Name: High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate In situ Ibridazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Scopri la mappatura fisica ad alto rendimento dei cromosomi politenici di zanzara con preparazione ad alta pressione e ibridazione in situ automatizzata. Questo metodo migliora l'efficienza e la coerenza dello sviluppo delle mappe fisiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un contributo degli Istituti Nazionali di Sanità 1R21AI094289 assegnato a Igor V. Sharakhov. Il sistema automatizzato per la colorazione di vetrini Xmatrx e il sistema di scansione automatizzato ACCORD PLUS sono stati acquistati grazie al programma Equipment Trust Fund, presso il Fralin Life Science Institute, il Dipartimento di Entomologia e il Dipartimento di Biochimica della Virginia Tech.

1. Preparazione di cromosomi politenici ad alta pressione da cellule nutrici ovariche
<ol>
	<li>Dissezionare femmine di Anopheles semigravide a 25 ore dal pasto ematico sotto un microscopio stereoscopico e fissare le ovaie in una soluzione di Carnoy modificata con metanolo (metanolo al 100%: acido acetico glaciale, 3:1). A questo stadio le ovaie si trovano alla fase III di sviluppo di Christophers, quando i follicoli hanno una forma ovale e un'area trasparente contenente le cellule nutritizie all'interno dei follicoli presenta una forma rotonda13. Collocare le ovaie di circa cinque femmine in 500 μl di soluzione di Carnoy modificata in un tubo Eppendorf da 1,5 ml e mantenerle a temperatura ambiente per 24 ore. Trasferire le ovaie a -20 °C per un immagazzinamento a lungo termine.</li>
	<li>Preparare la soluzione di Carnoy modificata con etanolo (etanolo al 100%: acido acetico glaciale, 3:1) e acido propionico al 50% poco prima di preparare i vetrini. Posizionare una coppia di ovaie su un vetrino privo di polvere in una goccia di soluzione di Carnoy modificata. Suddividere le ovaie in circa 6 sezioni con aghi da dissezione e posizionarle in gocce di acido propionico al 50% su vetrini puliti sotto un microscopio stereoscopico Leica MZ6. Utilizzare un vetrino separato per ogni sezione.</li>
	<li>Separare i follicoli mediante dissezione con aghi e rimuovere i tessuti residui con carta da filtro o carta assorbente sotto un microscopio stereoscopico. Aggiungere una nuova goccia di acido propionico al 50% sui follicoli e lasciarli in posa per 3-5 minuti a temperatura ambiente. Posizionare un’altra lamella sulla goccia di acido propionico al 50%. Lasciare riposare il vetrino per circa 1 minuto.</li>
	<li>Avvolgere il vetrino con carta da filtro e plastica. Utilizzando uno strumento rotante Dremel 200 con attacco a flessibile e punta in plastica morbida impostata tra 3000 e 5000 giri/min, schiacciare i follicoli ruotando la punta in cerchi e premendo leggermente sulla lamella per distribuire uniformemente i nuclei. Questo passaggio dovrebbe durare circa 1 minuto. Verificare la qualità della dispersione con un microscopio a contrasto di fase Olympus CX41 utilizzando un obiettivo 20x.</li>
	<li>Preparare un sandwich posizionando un’ulteriore lamella accanto a quella che copre i cromosomi, quindi coprirle con un secondo vetrino. Questo riduce la probabilità di schiacciare il vetrino nella morsa. Avvolgere i vetrini con un foglio di plastica, come quelli contenuti nei contenitori per vetrini, e carta da filtro per mantenere il sandwich e proteggere il vetrino dai graffi causati dalla morsa.</li>
	<li>Applicare pressione sui vetrini tramite una morsa meccanica. Una pressione di 85-120 inch-lbs è sufficiente e si ottiene utilizzando una chiave dinamometrica. Questo passaggio è necessario per appiattire i cromosomi il più possibile.</li>
	<li>Rimuovere il secondo vetrino e la lamella aggiuntiva. Riscaldare il vetrino con la lamella che copre i cromosomi a 55 °C su un sistema di denaturazione/ibridazione per vetrini per 10-15 minuti per appiattire ulteriormente i cromosomi. Immergere il vetrino in azoto liquido per almeno 15 secondi e, quando le bollicine cessano, procedere rapidamente a rimuovere la lamella con una lama di rasoio. Immergere immediatamente i vetrini in etanolo freddo al 50% per 5 minuti. Disidratare i vetrini in etanolo al 70%, 90% e 100% per 5 minuti ciascuno. Lasciare asciugare i vetrini all'aria.</li>
</ol>
2. FISH utilizzando un sistema automatizzato per la colorazione di vetrini
Il programma è configurato con il sistema automatico di colorazione vetrini Xmatrx per eseguire i seguenti passaggi, ad eccezione della marcatura della sonda. Il protocollo dettagliato di marcatura mediante nick-translation è descritto nella documentazione fornita con la DNA polimerasi da Fermentas.
<ol>
	<li>Prima della FISH, preparare le sonde fluorescenti etichettando il DNA BAC genomico con un fluorocromo mediante un protocollo di traduzione a intasamenti. Mescolare 1 μg di DNA, 0,05 mM ciascuno di dATP, dCTP e dGTP non marcati e 0,015 mM dTTP, 1 μl di dUTP marcato con Cy3 o Cy5, 0,05 mg/ml di BSA, 5 μl di buffer 10x per la traduzione a intasamenti, 20 unità di DNA polimerasi I, 0,0012 unità di DNasi I e acqua libera da nucleasi fino a un volume finale di 25 μl. Il rapporto tra DNA polimerasi I e DNasi I viene scelto empiricamente per ottenere sonde con una dimensione compresa tra 300 e 500 bp. Incubare la miscela a 15 °C per 1 ora.</li>
	<li>Inserire vetrini e reagenti nel sistema automatico di colorazione Xmatrx ed avviare il programma per eseguire i seguenti passaggi. Applicare 800 μl di PBS 1x per 20 minuti. Asciugare i vetrini con aria. Eseguire la fissazione con formalina applicando 450 μl di formalina al 4% in PBS 1x per 1 minuto, seguita da lavaggi con etanolo al 100% per 1 secondo per due volte e per 2 minuti una volta. Asciugare i vetrini con aria.</li>
	<li>Riscaldare i vetrini a 45 °C per 2 minuti per evitare la formazione di bolle durante l'applicazione delle sonde. Applicare 20 μl delle sonde di DNA, aggiungere gocce di olio minerale per evitare l'evaporazione della soluzione di ibridazione e posizionare un coprioggetto sopra. Denaturare i cromosomi e le sonde di DNA riscaldando i vetrini a 90 °C per 10 minuti.</li>
	<li>Per l'ibridazione, incubare i vetrini a 42 °C per 14 ore con i coprioggetti posizionati. La soluzione di ibridazione è composta da 2x SSC, 100 mM di fosfato di sodio, soluzione 1x di Denhardt, 100 μg/ml di azoturo di sodio e 10% di solfato di destrano in formammide.</li>
