Name: A Quantitative Analysis Fitness Workflow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Scopri l'analisi quantitativa del fitness microbico con QFA per studiare interazioni genetiche su scala genomica. Questo metodo computazionale utilizza piastre a 96 pozzetti e imaging automatizzato per misurare accuratemente la crescita microbica.

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Ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio e del Centro per la Biologia Sistema Integrato di Invecchiamento e Nutrizione (CISBAN) per il supporto e le discussioni utili. Questo studio è stato supportato da biotecnologia e Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) e il Wellcome Trust (075.294, 093.088).

<ol><li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).</li>
<li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li>
<li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonyzer%3A+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li>
<li>Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from:
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<li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://qfa.r-forge.r-project.org/">http://qfa.r-forge.r-project.org/</a> (2012).</li>
<li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li>
<li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70%CE%94mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li>
<li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li>
<li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+ecology%3A+The+social+side+of+wild+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

QFA è in molti sensi una diretta discendente di tre stabiliti banco scala tecniche microbiologiche: la cultura del test di diluizione in loco della serie 9, la determinazione della curva di crescita in colture liquide gassose 9 e placcatura replica 13. Questi tre metodi sono riassunte e confrontati con QFA ed altre tecniche ad alta produttività in Tabella 2. Considerando che la diluizione, saggi punti in serie di definire un ceppo di idoneità come la sua capacità di formare colonie in una serie di colture derivate da una serie di diluizioni di inoculo, QFA fitness ceppo misure con osservazioni ripetute di una singola cultura per costruire una curva di crescita. Quantificare il fitness da singole culture permette di molti ceppi di più per essere esaminate simultaneamente, in condizioni identiche. Replica di array di culture permette ripetute prove su collezioni estensimetri, più utile quando si verifica per le differenze culturali di fitness in ambienti diversi o sfondi genetici. Il protocollo QFA presentatoqui usa costose attrezzature robotiche di replicare, inoculare, incubare le piastre di agar e di immagini, adatto per osservare la crescita di migliaia di culture indipendenti (robotica QFA, Tabella 2). Tuttavia, poiché QFA si basa su consolidati, tradizionali tecniche di laboratorio, può anche essere effettuata molto più basso sostituendo assistenza robot con operazioni manuali (manuale QFA, Tabella 2). Manuale QFA coinvolge la replicazione e inoculo delle colture su piastre di agar con uno strumento manuale pin e il trasferimento manuale dei piatti da e per un incubatore per la fotografia. Lo stesso flusso di analisi computazionale può essere applicata per generare curve di crescita di entrambi disegno sperimentale. QFA stime fitness sembrano essere relativamente preciso. In figura 4, le convenienze medi di quattro gruppi di esempio funzionalmente delezioni di geni correlati sono evidenziati. La vicinanza dei membri di ciascuna classe funzionale gene correlato in due indisfondi ent genetiche ura3Δ e CDC13-1) indica la riproducibilità dei QFA stime fitness. Ad esempio, solo 3 delezioni geniche (su un massimo di 4.300) separare i tre membri del complesso MRX conservato. Throughput elevato alternative QFA per testare le caratteristiche di crescita di ceppi microbici includono SGA 5,6, schermi concorrenza librerie a barre 11,12 e schermi cattura cinetica densità ottica in lettori di piastre spettrofotometrici 10 che sono riassunti nella Tabella 2 e descritto più dettagliatamente altrove 8 . QFA e piastre SGA, in cui le culture crescono su superfici solide (agar agar metodi basati, Tabella 2) possono essere gestite in modo rapido e facilmente robot. Solid culture superficie dell&#39;agar sono ben aerati in tutta la crescita e le cellule possono crescere in colture fisse, consentendo microbi socievoli di crescere in una comunità 14. Lasciato intatto, una comunità microbicheffect proprie micro-ambienti, tossine secernono come etanolo, ed eventualmente di segnalazione tra cellule. Tuttavia, continua mescolanza di culture liquidi, necessari