High-throughput mappatura fisica dei cromosomi con modalità automatizzate In situ Ibridazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare le sonde di DNA sui cromosomi politani delle zanzare utilizzando una preparazione cromosomica ad alta pressione, seguita da ibridazione fluorescente automatizzata in C 2 e imaging automatizzato. Ciò si ottiene preparando prima le creme cromosomiche politane utilizzando un metodo ad alta pressione. Il passo successivo della procedura consiste nel preparare sonde fluorescenti etichettando il DNA genomico posteriore con il fluorocromo utilizzando un protocollo di traduzione Nick.

Il terzo passo consiste nell'eseguire l'ibridazione fluorescente in C 2 utilizzando sistemi automatizzati di colorazione dei vetrini. Il passaggio finale consiste nella scansione e nella fotografia dei cromosomi marcati utilizzando un sistema di imaging fluorescente automatico. In definitiva, le immagini possono mostrare la localizzazione di una sonda di DNA marcata in fluorescenza sul policromosoma.

Il vantaggio principale di questa tecnica o dei metodi esistenti, come un protocollo di ibridazione manuale in situ standard, è che il protocollo di mappatura fisica a più alto rendimento produce risultati più coerenti e riduce drasticamente il tempo di intervento. Questo protocollo inizia sezionando le femmine a mezza gravità e oly a circa 25 ore dopo l'alimentazione del sangue per raccogliere le ovaie quando sono al terzo stadio di Christopher. In questa fase, l'area trasparente con le cellule nutrici all'interno dei follicoli dovrebbe avere una forma rotonda, raccogliere le ovaie da cinque femmine e fissarle in 500 microlitri di soluzione di rumore dell'auto modificata appena fatta.

Possono quindi essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di 24 ore o più a lungo a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, appena prima di eseguire i vetrini di dissezione ovarica, preparare la soluzione di rumore dell'auto e l'acido propionico al 50%. Posizionare ogni paio di ovaie in una goccia di soluzione fresca per il rumore dell'auto su un vetrino privo di polvere sotto un microscopio da dissezione.

Dividere le ovaie con l'ago da dissezione. Trasferire tutti i pezzi di ovaia in sei vetrini puliti con acido propionico al 50%. Separare i follicoli l'uno dall'altro utilizzando aghi da dissezione.

Quindi pulisci i fazzoletti rimanenti con un tovagliolo di carta. Aggiungi un'altra goccia di acido proponico al 50% e attendi dai tre ai cinque minuti. La leggenda, i follicoli si trovano al 50% di acido proponico per tre o cinque minuti e migliora significativamente la diffusione cromosomica.

Quindi, applica un vetrino coprioggetti e attendi un altro minuto per diffondere i nuclei. Avvolgere il vetrino con carta da filtro e plastica. Impostare un Dremel tra tre e 5.000 giri/min e per circa un minuto far roteare leggermente una punta di dremel rotante contro il vetrino coprioggetti.

Confermare la qualità della diffusione con un microscopio di fase e applicare il dremel più a lungo, se necessario, per appiattire i cromosomi. Posizionare un secondo vetrino coprioggetti adiacente al primo, quindi inserire i vetrini coprioggetti con un altro microscopio. Scivolare successivamente, avvolgere le diapositive con un foglio di plastica e con carta da filtro, posizionare le diapositive in una morsa per spremere le diapositive a una dimensione compresa tra 85 e 120 pollici libbre.

Dopo aver appiattito i cromosomi su tutti e sei i vetrini, srotolare i vetrini e rimuovere i vetrini extra per appiattire ulteriormente i cromosomi. Incubare i vetrini a 55 gradi Celsius per 10-15 minuti in un sistema di ibridazione per denaturazione dei vetrini. Quindi, immergere un vetrino nell'azoto liquido per almeno 15 secondi o fino a quando il gorgogliamento non si è fermato.

Quindi rimuovere rapidamente il vetrino coprioggetti con una lama di rasoio e posizionare immediatamente il vetrino in etanolo freddo al 50% per cinque minuti. Ripetere questo processo per ogni diapositiva in sequenza. Disidratare i vetrini in un bagno al 70% a 90% e al 100% di etanolo.

Immergili in ogni bagno per cinque minuti. Infine, dopo che i vetrini si sono asciugati all'aria, sono pronti per il pesce per la colorazione. Un dispositivo automatizzato esegue la maggior parte dei passaggi della procedura, ad eccezione dell'etichettatura della sonda.

Quindi, prima di caricare il dispositivo, preparare la sonda fluorescente etichettando il DNA con il fluorocromo utilizzando un protocollo di traduzione NIC commerciale con la sonda preparata, caricare i vetrini e i reagenti nei vetrini automatizzati. Sistema di colorazione e programmare il sistema per eseguire i seguenti passaggi. Innanzitutto, erogare 800 microlitri di un XPBS per 20 minuti.