	<li>Per i lavaggi di stringenza, riscaldare i vetrini a 42 °C per 2 minuti, rimuovere i coprioggetti e lavare i vetrini in 2x SSC per 1 secondo per quattro volte. Asciugare i vetrini con aria. Applicare 800 μl di 0,4x SSC a 42 °C per 10 minuti per due volte. Lavare i vetrini in 2x SSC a 25 °C per 10 minuti.</li>
	<li>Eseguire la colorazione dei cromosomi applicando 50 μl di YOYO-1 1 μM in PBS 1x. Aggiungere gocce di olio minerale per evitare l'evaporazione della soluzione di colorazione, posizionare i coprioggetti e incubare a 25 °C per 10 minuti. Rimuovere i coprioggetti, lavare i vetrini in 2x SSC per 1 secondo per quattro volte. Asciugare i vetrini con aria. Applicare 15 μl di reagente antiossidante ProLong Gold. Posizionare i coprioggetti.</li>
</ol>
3. Lettura dei vetrini con un sistema automatico di imaging fluorescente
Questa sezione illustra l'utilizzo del software Duet, fornito standard con il sistema di scansione automatizzato ACCORD PLUS. Le istruzioni iniziano dopo aver acceso i dispositivi in questo ordine: alimentatore Olympus U-RFL-T per lampada alogena, computer Dell precision T3500, microscopio Olympus BX61 con una telecamera collegata Olympus U-CMAD3.
<ol>
	<li>Per configurare la Pre-Scansione 10x, aprire il software Duet nel sistema di scansione automatizzato ACCORD PLUS. Fare clic sul pulsante "Online". Inserire un nuovo ID del caso e assegnare un ID del vetrino. Fare clic sul punto etichettato "BF", che corrisponde all'opzione in campo chiaro. Impostare la scelta di scansione su "10x Prescan". Utilizzare "2500x circle", "10000x circle" o "rectangle". Fare clic su "Set&amp;run" per avviare la Pre-Scansione 10x.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante "OK" per eseguire la Pre-Scansione 10x. Seguire le indicazioni per regolare correttamente la scansione. Fare clic su "Finish" per iniziare la scansione. Premere la scheda "Main" per tornare alla schermata principale. Fare clic sul pulsante "Offline". Individuare l'ID del caso e l'ID del vetrino assegnati e fare clic su "Offline Scan". Nella casella nera nell'angolo in alto a sinistra, cliccare sulla freccia e selezionare "10x Prescan". Utilizzando le frecce (&lt; || Δ &gt;, ovvero i pulsanti "indietro", "pausa", "play", "avanti"), esaminare le immagini scansionate.</li>
	<li>Dopo aver individuato un'immagine di interesse, fare doppio clic al centro della regione target sullo schermo e premere "Snap". Questo selezionerà l'immagine per un successivo acquisizione. Dopo aver selezionato tutte le regioni di interesse, fare clic su "Classify". Selezionare "10x Prescan". Fare clic con il tasto destro su un'immagine per classificarla. Selezionare "Polytene".</li>
	<li>Configurare la Pre-Scansione 40x nel software Duet. Fare clic su "Main" per tornare al menu principale. Selezionare nuovamente "Online". Selezionare un vetrino. Cambiare "BF" in "FL". Modificare il nome dell'attività in "Revisit-X40-RG". Impostare la sezione subito sotto l'ultima impostazione su "Revisit-ALL". Fare clic su "Set&amp;Run". Premere "OK". Seguire nuovamente le indicazioni per configurare l'automazione. Fare clic sul pulsante "Start matching views" per allineare le immagini 10x e 40x. Fare clic su "Finish" per avviare la scansione. Al termine, fare clic su "Classify" ed esaminare le immagini.</li>
</ol>
4. Risultati rappresentativi
Figura 1 rappresenta graficamente lo schema della preparazione cromosomica ad alta pressione. Questo passaggio comprende il processo di schiacciamento e appiattimento dei cromosomi mediante un utensile Dremel e una morsa meccanica, nonché la visualizzazione dei cromosomi utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Figura 2 illustra l'ibridazione di una sonda marcativa fluorescente con il DNA bersaglio su preparati cromosomici su vetrino, mediante un sistema automatizzato di colorazione dei vetrini, l'utilizzo di un microscopio scanner automatizzato per visualizzare e mappare le sonde dopo l'esperimento di FISH e il posizionamento e l'orientamento degli scaffold genomici sui cromosomi.
I preparati di cromosomi politenici delle cellule nutrici ovariche da femmine di An. gambiae sono stati ottenuti mediante la tecnica ad alta pressione. Questo metodo non danneggia né altera la maggior parte della struttura cromosomica (Figura 3). Appiattisce i cromosomi piegati e, pertanto, rivela sottili bande nascoste che non sono visibili nei preparati ordinari (Figura 4).
Le sonde utilizzate in questo protocollo sono cloni genomici di DNA BAC ottenuti da una libreria BAC ND-TAM generata a partire dal DNA della linea PEST di An. gambiae. Il DNA genomico per questa libreria è stato estratto da larve di primo stadio appena schiuse di entrambi i sessi. Figura 5 mostra i risultati della FISH eseguita con cloni BAC ibridati ai cromosomi politenici di An. gambiae. Questa procedura è stata eseguita utilizzando il sistema automatizzato di colorazione vetrini Xmatrx. Utilizzando una fotocarta citogenetica per An. gambiae10, due cloni BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) e BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), sono stati localizzati rispettivamente nelle sottodivisioni 16C e 16D del braccio 2R. Tuttavia, la ricerca BLAST contro l'assemblaggio AgamP3 della linea PEST di An. gambiae14 ha identificato le sequenze omologhe a 102B24 e 142O19 rispettivamente nelle sottodivisioni 16B e 17A del braccio 2R (Tabella 1). Pertanto, la corrispondenza tra le coordinate genomiche e le sottodivisioni citogenetiche può ora essere aggiustata in base ai nostri dati di mappatura. La ricerca BLAST contro gli assemblaggi genomici della forma M e della forma S di An. gambiae ha rivelato che i due cloni BAC si trovano in contig diversi, ma negli stessi scaffold all'interno di ciascuna forma (Tabella 1). I contig identificati possono ora essere associati a specifiche localizzazioni cromosomiche. Inoltre, gli scaffold identificati possono ora essere correttamente orientati all'interno delle sottodivisioni citologiche 16CD. In modo interessante, le distanze tra le sequenze 102B24 e 142O19 negli scaffold sono rispettivamente di 1.892.981 pb, 1.658.391 pb e 1.688.426 pb negli assemblaggi genomici della linea PEST, della forma M e della forma S. Poiché la linea PEST è un ibrido tra le forme M e S, questa differenza è probabilmente dovuta a un assemblaggio errato del genoma PEST.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BAC 
			(accessione)</td>
			<td>CEPCE-strain 
			AgamP3 
			 