per raggiungere una adeguata aerazione, artificialmente sconvolge le comunità microbiche e le loro micro-ambienti che possano pregiudicare il loro modalità di crescita. Cross-contaminazione è meno di una preoccupazione nei metodi di agar solido poiché non vi è meno possibilità di schizzi di liquidi tra le cellule che trasportano le culture. Se la contaminazione avviene per stranieri aerodispersi microbi nei saggi agar solido, spesso può essere rilevata mediante ispezione visiva delle piastre di agar solido e contabilizzati o rimosso. Velocità QFA è significativamente superiore a quello dei metodi parallele liquido in due modi. Prima di tutto, e il QFA (SGA), piatti, colture inoculate sono imballate insieme più densamente, dando culture più indipendenti per piastra. In QFA ci sono culture in genere 308, senza contare le culture non-sperimentali bordo (Figura 1) COMconfrontato in parallelo colture liquide con 96 o 100 culture per piastra. In secondo luogo, gli esperimenti QFA può essere scalata a un numero maggiore di piastre. Considerando che il numero di piastre analizzati in un singolo esperimento QFA è limitato soltanto dallo spazio disponibile in una stanza incubatore o calda, la frequenza minima consentita l&#39;acquisizione di immagini e la frequenza massima di acquisizione ottenibile, il numero di piastre in un esperimento crescita liquido è fortemente limitata dalla capacità del lettore di piastre (tipicamente uno o due piastre), o del raccoglitore collegato al lettore di piastre (normalmente 25-50 piastre). Abbiamo recentemente effettuato un esperimento completamente automatizzato QFA su 123 piastre, ciascuna con 308 culture sperimentali, dando 37,884 culture contemporanee. Stimiamo che il numero massimo raggiungibile di culture indipendenti che crescono in liquido è 96 (culture / piastra) x 50 (piastre / raccoglitore) = 4800, che è di circa dieci volte inferiore rispetto alla nostra velocità QFA. Un&#39;alternativa per schermi coltura liquidi è quello di utilizzare molti gro automatizzatowth dispositivi in parallelo (tabella 1 dal recensione di Blomberg 8), ciascuno avente una capacità di una o due piastre. Il controllo della temperatura in ogni dispositivo è indipendente, e quindi le condizioni non sono identici, ma assumendo che siano, questo flusso di lavoro richiederebbe almeno 190 di tali dispositivi in ​​modo che corrisponda il throughput QFA (assumendo 200 colture liquide per dispositivo). In sintesi, QFA è un flusso di lavoro di alta qualità che può essere utilmente applicato per raccogliere fenotipi crescita quantitativa sia in piccoli esperimenti su scala mirati e high-throughput schermi. E &#39;sufficientemente flessibile per essere applicato efficacemente con diversi requisiti per le apparecchiature robotica. La componente di calcolo del flusso di lavoro si basa su QFA liberamente disponibile, il codice open source.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 pin manuale pintool con 1/8 pin diametro &quot; </td></tr><tr><td> Mescolare Mate </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Installato su Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 ripiano giostra rotante </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Manuale di imaging ad alta risoluzione </td></tr><tr><td> spImager con Cytoma </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Costume </td><td> Temperatura controllata automatizzato di imaging ad alta risoluzione </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 con scambiatore di calore </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> Collegato al spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> Collegato al Cytomat </td></tr><tr><td> spImager con il carosello </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Costume </td><td> Automated imaging ad alta risoluzione </td></tr><tr><td> Robot strumento dispositivo pin per FP12pins </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 pin </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm di lunghezza, 17 mm di lunghezza esposto pin </td></tr><tr><td> Docking Station per lo strumento di Pin </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> Base docking station rimosso per consentire l&#39;essiccazione fan dei perni </td></tr><tr><td>Pin Spazzola di pulizia </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Pin utensile manuale </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray con coperchio </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 piastre di polistirene e sterili </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 coperchi in polistirene e sterili </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Reagenti e attrezzature specifiche.

