della struttura della membrana proteica e funzione di ricerca facilitando cristallizzazione, che è uno dei passi lenti nellacomplessiva struttura a pipeline determinazione. In questo articolo video, viene illustrato l&#39;utilizzo di tre robot disponibili in commercio in grado di dispensare la mesofase viscoso e appiccicoso integrale al crystallogenesis meso. Il primo robot è stato sviluppato in MS e FB Group 5,6. Gli altri due sono stati recentemente resi disponibili e sono inclusi per completezza. Una panoramica del protocollo in questo articolo è presentato in figura 1. Tutte le operazioni sono state effettuate a temperatura ambiente (~ 20 ° C) in condizioni ambiente.

Qui è descritto un approccio robotico per alta produttività cristallizzazione di proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici destinati determinazione della struttura macromolecolare usando cristallografia a raggi X. Tre robot capaci di gestire la viscoso e appiccicoso proteina-carico mesofase solidale al metodo vengono introdotti.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Gli studi struttura-funzione delle proteine di membrana traggono grande beneficio dalla disponibilità di strutture 3D ad alta risoluzione del tipo fornito attraverso...

Salve e benvenuti al Gruppo di Biologia Strutturale e Funzionale delle Membrane. Mi chiamo Martin Caffery. Questo è un altro articolo di una serie pubblicata su JOVE sulla cristallizzazione delle proteine di membrana per la determinazione strutturale mediante il metodo in meso o della fase cubica lipidica.Nel primo articolo, JoVE 1 7 1 2, abbiamo dimostrato come preparare la fase cubica contenente proteine e come dispensare manualmente la fase viscosa e appiccicosa di misa in piastre di vetro a sandwich per i tentativi di cristallizzazione. Questo articolo video descriverà i metodi per utilizzare un robot per la cristallizzazione in meso. Un robot offre i vantaggi della velocità, accuratezza, precisione, miniaturizzazione e della capacità di lavorare per periodi prolungati in condizioni scomode, come al buio o a basse temperature.I robot, se utilizzati correttamente, possono migliorare notevolmente la produttività della ricerca sulla struttura e funzione delle proteine di membrana. In questo articolo video, dimostriamo l'uso di tre robot disponibili in commercio. Il primo robot è stato sviluppato dal gruppo di biologia strutturale e funzionale delle membrane ed è descritto in dettaglio nella riferimento uno.Gli altri due sono diventati disponibili solo di recente e sono inclusi qui per completezza. La preparazione della piastra per cristallizzazione, necessaria per eseguire in modo robotizzato un esperimento di cristallizzazione, inizia con la preparazione della piastra di base della piastra per cristallizzazione a sandwich di vetro descritta in dettaglio qui di seguito: innanzitutto la piastra di base deve essere silanizzata e lo spaziatore perforato adesivo doppio deve essere applicato sulla piastra per creare le pozzette. I materiali necessari per questa procedura sono mostrati qui.Comprendono una piastra di base in vetro per la cristallizzazione, uno spaziatore perforato con doppio adesivo, una soluzione di sigillatura, carta assorbente o un rullo, e un becher di acqua ultrapura. La piastra viene posizionata su un tovagliolo di carta su un banco da laboratorio. Alcune gocce di soluzione sigillante vengono applicate e quindi distribuite uniformemente sulla superficie della piastra utilizzando un tovagliolo di carta.La piastra viene lavata dalla soluzione eccessiva di silanizzazione immergendola completamente in un becher d'acqua. La piastra viene rimossa dal becher e posta su un tovagliolo di carta asciutto, con il lato silanizzato rivolto verso l'alto, e la sua superficie esposta viene asciugata tamponando delicatamente con tovaglioli di carta.Successivamente, si rimuove il rivestimento protettivo dal distanziatore adesivo perforato e si applica il distanziatore sulla superficie silanizzata della piastra di vetro. È importante posizionare correttamente il distanziatore sulla piastra di base in modo che l'angolo superiore sinistro e i due lati adiacenti del distanziatore coincidano con quelli della piastra. Si utilizza un rullo o un brayer per appiattire il distanziatore sulla piastra di base e per creare una sigillatura stretta tra i due elementi.Per inciso, osserviamo che piastre a pozzetti complete di distanziatori forati sono disponibili in commercio, come descritto nella sezione dei riferimenti. Dopo