			Coordinate</td>
			<td>Contenitore M 
			contig 
			 
			Coordinate</td>
			<td>Contenitore M 
			scaffold 
			 
			Coordinate</td>
			<td>Contenitore S 
			contig 
			 
			Coordinate</td>
			<td>Contenitore S 
			scaffold 
			 
			Coordinate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372694)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_26 (16B) 
			 
			43.681.342- 
			43.681.874</td>
			<td>ABKP020247 
			53.1 
			 
			32.513- 
			33.045</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			1.858.377- 
			1.858.909</td>
			<td>ABKQ010123 
			32.1 
			 
			4.299- 
			4.832</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			215.891- 
			216.424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372701)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_28 (16B) 
			 
			43.788.213- 
			43.788.969</td>
			<td>ABKP020247 
			51.1 
			 
			24.816- 
			25.575</td>
			<td>EQ090167.1, 
			 
			1.772.683- 
			1.773.442</td>
			<td>ABKQ010123 
			35.1 
			 
			27.782- 
			28.540</td>
			<td>EQ099711.1, 
			 
			305.514- 
			306.272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368698)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			 
			8805_5 (17A) 
			45.428.580- 
			45.429.264</td>
			<td>ABKP020247 
			01.1 
			 
			2.499- 
			3.185</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			315.806- 
			316.492</td>
			<td>ABKQ010123 
			76.1 
			 
			49.242- 
			49.942</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1.791.625- 
			1.792.325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368703)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8805_8 (17A) 
			 
			45.560.099- 
			45.574.323</td>
			<td>ABKP020220 
			17.1 
			 
			30.971- 
			32.469</td>
			<td>EQ090167.1 
			200.518- 
			202.016</td>
			<td>ABKQ010123 
			79.1 
			 