a quantitative analysis fitness workflow

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Fitness Quantitative Analysis (QFA) è un flusso di lavoro sperimentale e computazionale per confrontare convenienze delle colture microbiche cresciute in parallelo 1,2,3,4. QFA può essere applicato alle osservazioni focalizzate su singole culture, ma è molto utile per genome-wide interazione genetica o studiando schermi di droga fino a migliaia di culture indipendenti. Il metodo sperimentale è centrale l&#39;inoculazione di indipendenti, diluiti colture liquide microbiche su piastre di agar solido che vengono incubate e regolarmente fotografato. Fotografie di ciascun punto temporale vengono analizzati, producendo quantitativi stime di densità cellulari, che vengono utilizzati per costruire curve di crescita, consentendo misure quantitative di fitness da derivati. Convenienze della cultura può essere paragonato a quantificare e classificare i punti di forza di interazione genetica o sensibilità di droga. L&#39;effetto sul fitness cultura di eventuali trattamenti aggiunto in agar substrato (ad esempio piccole molecole, antibiotici o sostanze nutritive), ovvero applicati alle piastre esternely (ad esempio irradiazione UV, temperatura) può essere quantificato QFA. Il flusso di lavoro QFA produce crescita stime analoghi a quelli ottenuti mediante misurazione spettrofotometrica della paralleli colture liquide in lettori di piastre da 96 pozzetti o 200-bene. È importante sottolineare che, QFA ha un throughput significativamente più alto rispetto a tali metodi. Culture QFA crescere su una superficie solida agar e sono pertanto ben aerato durante la crescita senza la necessità di mescolamento o agitazione. Il throughput QFA non è così elevata come quella di alcuni Array sintetico genetica (SGA) metodi di screening 5,6. Tuttavia, poiché le culture QFA sono fortemente diluiti prima di essere inoculato su agar, QFA in grado di catturare le curve di crescita più complete, tra cui esponenziale e le fasi di saturazione 3. Ad esempio, le osservazioni curva di crescita consentire tempi di duplicazione di coltura per stimare direttamente con elevata precisione, come discusso in precedenza 1. Qui vi presentiamo unospecifico protocollo QFA applicata a migliaia di S. cerevisiae culture che vengono automaticamente gestite da robot durante l &#39;inoculazione, incubazione e di imaging. Qualsiasi di queste fasi automatizzate può essere sostituito da un equivalente, procedura manuale, con associata una riduzione nella velocità, e si presentano anche un protocollo inferiore manuale velocità. Gli stessi strumenti software QFA possono essere applicati alle immagini catturate in entrambi flusso di lavoro. Abbiamo una vasta esperienza applicando QFA alle culture del lievito nascente S. cerevisiae ma ci aspettiamo che QFA si rivelerà altrettanto utile per l&#39;esame delle culture del lievito di fissione S. pombe e culture batteriche.

Fitness Quantitative Analysis (QFA) è una serie complementare di metodi sperimentali e computazionali per la stima convenienze coltura microbica. QFA stima l&#39;effetto di mutazioni genetiche, farmaci o altri trattamenti applicati sulla crescita microbica. Esperimenti di scala dall&#39;analisi focalizzata di singole culture a migliaia di colture in parallelo possono essere progettati.

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

L'analisi quantitativa della fitness (QFA, Quantitative Fitness Analysis) è un flusso di lavoro sperimentale e computazionale per confrontare la fitness di colture microbiche cresciute in parallelo1,2,3,4. ...