aver preparato la piastra base per la cristallizzazione, passiamo ora alla configurazione e all'utilizzo del robot in meso. Come indicato di seguito, illustriamo l'uso di tre robot in meso.In tutti i casi mostrati, i robot sono configurati e utilizzati in una stanza con temperatura controllata impostata a 20 gradi Celsius nel meso robot uno, il primo meso robot dimostrato in questo video. L'articolo è stato sviluppato nel laboratorio del responsabile scientifico ed è ora disponibile in commercio. Dettagli completi sono disponibili nella sezione dei riferimenti.I materiali e l'attrezzatura necessari per impostare in modo robotizzato un esperimento di cristallizzazione sono mostrati qui. Comprendono un quaderno di laboratorio, una soluzione proteica, appena preparata come descritto nell'articolo JoVE 1 7 1 2 e contenuta in una siringa Hamilton. Piastrine di base silanizzate con distanziali e vetrini di copertura abbinati, una bottiglia d'acqua e fazzoletti di carta, e il robot in miso.La prima vista mostra il robot con il piano di lavoro libero. La vista successiva mostra il robot completo di stazione di parcheggio dell'umidificatore, piastra base per la cristallizzazione e blocco per pozzetti profondi contenente soluzioni di precipitante. Iniziamo il setup posizionando la piastra base sul piano del robot.Dispone di una propria piattaforma, chiaramente contrassegnata con le posizioni dei pozzetti per l'allineamento della piastra di base. La piastra deve essere etichettata in modo chiaro per facilitarne l'identificazione. Il blocco a 96 pozzetti contenente le soluzioni precipitanti è fissato sulla propria piattaforma situata sul piano del robot, accanto alla piastra per la cristallizzazione.Il blocco viene aperto rimuovendo con attenzione il cappuccio di plastica superiore. Il flusso di umidità proveniente dall'umidificatore viene indirizzato in modo da scorrere sopra e attraverso la piastra di base sulla piattaforma del robot durante la configurazione del robot. Il robot viene inizializzato seguendo le istruzioni del produttore.Non illustreremo questo in alcun dettaglio qui, poiché i protocolli esatti cambieranno nel tempo. Fondamentalmente, durante l'inizializzazione, al braccio dispensatore del robot vengono fornite posizioni di riferimento in tre direzioni ortogonali, x, Y e Z. Successivamente, la fase meza contenente la proteina, in una siringa Hamilton completa di ago dispensatore, viene fissata al braccio uno del robot; i dettagli completi su come preparare la fase meza e la siringa sono descritti nell'articolo JoVE 1 7 1 2 e nella referenza uno. La punta dell'ago della siringa dispensatrice deve ora essere allineata con il fondo e il centro del pozzetto più in alto nell'angolo sinistro della piastra per la cristallizzazione. Questo corrisponde all'identificativo del pozzetto A uno, allineandosi al fondo del pozzetto A uno come prima operazione.Questo viene fatto regolando l'altezza o la coordinata Z del braccio di dispensazione dopo aver dispensato, osservando quanto la punta dell'ago si avvicina al fondo del pozzetto. Si può valutare che la punta tocchi appena il fondo del pozzetto spostando manualmente la piastra da un lato all'altro sulla piattaforma, regolando al contempo in modo appena percettibile l'altezza del braccio di dispensazione; la coordinata Z del braccio di dispensazione in corrispondenza del contatto della punta con la piastra viene inserita nel computer. La dispensazione viene programmata in modo che la punta dell'ago si trovi a diverse micrometri da questa posizione Z di riferimento, che corrisponde alla superficie della piastra di base. Successivamente, il robot viene attivato per eseguire una serie di passaggi guidati dall'utente al fine di posizionare la punta dell'ago al centro del pozzetto A1.La coordinata di riferimento XY del braccio di dispensazione, in cui la punta è centrata, è memorizzata nel computer che controlla il robot. Viene utilizzata per definire il centro delle rimanenti pozzette sulla piastra. Dopo aver impostato queste coordinate di riferimento nel computer, al braccio di dispensazione viene impartito l'ordine di tornare alla posizione iniziale, preparando la siringa.