			27.760- 
			28.508</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1.903.569- 
			1.904.317</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1. Risultati del BLAST delle sequenze di estremità BAC confrontate con gli assemblaggi genomici di An. gambiae.
<img alt="Dissezione dell'ovaio di zanzara; microscopio stereoscopico; preparazione dei cromosomi; microscopia a contrasto di fase." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Rappresentazione schematica della preparazione dei cromosomi ad alta pressione. Vengono mostrati gli ovari di zanzara allo stadio corretto di sviluppo.
<img alt="Etichettatura della sonda per la mappatura cromosomica mediante ibridazione automatica su vetrino e microscopio a scansione." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Schema rappresentante la FISH automatizzata, la scansione del vetrino e la mappatura cromosomica di scaffold genomici.
<img alt="Struttura dei cromosomi politenici, immagine al microscopio, analisi del pattern di bande del DNA, ricerca genetica" src="/files/ftp_upload/4007/4007fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3. Un preparato del cromosoma politenico 3 di An. gambiae ottenuto mediante la tecnica ad alta pressione. 3L e 3R indicano rispettivamente i bracci sinistro e destro ai loro telomeri. PH e IH indicano rispettivamente eterocromatina pericentrica e intercalare.
<img alt="Immagine microscopica che confronta i modelli di bandeggio dei cromosomi 3R/3L sotto diverse pressioni." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4. Confronto tra cromosomi politenici di An. gambiae preparati utilizzando la tecnica tradizionale (in alto) e quella ad alta pressione (in basso). Le immagini mostrano le suddivisioni 29A-30E del braccio 3R (A) e 43D-46D del braccio 3L (B).
<img alt="Mappatura cromosomica, marcatori fluorescenti e loci genetici su cromosomi politenici di Drosophila, diagramma." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5. Ibridazione fluorescente in situ (FISH) di cloni BAC su cromosomi politenici di An. gambiae. A) Ibridazione di 102B24 (segnale rosso) con il braccio 2R. B) FISH a doppio colore di 102B24 (segnale rosso) e 142O19 (segnale blu) rispettivamente sulle sottodivisioni 16C e 16D del braccio 2R allungato. Le frecce indicano i segnali di ibridazione dei cloni BAC marcati con Cy3 (rosso) e Cy5 (blu). C indica la regione centromerica. a/+ mostra l'inversione eterozigote 2La. I cromosomi sono stati contrastati con il fluorocromo YOYO-1.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Il passaggio più critico della procedura ad alta pressione è la corretta schiacciatura delle cellule nutritrici ovariche isolate allo stadio III di Christophers dello sviluppo ovarico13. Una schiacciatura inadeguata può portare a cromosomi insufficientemente distesi, il che può causare problemi nella determinazione della posizione delle sonde dopo la FISH. Se i cromosomi vengono schiacciati eccessivamente, possono rompersi o allungarsi al punto da perdere i pattern di bandeggio. La preparazione di più vetrini consente di ottenere maggiore uniformità nella schiacciatura dei vetrini mediante l'uso dello strumento Dremel, aumentando così l'efficienza complessiva della produzione di vetrini. La tecnica ad alta pressione è stata inizialmente sviluppata per ghiandole salivari appena isolate di D. melanogaster9. Tuttavia, le ovaie delle zanzare vengono di routine conservate in soluzione fissa modificata di Carnoy (3 metanolo: 1 acido acetico glaciale in volume) prima di essere utilizzate per la preparazione cromosomica. Pertanto, abbiamo modificato il protocollo esistente ad alta pressione per renderlo adatto ai cromosomi politenici delle cellule nutritrici ovariche fissate della zanzara anofele An. gambiae. Poiché l'alta pressione viene applicata mediante una morsa di precisione dotata di superficie di lavoro altamente parallela su tutta l'estensione del vetrino, il tempo necessario per preparare lo schiacciamento cromosomico è significativamente inferiore rispetto all'uso della tradizionale tecnica di picchiettamento con la gomma di una matita.
Altri passaggi importanti includono l'immersione sufficiente dei follicoli in acido propionico al 50% e il riscaldamento del vetrino. Entrambi questi passaggi sono essenziali per appiattire i cromosomi. Se trascurati, i cromosomi possono apparire lucidi dopo la disidratazione, il che potrebbe portare a un eccesso di fondo che potrebbe essere scambiato per un segnale nell'ibridazione fluorescente in situ (FISH). La tecnica di schiacciamento ad alta pressione funziona bene anche utilizzando le stesse soluzioni per preparare preparati di cromosomi mitotici. L'ulteriore dispersione e appiattimento aiutano a evidenziare meglio i cromosomi dai loro nuclei. Applicando una pressione uniforme, essi dovrebbero appiattirsi in modo adeguato, consentendo misurazioni e potenzialmente una migliore risoluzione delle bande visibili dopo la colorazione. I dettagli sull'isolamento di cromosomi mitotici da zanzare sono riportati altrove15. Sebbene le preparazioni di schiacciamento tradizionali siano sufficienti per molti scopi, inclusi FISH 16 e immunocolorazione17, il metodo ad alta pressione non solo riduce la variabilità potenziale da un vetrino all'altro, ma migliora anche la qualità complessiva dei cromosomi, consentendo una maggiore definizione durante la mappatura cromosomica. Questa procedura può essere utilizzata anche per preparare vetrini con membrane di cromosomi politenici per la microdissezione laser.