Lo scopo di questa procedura è catturare in parallelo fitness quantitativi delle colture microbiche su scala genomica in modo preciso e ad alto rendimento. Questo viene ottenuto innanzitutto trasferendo una libreria ordinata di colonie microbiche in piastre a 96 pozzetti e coltivando le culture fino alla saturazione. Successivamente, le colture sature vengono diluite in acqua e quindi depositate su piastre solide contenenti agar.Successivamente, le piastre solide con agar vengono fotografate periodicamente fino a quando la crescita della colonia microbica non raggiunge la saturazione. Infine, le fotografie ottenute nel corso del tempo sulla crescita di ciascuna coltura vengono convertite in misure quantitative della densità cellulare e le curve di crescita osservate vengono analizzate mediante modelli di crescita e misure quantitative dell'idoneità microbica. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano evidenze di interazioni genetiche, dimostrando che ceppi microbici presentano idoneità diverse quando sono combinati con diverse mutazioni o cresciuti in condizioni differenti.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i metodi di pinning ad alta densità o gli esperimenti di competizione con barcode, è che le misurazioni del fitness sono più accurate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo di farmaci antitumorali, ad esempio quali geni e processi siano importanti nella risposta al danno del DNA e al controllo del ciclo cellulare, e a comprendere e tradurre tali ricerche e organismi microbici di base nella forma di potenziali bersagli farmacologici nelle cellule tumorali umane. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione dei telomeri e sulla visi.può essere applicato anche ad altre aree della biologia dei lieviti o, in effetti, a qualsiasi settore in cui i fenotipi di fitness possano fornire informazioni sulla biologia microbica. Speriamo che la QFA possa essere applicata a molti altri organismi microbici per i quali esistono librerie in array. Ad esempio, povi e coli, orilla surplus Partendo da colture sature notturne, sono stati seminati fino a 96 ceppi indipendenti di lievito in volumi di 200 microlitri di mezzo liquido ricco.In una piastra da coltura a 96 pozzetti, sterilizzare un replicatore manuale a 96 perni, con diametro di un ottavo di pollice, immergendolo prima in etanolo al 100%, quindi flameggiandolo e lasciandolo raffreddare. Aggiungere 200 microlitri di acqua sterile nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, vortexare colture di lievito sature e diluirle immergendo lo strumento a perni sterilizzato nelle colture per tre volte, quindi una volta nella piastra contenente l'acqua. Sterilizzare nuovamente lo strumento a perni e lasciarlo raffreddare prima di immergerlo per tre volte nelle colture diluite. Trasferire quindi il perno su una piastra solida di agar.Dopo l'incubazione delle piastre in agar, utilizzare un lettore SP robotico s e p per acquisirne manualmente le immagini a fini di coltura automatizzata. Iniziare con un array rettangolare di ceppi di lievito indipendenti coltivati su agar solido. In questo esempio, i ceppi iniziali sono il risultato dell'incrocio tra una mutazione query sensibile alla temperatura e la collezione di delezioni del lievito.1.536 colture, rappresentanti quattro repliche di 384 ceppi indipendenti di lievito, vengono coltivate su piastre SGA utilizzando un robot con uno strumento sterile a 96 perni, ciascuno con diametro di un millimetro, trasferendo 384 dei 1.536 ceppi in 4 piastre colturali da 96 pozzetti contenenti 200 microlitri di mezzo selettivo; le colture vengono quindi fatte crescere a 20 gradi Celsius fino alla saturazione. Per effettuare il prelievo delle colture di lievito sature, iniziare trasferendole su un robot per la manipolazione di liquidi e Resus sospendendole su uno shaker magnetico; diluire le colture a circa uno a 70 utilizzando uno strumento sterile a 96 perni robotizzato per trasferirle in 200 microlitri di acqua sterile.Dopo aver pulito e sterilizzato lo strumento a spilli, depositare le colture diluite su piastre di agar. Nel formato 384 pozzetti, trasferire le piastre in un incubatore umidificato a temperatura controllata dotato di carosello automatico e sportello di accesso. Per immagini le colture, utilizzare un imaginer automatico robotizzato, che rimuove ripetutamente le piastre dall'incubatore, toglie i coperchi, le trasferisce in uno spazio uniformemente illuminato al di sotto di una fotocamera da 35 millimetri e acquisisce un'immagine a 5.184 per 3.456.La risoluzione dei pixel sostituisce il coperchio, quindi reinserisce le piastre nel carosello dell'incubatrice per tracciare le posizioni delle colture sulle piastre e i trattamenti applicati. Le piastre vengono codificate automaticamente con un codice a barre in base al nome dell'incubatrice, alla temperatura, al numero di serie univoco del lotto e alla posizione all'interno dell'incubatrice. I nomi delle immagini sono una concatenazione del nome della piastra e del timestamp, e vengono generati automaticamente al momento dell'acquisizione dell'immagine.Le piastre vengono spesso etichettate manualmente anche per assicurare che mantengano lo stesso ordine durante il trasferimento tra i caroselli robotizzati. I file di metadati sono file di testo delimitati da tabulazioni, generati manualmente. Il file di descrizione dell'esperimento FT due.La tabella uno è unica per ogni esperimento, ma la descrizione della libreria FT tre, tabella