È ora necessario eseguire la preparazione della siringa dosatrice. Questa operazione garantisce che il nuovo mease riempia l'ago dosatore e che il primo pozzetto della piastra riceva la quantità completa di mease. Nel programma che attiva il robot è presente un comando di preparazione.Provoca l'avanzamento progressivo del pistone nella siringa sotto il controllo dell'utente. Mentre ciò avviene, la punta dell'ago viene esaminata per verificare l'uscita della mease; la fase meza viene rimossa con un tessuto. Ciò completa il processo di spurgo del robot.Il robot è ora pronto per essere eseguito in modalità automatica avviando la procedura. Il programma Robot XAP inizia una serie di passaggi di lavaggio durante i quali le punte per la dispensazione del precipitante montate sul braccio due del robot vengono lavate e preparate per aspirare le soluzioni di precipitante dal blocco a pozzetti profondi; l'attivazione della funzione di dispensazione mette in moto il caricamento sequenziale dei pozzetti, iniziando con il mease contenente la proteina nei primi otto pozzetti alla volta, seguito dalle soluzioni di precipitante tra una somministrazione e l'altra. Il braccio dispensatore del mease ritorna in una posizione di parcheggio, dove l'estremità dell'ago viene inserita in una spugna inumidita per impedire al mease presente sulla punta di essiccarsi.Di solito, i valori utilizzati nei saggi di cristallizzazione eseguiti nel gruppo di biologia strutturale e funzionale sono 50 nanolitri di mease e 800 nanolitri di soluzione precipitante. Il programma che gestisce il robot in questa dimostrazione è stato configurato in modo che i due bracci si muovano simultaneamente.In questo modo, è possibile completare il caricamento di una piastra a 96 pozzetti con soluzione madre e precipitante in cinque minuti. Immediatamente dopo il riempimento della piastra, i bracci robotici tornano alle loro posizioni di parcheggio. La piastra viene rimossa dal piano del robot e posizionata su una superficie solida e piana.Un vetrino coprioggetto viene appoggiato delicatamente sulla piastra di base a contatto con la superficie adesiva superiore dello spaziatore. È importante assicurarsi che tutti e 96 i pozzetti siano completamente coperti, che il vetrino coprioggetto sia perfettamente allineato alla piastra di base e che nessuna parte del vetrino sporga oltre l'ingombro della piastra di base. Un rullo o un brayer viene utilizzato per creare un sigillo stretto e uniforme tra il vetrino coprioggetto e lo spaziatore.La piastra deve essere ispezionata a questo stadio per assicurarsi che l'allestimento sia stato eseguito correttamente. Ciò che si deve osservare è un aspetto simile a un uovo al tegamino. In ogni pozzetto, il tuorlo dell'uovo corrisponde alla fase meza.L'albume dell'uovo è la soluzione precipitante e il bordo della padella è il perimetro della cristallizzazione. Idealmente, i tre elementi sono concentrici. La piastra è ora pronta per essere collocata in un'area di stoccaggio con temperatura controllata per la crescita dei cristalli.Se non si devono preparare ulteriori piastre, il blocco del precipitante deve essere rimosso dal piano del robot, sigillato correttamente e riposto in archivio. La siringa contenente il mease viene rimossa dal braccio erogatore del robot, smontata nelle sue diverse parti, compresi l'ago erogatore e il ferial. Va lavata accuratamente con metanolo e asciugata in previsione del prossimo utilizzo nel robot In Meso due mosquito LCP.Questo prossimo video mostra il robot LCP per zanzare che può essere utilizzato nell'allestimento di prove di cristallizzazione in meso. Incorpora un sistema di dispensazione della fase meph simile a quello descritto in precedenza in questo articolo. Per il robot uno, tuttavia, il precipitante viene dispensato utilizzando punte monouso.Lo strumento stesso è mostrato qui. Include un piano su cui sono posizionati la piastra per la cristallizzazione e il blocco del precipitante, oltre a una camera con finestre per il controllo dell'umidità. In questa vista, le finestre della camera di umidità sono state aperte, insieme a una bobina con punte di dispensazione, un braccio di dispensazione per il mease, e un sensore a laser per determinare la posizione dell'ago di dispensazione della fase meph.Una piattaforma rialzata sulla quale poggia la piastra di cristallizzazione e una piattaforma incassata per contenere il blocco dello schermo precipitante. In questa sequenza, il robot ha eseguito una serie di operazioni di inizializzazione all'accensione dello strumento. Un software di programmazione viene utilizzato per configurare lo strumento per l'utilizzo con specifiche piastre di cristallizzazione e blocchi precipitanti, e per erogare volumi definiti di meato e precipitante secondo una sequenza specifica.Questi dettagli sono forniti dal