L'utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Salve e benvenuti al Gruppo di Biologia Strutturale e Funzionale delle Membrane. Mi chiamo Martin Caffery. Questo è un altro articolo di una serie pubblicata su JOVE sulla cristallizzazione delle proteine di membrana per la determinazione strutturale mediante il metodo in meso o della fase cubica lipidica.

Nel primo articolo, JoVE 1 7 1 2, abbiamo dimostrato come preparare la fase cubica contenente proteine e come dispensare manualmente la fase viscosa e appiccicosa di misa in piastre vetrose a sandwich per i tentativi di cristallizzazione. Questo articolo video descriverà i metodi per utilizzare un robot per la cristallizzazione in meso. Un robot offre i vantaggi della velocità, accuratezza, precisione, miniaturizzazione e della capacità di lavorare per periodi prolungati in condizioni scomode, come al buio o a basse temperature.

I robot, se utilizzati correttamente, possono migliorare notevolmente la produttività della ricerca sulla struttura e funzione delle proteine di membrana. In questo articolo video, dimostriamo l'uso di tre robot disponibili in commercio. Il primo robot è stato sviluppato nel gruppo di biologia strutturale e funzionale delle membrane ed è descritto in dettaglio nella referenza uno.

Gli altri due sono diventati disponibili solo di recente e sono inclusi qui per completezza. La preparazione della piastra per cristallizzazione, necessaria per eseguire in modo robotizzato un test di cristallizzazione, inizia con la preparazione della piastra di base della piastra per cristallizzazione a sandwich di vetro descritta in dettaglio qui di seguito: la piastra di base deve innanzitutto essere silanizzata e lo spaziatore perforato adesivo doppio deve essere applicato sulla piastra per creare le pozzette. I materiali necessari per questa procedura sono mostrati qui.

Comprendono una piastra di base in vetro per la cristallizzazione, uno spaziatore perforato con doppio adesivo, soluzione di sigillatura, carta assorbente o rullo, e un becher di acqua ultrapura. La piastra viene posizionata su un tovagliolo di carta su un banco da lavoro. Alcune gocce di soluzione sigillante vengono applicate e quindi distribuite uniformemente sulla superficie della piastra utilizzando un tovagliolo di carta.

La piastra viene lavata dalla soluzione eccessiva di silanizzazione immergendola completamente in un becher d'acqua. La piastra viene rimossa dal becher e posta su un tovagliolo di carta asciutto, con il lato silanizzato rivolto verso l'alto, e la sua superficie esposta viene asciugata tamponando delicatamente con tovaglioli di carta.

Successivamente, si rimuove il rivestimento protettivo dal distanziatore adesivo perforato e si applica il distanziatore sulla superficie silanizzata della piastra di vetro. È importante posizionare correttamente il distanziatore sulla piastra di base in modo che l'angolo superiore sinistro e i due lati adiacenti del distanziatore coincidano con quelli della piastra. Si utilizza un rullo o un brayer per appiattire il distanziatore sulla piastra di base e per creare una sigillatura stretta tra i due elementi.

Per inciso, osserviamo che piastre con setti perforati sono disponibili in commercio, come descritto nella sezione dei riferimenti. Dopo aver preparato la piastra base per la cristallizzazione, passiamo ora alla configurazione e all'utilizzo del robot in meso. Come indicato di seguito, illustriamo l'uso di tre robot in meso.

In tutti i casi mostrati, i robot sono configurati e utilizzati in una stanza con temperatura controllata impostata a 20 gradi Celsius nel meso robot uno, il primo meso robot dimostrato in questo video. L'articolo è stato sviluppato nel laboratorio del responsabile scientifico ed è ora disponibile in commercio. Dettagli completi sono disponibili nella sezione dei riferimenti.

I materiali e l'attrezzatura necessari per impostare in modo robotizzato un esperimento di cristallizzazione sono mostrati qui. Includono un quaderno di laboratorio, una soluzione proteica, appena preparata come descritto nell'articolo JoVE 1 7 1 2 e contenuta in una siringa Hamilton. Piastre di base silanizzate con distanziali e vetrini corrispondenti, una bottiglia d'acqua e fazzoletti di carta, e il robot in miso.