I limiti del metodo ad alta pressione includono la rottura dei vetrini e un'eccessiva distensione dei cromosomi. La rottura del vetrino, causata dall'applicazione di una pressione eccessiva tramite la morsa, è possibile, ma viene limitata utilizzando le pressioni indicate nell'articolo. Per quanto riguarda l'eccessiva distensione dei cromosomi, se lo strumento Dremel viene applicato al vetrino per un periodo prolungato, esiste il rischio che i cromosomi si allunghino troppo, perdendo risoluzione. Tale problema può essere risolto applicando lo strumento per un breve periodo, verificando al microscopio e, se necessario, applicando ulteriore tempo con lo strumento Dremel qualora i cromosomi non fossero sufficientemente dispersi.
Un protocollo FISH tradizionale comprende diverse fasi di lavaggio e incubazione, che di solito durano da 5 a 20 minuti e richiedono quasi costantemente l'attenzione completa del ricercatore per tutta la durata dell'esperimento. Inoltre, il numero di vetrini che possono essere gestiti manualmente è solitamente limitato a pochi vetrini per ogni esperimento. Al contrario, un sistema automatizzato per la colorazione dei vetrini esegue automaticamente tutti i passaggi (inclusi lavaggio, incubazione, applicazione della sonda, denaturazione, ibridazione, applicazione e rimozione del coprioggetto). Ciò libera fino a 6-8 ore lavorative per il ricercatore durante un esperimento FISH. Inoltre, un sistema FISH automatizzato può aumentare significativamente la produttività. Ad esempio, il sistema Xmatrx è in grado di elaborare fino a 40 saggi su vetrini con singola preparazione e fino a 80 saggi su vetrini con doppia preparazione simultaneamente. Tra i limiti di questo sistema vi è la scarsa efficienza nel caso di un numero ridotto di esperimenti FISH, poiché richiede la preparazione di grandi volumi di soluzioni. Inoltre, il protocollo FISH programmato nel sistema potrebbe necessitare di modifiche e aggiustamenti per nuove applicazioni.
Un sistema di scansione di vetrini è una versione automatizzata di un microscopio a fluorescenza. Il movimento automatizzato del tavolino e un semplice pannello di controllo del microscopio liberano tempo al ricercatore e rendono l'utilizzo del microscopio estremamente semplice. Ad esempio, il software del sistema di scansione ACCORD PLUS permette una facile acquisizione di più canali di fluorescenza e una gestione semplificata dell'acquisizione delle immagini. Un esempio di ciò è l'inclusione dell'acquisizione di z-stack, invece di una singola immagine; il software acquisisce uno z-stack configurabile di immagini per garantire che almeno un'immagine rimanga a fuoco. Sebbene questo sistema sia progettato principalmente per l'acquisizione di molteplici immagini (molte cellule su un singolo vetrino), rende comunque molto più semplice individuare i cromosomi sul vetrino rispetto alla navigazione manuale.
Sia il sistema automatizzato di colorazione di vetrini che il sistema di scansione sono comunemente utilizzati nei laboratori di citogenetica per la diagnostica FISH delle anomalie cromosomiche nelle cellule umane. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo che sfrutta questi sistemi automatizzati per un'applicazione di ricerca di base. Il protocollo automatizzato di mappatura fisica ad alta capacità può facilitare lo sviluppo rapido di mappe cromosomiche fisiche per qualsiasi specie di interesse. Sebbene in questo rapporto abbiamo utilizzato cromosomi politenici per la mappatura fisica, anche i cromosomi mitotici possono essere impiegati con questi sistemi. Sarebbe utile adattare il protocollo ai cromosomi mitotici, poiché la maggior parte degli organismi non sviluppa cromosomi politenici leggibili. Tuttavia, quando disponibili, i cromosomi politenici possono fornire informazioni utili sulla corrispondenza tra domini funzionali del genoma e la struttura cromosomica con la massima risoluzione. I principi organizzativi dei cromosomi politenici, come i modelli di bande e interbande, sono stati recentemente paragonati a quelli dei cromosomi non politenici (in interfase)18. Pertanto, la mappatura fisica dettagliata eseguita su preparazioni cromosomiche ad alta pressione ha il potenziale di collegare sequenze di DNA a specifiche strutture cromosomiche come bande, interbande, pomfi, centromeri, telomeri ed eterocromatina; consentendo così la creazione di assemblaggi genomici basati sui cromosomi.