produttore e non verranno mostrati qui. L'utilizzo del robot per preparare una piastra di cristallizzazione inizia come segue: una siringa Hamilton completa di ago e riempita con il mezzo contenente la proteina viene preparata come descritto in precedenza nella sezione relativa al robot in meso uno e in JoVE 1 7 1 2. La siringa viene fissata in posizione sotto il braccio di dispensazione del robot.Le coordinate X e Y dell'ago sulla siringa di dispensazione vengono stabilite utilizzando il sensore laser montato sul deck. Questo è un passaggio importante necessario per garantire che la mease venga dispensata con precisione al centro di ogni pozzetto della piastra di cristallizzazione. Premendo un pulsante sul pannello di controllo, la siringa viene preparata per espellere la mease dalla punta dell'ago.Il mease estruso viene quindi rimosso con un fazzoletto di carta, in previsione dell'utilizzo del robot per caricare le pozzette prima di montare la piastra di cristallizzazione sul supporto del robot. La superficie della piattaforma viene inumidita con alcune gocce d'acqua per mantenere la piastra in posizione. Per capillarità, il coperchio protettivo viene rimosso dalla piastra e la piastra viene posizionata con fermezza sul proprio supporto per garantire un buon aderente.Sulla piattaforma sono presenti tre punti fiduciali, posizionati al centro dei tre pozzetti agli angoli, per garantire un corretto allineamento della piastra rispetto alla punta della pipetta dosatrice; a questo punto lo strumento è pronto per entrare in un ciclo di configurazione. Questo inizia con un secondo passaggio di condizionamento, durante il quale viene dispensato mease su una piccola lastrina di vetro, immediatamente prima di procedere al caricamento della piastra con mease fresco. In questa sequenza, si osserva il robot mentre carica inizialmente il mease in una colonna verticale di otto pozzetti sulla piastra, e successivamente utilizza le punte monouso per dispensare la soluzione precipitante sopra il bolo di mease.Questo processo viene ripetuto 11 volte lungo l'intera lunghezza della piastra fino a quando tutti i pozzetti sono riempiti. L'intero processo richiede circa cinque minuti per essere completato. In questo particolare video, in ciascun pozzetto sono stati dispensati 50 nanolitri di Mease e 800 nanolitri di soluzione precipitante.La piastra riempita viene rimossa dalla piattaforma del robot posizionata sul banco di lavoro. Viene applicato il coprivetrino e la piastra viene sigillata con un reggiseno come descritto in precedenza nella sezione relativa al robot in miso uno. La piastra opportunamente etichettata può ora essere collocata in un ambiente a temperatura controllata per la crescita dei cristalli nel robot Meso tre, il Griffin LCP.Questo ultimo filmato mostra il robot Griffin LCP in azione durante l'allestimento di prove di cristallizzazione in meso. Il Griffin incorpora un sistema di dispensazione della fase meph simile a quello descritto sopra per il robot uno. In questo caso, tuttavia, tutte e 96 le soluzioni precipitanti vengono dispensate contemporaneamente.Lo strumento stesso è mostrato qui. Include un piano su cui poggiano la piastra per la cristallizzazione e il blocco del precipitante, un braccio per la dispensazione e una testina per punte Phoenix 96. Per la dispensazione delle soluzioni di precipitante, il robot in azione è mostrato in questa sequenza video finale.La testa con 96 punte viene caricata inizialmente con la soluzione precipitante. Viene impostato un ritardo definito dall'utente per facilitare l'aspirazione di precipitanti viscosi. La fase MEA viene dispensata in modo sequenziale nei 96 pozzetti in un processo che richiede circa un minuto per essere completato.Infine, la testa con 96 puntali dispensa simultaneamente tutte e 96 le soluzioni di precipitante sopra i bolli della fase MEA nei pozzetti di cristallizzazione. L'intero processo di caricamento della piastra viene completato in due minuti. La piastra riempita viene rimossa dal piano del robot e sigillata con un vetrino coprioggetto, quindi collocata in condizioni di temperatura controllata per la crescita dei cristalli.I prossimi passaggi nel processo complessivo di determinazione strutturale mediante cristallografia macromolecolare sono il raccolto e il raffreddamento criogenico dei cristalli, e la registrazione ed elaborazione della diffrazione a raggi X proveniente da questi ultimi. Questi argomenti sono trattati in articoli di lavoro separati di questa serie.I.