uno può essere riutilizzata ampiamente. Una volta costruito, l'esperimento viene descritto nel file di descrizione sperimentale FT due, tabella uno, contenente colonne per il codice a barre o il nome automaticamente generato della piastra, il timestamp di inizio dell'esperimento, il trattamento della piastra, il contenuto del mezzo solido agarizzato, il nome dello schermo, il numero della piastra della libreria per librerie con più piastre e un numero di quadrante di ripetizione per la riduzione dal formato 1.536 pozzetti al formato 384 pozzetti. La libreria di ceppi e viene descritta con un file di descrizione della libreria FT tre, tabella uno che indica il genotipo coltivato in ciascuna posizione di coltura.In ogni piastra di una libreria sono presenti le colonne quattro, nome della libreria, ORF, numero della piastra, riga e colonna della piastra, e una colonna opzionale per note. Può essere fornito un file opzionale con i nomi standard dei geni FT quattro, tabella uno, che descrive il nome standard del gene associato a ciascun numero sistemico di ORFY, identificando i ceppi sottoposti a screening. Questo file contiene due colonne, ORF e nome del gene, per l'analisi dei dati.Il flusso di lavoro computazionale QFA richiede l'accesso a un'unità centrale multi-core ragionevolmente potente sulla quale installare il software di analisi delle immagini colonizer e il pacchetto QFAR, entrambi disponibili gratuitamente e documentati online, che funzionano su diverse piattaforme operative. Eseguire colonizer utilizzando ciascuna delle immagini delle piastre acquisite come input, generando un file di output di colonizer FT5, tabella 1 per ogni immagine acquisita; i file di output di colonizer specificano le stime della densità delle colture, l'area, la forma e il colore delle colture.Per ciascuna delle 384 posizioni sulla piastra dell'immagine, un nome di file di output viene automaticamente copiato dal nome del file immagine sorgente. Il pacchetto QFAR contiene funzioni seldens per i corsi temporali di ciascuna coltura, al fine di adattare modelli logistici generalizzati alle osservazioni e per creare grafici. Si vedano le figure due e tre per degli esempi.I valori dei parametri stimati vengono scritti nei file dei parametri logistici QFA. Il pacchetto QFAR contiene inoltre funzioni per il controllo di qualità. Le colonie periferiche vengono scartate a causa della maggiore disponibilità di nutrienti ai bordi della piastra e delle difficoltà nell'analisi delle immagini.Le colture vicino ai bordi delle piastre e quelle che non hanno superato l'SGA, nonché i genotipi che mostrano associazione con geni marcatore specifici dello schermo, vengono esclusi dall'analisi. Diversi parametri quantitativi della fitness sono derivati dai parametri del modello logistico della popolazione per ciascuna coltura. Tali parametri includono i tassi massimi di raddoppiamento della popolazione e il numero di divisioni dal momento dell'inoculo fino alla saturazione, per ogni serie di colture replicate e per ogni definizione di fitness.Vengono calcolate diverse statistiche riassuntive delle stime di fitness: media e mediana del fitness, deviazione standard del fitness e numero di repliche osservate. Le statistiche riassuntive vengono registrate nei file riassuntivi del fitness QFA FT otto, tabella uno, per ulteriori analisi. Ad esempio, calcoli dei punteggi di interazione genetica FT nove, tabella uno.Questa figura mostra una curva di crescita tipica su scala logaritmica OTTENUTA MEDIANTE QFA 384. Le colture crescono a 20 gradi Celsius su agar solido, come quantificato da colonizer, con un aumento della densità cellulare prima rilevabile dopo circa due giorni. Questo ritardo è probabilmente dovuto all'effetto combinato di una fase di latenza della coltura dopo l'inoculazione su mezzo solido e di un limite inferiore di rilevamento della densità cellulare.Qui, 308 curve di crescita simili sono state ottenute da una singola piastra. Si noti che i ceppi che hanno prodotto una linea piatta erano molto deboli o morti. Questa figura illustra il confronto tra due schermate QFA su scala genomica per dedurre l'intensità delle interazioni genetiche.Il pacchetto QFAR include anche funzioni per produrre il grafico della curva di crescita precedente e per generare liste ordinate di genotipi esaminati e stime dell'intensità dell'interazione genetica. Insieme a un valore Q per la significatività della GIS osservata, una volta acquisita padronanza, un esperimento QF.A a quattro repliche su scala genomica completa può essere portato a termine entro tre settimane. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di essere organizzati nel tracciamento e nella denominazione di tutte le piastre e delle immagini.Tutte le piastre devono essere inoculate e i punti devono essere posizionati nell'orientamento e nell'ordine corretti. L'analisi dei dati si basa sulla correttezza dei file di testo ausiliari creati dallo scienziato sperimentale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stimare la fitness di migliaia di colture microbiche indipendenti.Le fitness vengono stimate ripetendo la fotografia di colture macchiate, cresciute su piastre solide di agar, convertendo le immagini acquisite in stime della densità cellulare e generando curve di crescita. La modellizzazione matematica delle curve di crescita fornisce stime quantitative della fitness, che possono quindi essere utilizzate per dedurre relazioni funzionali tra prodotti genici su scala genomica.