In secondo luogo, asciuga le diapositive. In terzo luogo, fissare i vetrini con 450 microlitri di formalina al 4% in un XPBS per un minuto. Quindi lavare i vetrini con etanolo al 100% per un secondo, due volte e per due minuti.

Una volta terminato il bagno di etanolo, asciugare nuovamente i vetrini. Ora riscalda i vetrini a 45 gradi Celsius per due minuti per evitare che si formino bolle. Quindi applicare 20 microlitri della sonda del DNA, seguiti da una goccia di olio minerale e un vetrino coprioggetti successivo in natura, i cromosomi a 90 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi impostare i vetrini in modo che si ibridano a 42 gradi Celsius per 14 ore. Dopo l'ibridazione, l'indurimento dei lavaggi rigorosi dura due minuti a 42 gradi Celsius, seguiti da quattro applicazioni consecutive di un secondo di due XSSC e dall'essiccazione. Quindi applicare 800 microlitri di 0,4 XSSC a 42 gradi Celsius per 10 minuti due volte, seguiti da un altro lavaggio e due XSSC a 25 gradi Celsius per 10 minuti.

Ora applica la macchia 50 microlitri di yo-yo seguita da olio minerale e vetrini coprioggetti. Incubare i vetrini a 25 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi rimuovere i vetrini coprioggetto.

Lavare le diapositive in due XSSC quattro volte per un secondo per lavaggio e asciugare le diapositive. Infine, applicare 15 microlitri di reagente anti-sbiadimento oro prolungato su ogni vetrino e applicare nuovi vetrini. Potenzia il sistema di scansione automatizzato Accord plus, a partire dall'alimentatore Olympus U-R-F-L-T per una lampadina alogena.

Poi il computer, e infine il microscopio con una fotocamera fissa. Ora apri prima il pacchetto software del duetto, imposta una pre-scansione 10x. Fare clic sul pulsante online, inserire un nuovo ID caso e assegnare un ID diapositiva.

Fai clic sul punto con l'etichetta bf. Questa è l'opzione del campo chiaro. Selezionare un'opzione di scansione per 10 x pre-scansione.

Seleziona 2, 500 x cerchio, 10, 000 x cerchio o rettangolo. Fare clic su Imposta ed esegui. E poi, ok, segui le istruzioni per regolare correttamente la scansione e quindi fai clic su Fine.

Per avviare la scansione, premere la scheda principale per tornare alla schermata principale. Ora fai clic sul pulsante offline, trova l'ID del caso e l'ID della diapositiva che è stato assegnato. E fai clic offline.

Scansiona nella casella nera nell'area in alto a sinistra. Fare clic su una freccia e selezionare 10 x pre-scansione. Usa le frecce per scorrere le immagini scansionate dopo aver trovato un'immagine di interesse.

Fare doppio clic sullo schermo al centro della regione di destinazione e premere snap. In questo modo verrà eseguita un'immagine da acquisire in un secondo momento, dopo aver selezionato tutti i destini. Fare clic con il pulsante destro del mouse su ciascuna immagine, fare clic su classifica, selezionare 10 x pre-scansione e selezionare polytan.

Torna al menu principale e imposta la pre-scansione 40x. Seleziona di nuovo online e seleziona una diapositiva. Cambia BF in ffl e cambia il nome dell'attività per rivisitare il trattino X 40 trattino rg.

Cambia la sezione proprio sotto l'ultima impostazione per rivisitare il trattino tutto. Quindi esegui il programma e segui le istruzioni. Per impostare l'automazione, fai clic sul pulsante Inizia ad abbinare le visualizzazioni per abbinare immagini 10x e 40x.

Fare clic su Fine per avviare la scansione. Una volta terminato, fai clic su Classifica e guarda le immagini. Le preparazioni di cromosomi politani delle cellule dell'infermiera ovarica provenienti dall'anomalia femminile del Gambia sono state realizzate utilizzando la tecnica dell'alta pressione.

Questo metodo non danneggia né modifica la maggior parte della struttura cromosomica. Appiattisce i cromosomi piegati e quindi rivela bande sottili nascoste che non si vedono nelle preparazioni regolari. Il cromosoma è stato sondato con cloni di DNA posteriore ottenuti dalla libreria di anomalie S Gambia e Tam.

La libreria è stata generata da maschio e femmina prima nella larva stellare dell'anomalia S Gambia ceppo parassita. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una mappatura fisica automatizzata ad alto rendimento al fine di facilitare il rapido sviluppo di assemblaggi genomici basati sui cromosomi.