<table><tbody><tr><td>Coprioggetti per microscopio 22x22 mm</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti per microscopio 18x18 mm</td><td>Fisher</td><td>12-553-402</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Acido propionico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Utensile rotante Dremel 200 con attacco a flessibile</td><td>Rand</td><td></td><td>3&quot; Mini smerigliatrice universale da banco (con limitatore di velocità)</td></tr><tr><td>Punte di plastica speciali da 200 &amp;mu;l (con bordi di plastica sagomati) per utensile Dremel</td><td>Pipetman</td><td>F171300</td><td>Tagliare e riscaldare l'estremità larga delle punte per pipetta</td></tr><tr><td>Morsetto rapido con rivestimento in stagno</td><td>Avenger Gold Toolmaker</td><td>MTC-200-1</td><td>Precisamente rettificato, quadrato e parallelo entro 0,00025</td></tr><tr><td>Chiave dinamometrica</td><td>Craftsman</td><td>44593</td><td></td></tr><tr><td>Sistema ThermoBrite per denaturazione/ibridazione di vetrini</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini con barriera da 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT108-SL</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti da 25 mm</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT122-90X</td><td></td></tr><tr><td>Sistema automatico di colorazione vetrini Xmatrx</td><td>Abbott Molecular</td><td>08L46-001</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscopio MZ6 Leica</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>È possibile utilizzare un diverso stereo microscopio</td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase Olympus CX41</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>È possibile utilizzare un diverso microscopio a contrasto di fase</td></tr><tr><td>Sistema automatico di scansione ACCORD PLUS</td><td>BioView (USA)</td><td>BV-5000-ACCP</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Formalina neutra tampone al 10% (NBF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Formammide al 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di dextrano, sale sodico</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Tampone SSC 20x</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Denhardt 50x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ioduro di YOYO-1 1 mM (491/509) in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antiossidante ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Si prevede che nei prossimi 5 anni verranno realizzati progetti per ottenere le sequenze del genoma intero di 10.000 specie di vertebrati1 e di 5.000 specie di insetti e artropodi correlati2. Ad esempio, attualmente il sequenziamento dei genomi di 15 specie di zanzare malariche sta avvenendo mediante una piattaforma Illumina3,4. Questo raggruppamento di specie di Anopheles comprende sia vettori che non vettori della malaria. Quando le assemblate genomiche saranno disponibili, i ricercatori avranno l'opportunità unica di effettuare analisi comparative per dedurre i cambiamenti evolutivi rilevanti per la capacità vettoriale. Tuttavia, si è dimostrato difficile utilizzare le letture di sequenziamento di nuova generazione per generare assemblati genomici de novo di alta qualità5. Inoltre, le assemblate genomiche esistenti per Anopheles gambiae, sebbene ottenute con il metodo Sanger, presentano lacune o sono frammentate4,6.
Il successo delle analisi genomiche comparative sarà limitato se i ricercatori devono lavorare con numerosi contig di sequenziamento, piuttosto che con assemblaggi genomici basati sui cromosomi. Le sequenze frammentate e non mappate creano problemi per le analisi genomiche perché: (i) lacune non identificate causano annotazioni errate o incomplete delle sequenze genomiche; (ii) le sequenze non mappate generano confusione tra geni paraloghi e geni provenienti da diversi aplotipi; e (iii) la mancanza di assegnazione cromosomica e orientamento dei contig di sequenziamento non consente di ricostruire la filogenesi delle riorganizzazioni né di studiare l'evoluzione cromosomica. Sviluppare mappe fisiche ad alta risoluzione per specie con genomi appena sequenziati rappresenta un investimento tempestivo ed economico che faciliterà l'annotazione del genoma, l'analisi evolutiva e il re-sequenziamento di genomi individuali provenienti da popolazioni naturali7,8.
Qui presentiamo approcci innovativi per la preparazione dei cromosomi, l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) e l'acquisizione di immagini, che facilitano lo sviluppo rapido di mappe fisiche. Utilizzando An. gambiae come esempio, dimostriamo che lo sviluppo di mappe cromosomiche fisiche può potenzialmente migliorare gli assemblaggi genomici e, di conseguenza, la qualità delle analisi genomiche. In primo luogo, utilizziamo un metodo ad alta pressione per preparare strati di cromosomi politenici. Questo metodo, originariamente sviluppato per Drosophila9, permette di visualizzare maggiori dettagli sui cromosomi rispetto alla tecnica tradizionale di schiacciamento10. In secondo luogo, si impiega un sistema completamente automatizzato, front-end, per la FISH, utilizzato per il mappaggio fisico del genoma ad alto rendimento. Il sistema automatizzato di colorazione dei vetrini esegue simultaneamente più saggi e riduce notevolmente il tempo di manipolazione manuale11. In terzo luogo, un sistema automatico di acquisizione di immagini fluorescenti, che include un portavetrino motorizzato, analizza e fotografa automaticamente i cromosomi marcati dopo la FISH12. Questo sistema è particolarmente utile per identificare e visualizzare più piastre cromosomiche sullo stesso vetrino. Inoltre, il processo di scansione consente di ottenere risultati FISH più uniformi. Nel complesso, il protocollo automatizzato di mappatura fisica ad alto rendimento è più efficiente rispetto a un protocollo manuale standard.