La prima vista mostra il robot con il piano di lavoro libero. La vista successiva mostra il robot completo di stazione di parcheggio dell'umidificatore, piastra di base per la cristallizzazione e blocco per pozzetti profondi contenente soluzioni di precipitante. Iniziamo il setup posizionando la piastra di base sul piano del robot.

Dispone di una propria piattaforma, chiaramente contrassegnata con le posizioni dei pozzetti per l'allineamento della piastra di base. La piastra deve essere etichettata in modo chiaro per facilitarne l'identificazione. Il blocco a 96 pozzetti contenente le soluzioni precipitanti è fissato sulla propria piattaforma situata sul piano del robot, accanto alla piastra per la cristallizzazione.

Il blocco viene aperto rimuovendo con attenzione il cappuccio di plastica superiore. Il flusso di umidità proveniente dall'umidificatore viene indirizzato in modo da scorrere sopra e attraverso la piastra di base sulla piattaforma del robot durante la configurazione del robot. Il robot viene inizializzato seguendo le istruzioni del produttore.

Non illustreremo questo in alcun dettaglio qui, poiché i protocolli esatti cambieranno nel tempo. Fondamentalmente, durante l'inizializzazione, al braccio dispensatore del robot vengono fornite posizioni di riferimento in tre direzioni ortogonali, x, Y e Z. Successivamente, la fase meza contenente la proteina, posta in una siringa Hamilton completa di ago dispensatore, viene fissata al braccio uno del robot; i dettagli completi su come preparare la fase meza e la siringa sono descritti nell'articolo JoVE 1 7 1 2 e nella referenza uno. La punta dell'ago della siringa dispensatrice deve ora essere allineata con il fondo e il centro del pozzetto più in alto nell'angolo sinistro della piastra per cristallizzazione. Questo corrisponde all'identificativo del pozzetto A uno, allineandosi prima di tutto con il fondo del pozzetto A uno.

Questo viene fatto regolando l'altezza o la coordinata Z del braccio di dispensazione dopo aver dispensato, osservando quanto la punta dell'ago si avvicina al fondo del pozzetto. Si può valutare che la punta tocchi appena il fondo del pozzetto spostando manualmente la piastra da un lato all'altro sulla piattaforma, regolando al contempo in modo minimo l'altezza del braccio di dispensazione; la coordinata Z del braccio di dispensazione in corrispondenza del contatto della punta con la piastra viene inserita nel computer. La dispensazione è programmata in modo che la punta dell'ago si trovi a diverse micrometri da questa posizione Z di riferimento, che corrisponde alla superficie della piastra di base. Successivamente, il robot viene attivato per eseguire una serie di passaggi guidati dall'utente al fine di posizionare la punta dell'ago al centro del pozzetto A1.

La coordinata di riferimento XY del braccio di dispensazione, in cui la punta è centrata, è memorizzata nel computer che controlla il robot. Viene utilizzata per definire il centro delle rimanenti pozzette sulla piastra. Dopo aver impostato queste coordinate di riferimento nel computer, al braccio di dispensazione viene impartito l'ordine di tornare alla posizione iniziale, preparando la siringa.

È ora necessario eseguire la preparazione della siringa dosatrice. Questa operazione garantisce che il nuovo mease riempia l'ago dosatore e che il primo pozzetto della piastra riceva l'intera quantità prevista di mease. Nel programma che controlla il robot è presente un comando apposito per l'avviamento.

Provoca l'avanzamento progressivo dello stantuffo nella siringa sotto il controllo dell'utente. Mentre ciò avviene, la punta dell'ago viene esaminata per verificare l'uscita della mease; la fase meza viene quindi rimossa con un fazzoletto. Questo completa il processo di preriscaldamento del robot.