use-robot-for-high-throughput-crystallization-membrane-proteins

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui è descritta la procedura implementata nel gruppo membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale per impostare manualmente le prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesophases lipidico.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

I protocolli di descrivere le fasi essenziali per ottenere cristalli di diffrazione qualità di una proteina di membrana a partire dalla ricostituzione della proteina in una fase lipidica cubi (LCP), trovando condizioni iniziali con LCP-FRAP pre-cristallizzazione analisi, la creazione di processi di cristallizzazione LCP e cristalli di raccolta .

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile che mantengono proteine ​​di membrana (MP) all'interno di un doppio strato lipidico, ma hanno un comportamento unico che facilita la fase di high-throughput screening da robot cristallizzazione. Questa tecnica ha prodotto con successo un certo numero di strutture ad alta risoluzione da entrambe le fonti procariote ed eucariote. Questo video descrive i protocolli per la generazione della miscela lipidica bicelle, incorporando i deputati nella miscela...

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Qui è descritto procedure implementate nella membrana Caffrey Strutturale e Funzionale Biologia Gruppo di cristalli di membrana raccolta e crio-cool proteine ​​coltivate in fasi lipidiche cubi e spugna per l'uso in determinazione della struttura macromolecolare con cristallografia a raggi X.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

β' le proteine della membrana esterna (OMP) svolgono molte funzioni all'interno delle membrane esterne di batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti. Qui, speriamo di alleviare un noto collo di bottiglia negli studi strutturali presentando protocolli per la produzione di OMP a β cilindri in quantità sufficienti per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR.

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

Sistemi automatizzati e protocolli per la preparazione sistematica di un gran numero di schermi e goccioline di cristallizzazione nanolitro per gli esperimenti di diffusione del vapore sono descritti e discussi.

Automatizzato di protocolli per cristallizzazione macromolecolare al MRC Laboratorio di biologia molecolare

Il protocollo presentato descrive un approccio semplice per lo screening delle condizioni di cristallizzazione delle proteine e la crescita dei cristalli utilizzando una piastra di dialisi ad alto rendimento a 96 pozzetti. L'uso di tubi dializzatori per la crescita su larga scala di microcristalli è dimostrato anche per la cristallografia seriale e le applicazioni MicroED.

Cristallizzazione delle proteine ad alto rendimento tramite microdialisi

Questo protocollo descrive in dettaglio lo screening di cristallizzazione ad alto rendimento, che va dalla preparazione della piastra di microdosaggio di 1.536 alla fine di una finestra temporale sperimentale di 6 settimane. Sono inclusi dettagli sulla configurazione del campione, sull'imaging ottenuto e su come gli utenti possono eseguire analisi utilizzando un'interfaccia utente grafica abilitata all'intelligenza artificiale per identificare in modo rapido ed efficiente le condizioni di...

Screening ad alta produttività per ottenere colpi cristallini per la cristallografia proteica

Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l'individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Si descrive un metodo per la purificazione per affinità-tag di proteine ​​ricombinanti utilizzando liquido movimentazione robotica. Questo metodo è generalmente applicabile alla piccola scala purificazione di solubili His-tagged proteine ​​in una high-throughput formato.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

Scopri la cristallizzazione robotizzata ad alto throughput di proteine di membrana in mesofasi lipidiche. Questo metodo automatizzato migliora velocità, precisione e riproducibilità nella ricerca strutturale.

L'utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine di membrana in mesofasi lipidici

Esplora altri video

L'utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Esplora altri video

L'utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine di membrana in mesofasi lipidici