Gli assemblaggi genomici basati su tecnologie di sequenziamento del DNA massicciamente parallele sono solitamente altamente frammentati. Lo sviluppo di mappe cromosomiche fisiche può potenzialmente migliorare gli assemblaggi genomici. Qui, illustriamo approcci innovativi alla preparazione dei cromosomi, all'ibridazione fluorescente in situ e all'acquisizione delle immagini, che aumentano in modo significativo il rendimento nello sviluppo delle mappe fisiche.

High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

I progetti per ottenere le sequenze dell'intero genoma di 10.000 specie di vertebrati1 e di 5.000 specie di insetti e artropodi affini2 dovrebbero essere realizzati...

L'obiettivo generale di questa procedura è mappare sonde di DNA su cromosomi politanici di zanzara mediante una preparazione cromosomica ad alta pressione, seguita da ibridazione fluorescente in situ C due e imaging automatizzato. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto strisci cromosomici politanici utilizzando un metodo ad alta pressione. Il passaggio successivo della procedura consiste nel preparare sonde fluorescenti etichettando il DNA genomico retrostante con il fluorocromo mediante un protocollo di traduzione a nick.Il terzo passaggio consiste nell'eseguire l'ibridazione fluorescente in C due utilizzando sistemi automatizzati per la colorazione di vetrini. L'ultimo passaggio prevede la scansione e la ripresa fotografica dei cromosomi marcati mediante un sistema automatico di imaging fluorescente. In definitiva, le immagini possono mostrare la localizzazione di una sonda di DNA marcati fluorescentemente sul cromosoma poli.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come un protocollo standard di ibridazione in situ manuale, è che il protocollo di mappatura fisica ad alto rendimento produce risultati più coerenti e riduce in modo significativo il tempo di manipolazione. Questo protocollo inizia sezionando femmine emizigoti e omozigoti circa 25 ore dopo l’alimentazione con sangue per raccogliere le loro ovaie quando si trovano allo stadio tre di Christopher. A questo stadio, la zona trasparente con le cellule del nutrice all’interno dei follicoli deve avere una forma rotonda; raccogliere le ovaie da cinque femmine e fissarle in 500 microlitri di soluzione modificata di car noise appena preparata.Possono quindi essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di 24 ore o più a lungo a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, immediatamente prima di preparare i vetrini per la dissezione delle ovaie, preparare la soluzione di carnoys e acido propionico al 50%. Posizionare ogni coppia di ovaie in una goccia di soluzione di carnoys fresca su un vetrino privo di polvere sotto un microscopio stereoscopico.Dividere le ovaie con l'ago da dissezione. Trasferire tutti i pezzi di ovaio su sei vetrini puliti con acido propionico al 50%. Separare i follicoli l'uno dall'altro utilizzando aghi da dissezione.Quindi rimuovere eventuali tessuti residui con un tovagliolo di carta. Aggiungere un'altra goccia di acido propionico al 50% e attendere da tre a cinque minuti. Si osserva che i follicoli rimangono in acido propionico al 50% per tre-cinque minuti, condizione che migliora significativamente la diffusione dei cromosomi.Successivamente, applicare un coprioggetto e attendere un altro minuto per diffondere i nuclei. Avvolgere il vetrino con carta da filtro e plastica. Impostare un Dremel tra 3.000 e 5.000 giri al minuto e, per circa un minuto, ruotare leggermente la punta del Dremel in movimento contro il coprioggetto.Verificare la qualità dello strato con un microscopio a contrasto di fase ed applicare il dremel per un periodo più lungo, se necessario, per appiattire i cromosomi. Posizionare un secondo vetrino coprioggetto accanto al primo, quindi inserire i vetrini coprioggetto tra un altro microscopio. Successivamente, avvolgere i vetrini con un foglio di plastica e carta filtrante, quindi inserire i vetrini avvolti in una morsa per comprimerli tra 85 e 120 inch pound.Dopo aver appiattito i cromosomi su tutte e sei le diapositive, svolgere le diapositive e rimuovere quelle aggiuntive per appiattire ulteriormente i cromosomi. Incubare le diapositive a 55 gradi Celsius per 10-15 minuti in un sistema di denaturazione e ibridazione per diapositive. Successivamente, immergere una diapositiva in azoto liquido per almeno 15 secondi o fino a quando non cesserà il bollicionamento.Quindi rimuovere rapidamente il coprioggetto con una lametta e posizionare immediatamente il vetrino in etanolo freddo al 50% per cinque minuti. Ripetere questo procedimento per ogni vetrino in modo sequenziale. Disidratare i vetrini in bagni di etanolo al 70%, al 90% e al 100%.Immergerli in ogni bagno per cinque minuti. Infine, dopo che i vetrini si sono asciugati all'aria, sono pronti per la FISH di colorazione. Un dispositivo