Il robot è ora pronto per essere eseguito in modalità automatica avviando la procedura. Il programma XAP del robot avvia una serie di passaggi di lavaggio durante i quali le punte per la dispensazione del precipitante montate sul braccio due del robot vengono lavate e preparate per aspirare le soluzioni di precipitante dal blocco a pozzetti profondi; l'attivazione della funzione di dispensazione mette in moto il caricamento sequenziale dei pozzetti, iniziando con il mease contenente la proteina nei primi otto pozzetti alla volta, seguito dalle soluzioni di precipitante tra una somministrazione e l'altra. Il braccio dispensatore del mease ritorna in una posizione di parcheggio, dove l'estremità dell'ago viene inserita in una spugna inumidita per impedire al mease presente sulla punta di essiccarsi.

Di solito, i valori utilizzati nei saggi di cristallizzazione eseguiti nel gruppo di biologia strutturale e funzionale sono 50 nanolitri di mease e 800 nanolitri di soluzione precipitante. Il programma che gestisce il robot in questa dimostrazione è stato configurato in modo che i due bracci si muovano simultaneamente.

In questo modo, è possibile completare il caricamento di una piastra a 96 pozzetti con soluzione madre e precipitante in cinque minuti. Immediatamente dopo il riempimento della piastra, i bracci robotici tornano alle loro posizioni di parcheggio. La piastra viene rimossa dal piano del robot e posizionata su una superficie piana e solida.

Un vetrino coprioggetto viene appoggiato delicatamente sulla piastra di base a contatto con la superficie adesiva superiore dello spaziatore. È fondamentale assicurarsi che tutte e 96 le pozzette siano completamente coperte, che il vetrino coprioggetto sia perfettamente allineato alla piastra di base e che nessuna parte del vetrino sporga oltre l'ingombro della piastra di base. Un rullo o un torchietto viene utilizzato per creare un sigillo stretto e uniforme tra il vetrino coprioggetto e lo spaziatore.

La piastra deve essere ispezionata a questo stadio per assicurarsi che l'allestimento sia stato eseguito correttamente. Quello che si deve osservare è un aspetto simile a un uovo fritto in una padella. In ogni pozzetto, il tuorlo dell'uovo corrisponde alla fase meza.

L'albume dell'uovo è la soluzione precipitante e il bordo della padella è il perimetro della cristallizzazione. Idealmente, i tre elementi sono concentrici. La piastra è ora pronta per essere collocata in un'area di stoccaggio con temperatura controllata per la crescita dei cristalli.

Se non si devono preparare ulteriori piastre, il blocco del precipitante deve essere rimosso dal piano del robot, sigillato correttamente e riposto in conservazione. La siringa contenente il mease viene rimossa dal braccio di dispensazione del robot, smontando le sue diverse parti, compresi l'ago di dispensazione e il ferial. Va lavata accuratamente con metanolo ed essiccata in previsione dell'uso successivo nel robot In Meso due mosquito LCP.

Questo prossimo video mostra il robot LCP per zanzare che può essere utilizzato nell'allestimento di prove di cristallizzazione in meso. Incorpora un sistema di dispensazione della fase meph simile a quello descritto in precedenza in questo articolo. Per il robot uno, tuttavia, il precipitante viene dispensato utilizzando punte monouso.

Lo strumento stesso è mostrato qui. Include un piano su cui sono posizionati la piastra per la cristallizzazione e il blocco del precipitante, oltre a una camera con finestre per il controllo dell'umidità. In questa vista, le finestre della camera di umidità sono state aperte, insieme a una bobina con punte di dispensazione, un braccio di dispensazione mease, e un sensore basato su laser per determinare la posizione dell'ago di dispensazione della fase meph.

Una piattaforma rialzata sulla quale poggia la piastra di cristallizzazione e una piattaforma incassata per contenere il blocco dello schermo precipitante. In questa sequenza, il robot ha eseguito una serie di operazioni di inizializzazione all'accensione dello strumento. Un software di programmazione viene utilizzato per configurare lo strumento per l'utilizzo con specifiche piastre di cristallizzazione e blocchi precipitanti, e per erogare volumi definiti di enzima e precipitante secondo una sequenza specifica.

Questi dettagli sono forniti dal produttore e non verranno mostrati qui. L'utilizzo del robot per preparare una piastra di cristallizzazione inizia come segue: una siringa Hamilton completa di ago e riempita con il mease contenente la proteina viene preparata come descritto in precedenza nella sezione relativa al robot in meso uno e nel JoVE 1 7 1 2. La siringa viene fissata in posizione sotto il braccio di dispensazione del robot.