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Vi presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale delle biblioteche unico sito di saturazione di mutagenesi complete di proteine ​​che utilizzano high-throughput sequencing. È importante sottolineare che questo approccio utilizza coppie di primer ortogonali al multiplex di costruzione di biblioteche e sequenziamento. Risultati rappresentativi utilizzando TEM-1 β-lattamasi selezionato ad un dosaggio clinicamente rilevante di ampicillina sono forniti.

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Una metodologia efficace e semplice per l'analisi computer basato su un comportamento nuoto nematode in un liquido è descritto. Il metodo richiede poco o nessun investimento per C. elegans laboratori. L'hardware utilizzato è standard, e il software per l'analisi comportamentale (Celest) è un open source uno.

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Questo approccio molecolare per determinare la forma fisica batterica facilita il rilevamento preciso e preciso dei microrganismi utilizzando codici a barre specifici del DNA genomico quantificati tramite PCR digitale. Il protocollo descrive il calcolo dell'indice concorrenziale per i ceppi di Salmonella;  tuttavia, la tecnologia è facilmente adattabile ai protocolli che richiedono la quantificazione assoluta di qualsiasi organismo geneticamente malleabile.

Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

Il Framework eVOLVER consente una coltura microbica continua ad alta produttività con alta risoluzione e controllo dinamico sui parametri sperimentali. Questo protocollo illustra come applicare il sistema per condurre un esperimento di fitness complesso, guidando gli utenti a programmare il controllo automatizzato su molte culture individuali, misurando, raccogliendo e interagendo con i dati sperimentali in tempo reale.

Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER

Il presente protocollo fornisce una soluzione pratica che consente di misurare l'apoptosi, il potenziale di membrana mitocondriale e il danno al DNA negli spermatozoi umani con un singolo citometro.

Analisi citofluorimetrica di biomarcatori per la rilevazione di difetti funzionali degli spermatozoi umani

Questo protocollo descrive come mantenere l'esperimento di evoluzione a lungo termine (LTEE) di Escherichia coli eseguendo i suoi trasferimenti giornalieri e congelamenti periodici e come condurre test di competizione per misurare i miglioramenti della forma fisica nei batteri evoluti. Queste procedure possono servire come modello per i ricercatori che iniziano i propri esperimenti di evoluzione microbica.

Trasferimenti giornalieri, archiviazione delle popolazioni e misurazione dell'idoneità nell'esperimento di evoluzione a lungo termine con Escherichia coli

Presentiamo un flusso di lavoro flessibile ed estendibile basato su Jupyter-lab per l'analisi non supervisionata di set di dati multi-omici complessi che combina diverse fasi di pre-elaborazione, stima del modello di analisi fattoriale multi-omica e diverse analisi a valle.

Applicazione dell'analisi fattoriale multi-omica non supervisionata per scoprire modelli di variazione e processi molecolari legati alle malattie cardiovascolari

La tecnologia indossabile ha un costo contenuto e offre un comodo monitoraggio dei dati fisiologici. Tuttavia, l'accuratezza e l'affidabilità di questi dispositivi richiedono una valutazione cauta per garantirne l'efficacia e la sicurezza per gli utenti. Questo rapporto descrive il processo di convalida di uno smartwatch commerciale nel monitoraggio dei dati fisiologici e dell'attività fisica.

Valutazione dell'accuratezza dei dati degli smartwatch fitness per il monitoraggio dell'attività cardiovascolare e fisica: uno studio di convalida in Digital Health

Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Scopri l'analisi quantitativa del fitness microbico con QFA per studiare interazioni genetiche su scala genomica. Questo metodo computazionale utilizza piastre a 96 pozzetti e imaging automatizzato per misurare accuratemente la crescita microbica.

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

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