automatizzato esegue la maggior parte dei passaggi della procedura, ad eccezione dell'etichettatura della sonda.Quindi, prima di caricare il dispositivo, preparare la sonda fluorescente etichettando il DNA con il fluorocromo utilizzando un protocollo commerciale di traduzione NIC. Con la sonda preparata, caricare i vetrini e i reagenti nell'apparecchio automatico per la colorazione. Programmare il sistema per eseguire i seguenti passaggi. In primo luogo, fornire 800 microlitri di una XPBS per 20 minuti.In secondo luogo, asciugare le vetrate con un getto di aria calda. In terzo luogo, fissare le vetrate con 450 microlitri di formalina al 4% in uno XPBS per un minuto. Quindi lavare le vetrate con etanolo al 100% per un secondo, due volte e per due minuti.Dopo il bagno in etanolo, asciugare nuovamente le lamelle con un getto d'aria. Riscaldare ora le lamelle a 45 gradi Celsius per due minuti per evitare la formazione di bolle. Applicare quindi 20 microlitri della sonda di DNA, seguiti da una goccia di olio minerale e da un'ulteriore coprioggetto; successivamente, denaturare i cromosomi a 90 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi impostare le diapositive per l'ibridazione a 42 gradi Celsius per 14 ore. Dopo l'ibridazione, eseguire i lavaggi di stringenza per due minuti a 42 gradi Celsius, seguiti da quattro applicazioni consecutive di due XSSC di un secondo ciascuna e asciugatura. Applicare quindi 800 microlitri di 0,4 XSSC a 42 gradi Celsius per 10 minuti, due volte, seguiti da un ulteriore lavaggio e da due XSSC a 25 gradi Celsius per 10 minuti.Ora applicare il colorante, 50 microlitri di yo-yo uno, seguito da olio minerale e da coprioggetti. Incubare i vetrini a 25 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente rimuovere i coprioggetti.Lavare i vetrini in due XSSC quattro volte per un secondo per ogni lavaggio e asciugarli soffiando. Infine, applicare 15 microlitri di reagente antiossidante prolungato gold su ogni vetrino e applicare nuovi coprioggetti. Accendere il sistema automatico di scansione Accord plus, iniziando dall'alimentatore Olympus U-R-F-L-T per una lampadina alogena.Quindi il computer e, infine, il microscopio con un'unità fotografica. Aprire ora innanzitutto il pacchetto software duet, impostare una pre-scansione 10x. Fare clic sul pulsante online, inserire un nuovo ID caso e assegnare un ID vetrino.Fare clic sul punto contrassegnato come bf. Questa è l'opzione campo chiaro. Selezionare una modalità di scansione per una pre-scansione a 10x.Selezionare 2, cerchio 500x, cerchio 10.000x o rettangolo. Fare clic su imposta ed eseguire. Quindi, ok, seguire le indicazioni per regolare correttamente la scansione e successivamente fare clic su fine.Per avviare la scansione, premere la scheda principale per tornare alla schermata principale. Ora fare clic sul pulsante offline, individuare l'ID del caso e l'ID del vetrino assegnati e fare clic su offline.Scansionare nella casella nera nell'angolo in alto a sinistra. Fare clic su una freccia e selezionare pre-scan 10x. Utilizzare le frecce per scorrere le immagini scansionate dopo aver trovato un'immagine di interesse.Fare doppio clic sullo schermo al centro della regione target e premere acquisisci. Questo consentirà di selezionare un'immagine da catturare in un momento successivo, dopo aver scelto tutte le zone di interesse. Fare clic con il tasto destro su ciascuna immagine, selezionare classifica, scegliere pre-scan 10 x e selezionare politan.Ritorna al menu principale e configura la pre-scansione 40x. Seleziona nuovamente online e scegli un vetrino. Cambia BF in ffl e modifica il nome dell'attività in revisit dash X 40 dash rg.Modificare la sezione immediatamente sotto l'ultima impostazione per rivedere completamente dash. Quindi eseguire il programma e seguire le istruzioni. Per configurare l'automazione, fare clic sul pulsante avvia abbinamento viste per abbinare le immagini a 10 x e 40 x.Fare clic su fine per avviare la scansione. Al termine, fare clic su classifica e osservare le immagini. Preparazioni di cromosomi politenici delle cellule nutrici ovariche di femmine di anomaly Gambia sono state ottenute utilizzando la tecnica ad alta pressione.Questo metodo non danneggia né altera la maggior parte della struttura cromosomica. Appiattisce i cromosomi piegati, rivelando così bande fini nascoste che non sono visibili su preparati normali. Il cromosoma è stato sottoposto a ibridazione con cloni di DNA inverso ottenuti dalla libreria inversa di S Gambia nd Tam.La libreria è stata generata da larve di primo stadio di entrambi i sessi della ceppa parassitaria di Anopheles gambiae. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un mappaggio fisico ad alto rendimento automatizzato, al fine di facilitare lo sviluppo rapido di assemblaggi genomici basati sui cromosomi.

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