Le coordinate X e Y dell'ago sulla siringa di dispensazione vengono stabilite utilizzando il sensore laser montato sul deck. Questo è un passaggio importante necessario per garantire che la mease venga dispensata con precisione al centro di ogni pozzetto della piastra di cristallizzazione. Premendo un pulsante sul pannello di controllo, la siringa viene preparata per espellere la mease dalla punta dell'ago.

Il mease estruso viene quindi rimosso con un fazzoletto di carta, in previsione dell'utilizzo del robot per caricare le pozzette prima di montare la piastra di cristallizzazione sul supporto del robot. La superficie della piattaforma viene inumidita con alcune gocce di acqua per mantenere la piastra in posizione. Per capillarità, il coperchio protettivo viene rimosso dalla piastra e la piastra viene posizionata con fermezza sul proprio supporto per garantire un buon aderente.

Sulla piattaforma sono presenti tre punti fiduciali, posizionati al centro dei tre pozzetti agli angoli, per garantire un corretto allineamento della piastra rispetto alla punta della pipetta dosatrice; a questo punto lo strumento è pronto per entrare in un ciclo di configurazione. Questo inizia con un secondo passaggio di condizionamento, durante il quale viene dispensato mease su una piccola lastrina di vetro, subito prima di procedere al caricamento della piastra con mease fresco. In questa sequenza, si osserva il robot mentre carica inizialmente il mease in una colonna verticale di otto pozzetti sulla piastra, e successivamente utilizza le punte monouso per dispensare la soluzione precipitante sopra il bolo di mease.

Questo processo viene ripetuto 11 volte lungo l'intera lunghezza della piastra fino a quando tutti i pozzetti sono riempiti. L'intero processo richiede circa cinque minuti per essere completato. In questo particolare video, in ogni pozzetto sono stati dispensati 50 nanolitri di Mease e 800 nanolitri di soluzione precipitante.

La piastra riempita viene rimossa dalla piattaforma del robot posizionata sul banco di lavoro. Viene applicato il coprivetrino e la piastra viene sigillata con un reggiseno come descritto in precedenza nella sezione relativa al robot in miso uno. La piastra opportunamente etichettata può ora essere collocata in un ambiente a temperatura controllata per la crescita dei cristalli nel robot Meso tre, il Griffin LCP.

Questo ultimo spezzone video mostra il robot Griffin LCP in azione durante l'allestimento di prove di cristallizzazione in meso. Il Griffin incorpora un sistema di dispensazione della fase mef simile a quello descritto sopra per il robot uno. In questo caso, tuttavia, tutte e 96 le soluzioni precipitanti vengono dispensate contemporaneamente.

Lo strumento stesso è mostrato qui. Include un piano su cui poggiano la piastra per la cristallizzazione e il blocco del precipitante, un braccio erogatore e una testa per punte Phoenix 96. Per l'erogazione delle soluzioni di precipitante, il robot in azione è mostrato in questa sequenza video finale.

La testa con 96 punte viene caricata inizialmente con la soluzione precipitante. Viene impostato un ritardo definito dall'utente per facilitare l'aspirazione di precipitanti viscosi. La fase MEA viene dispensata in modo sequenziale nei 96 pozzetti in un processo che richiede circa un minuto per essere completato.

Infine, la testa con 96 puntali dispensa simultaneamente tutte e 96 le soluzioni di precipitante sopra i bolli della fase MEA nei pozzetti di cristallizzazione. L'intero processo di caricamento della piastra viene completato in due minuti. La piastra riempita viene rimossa dal piano del robot e sigillata con un vetrino coprioggetto, quindi collocata in condizioni di temperatura controllata per la crescita dei cristalli.

I prossimi passaggi nel processo generale di determinazione strutturale mediante cristallografia macromolecolare sono il raccolto e il raffreddamento criogenico dei cristalli, e la registrazione ed elaborazione della diffrazione a raggi X proveniente da questi ultimi. Questi argomenti sono trattati in articoli di lavoro separati di questa serie.I.