A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Lo scopo di questa procedura è quello di catturare l'idoneità quantitativa della coltura microbica in parallelo su una scala genomica in modo preciso e ad alto rendimento. Ciò si ottiene con il primo Turing e la libreria array di colonie microbiche in piastre a 96 pozzetti e facendo crescere la coltura fino alla saturazione. Successivamente, le colture sature vengono diluite in acqua e quindi individuate su piastre di agar solide.

Quindi le piastre solide vengono fotografate periodicamente e fino a quando la crescita della colonia microbica non è satura. Infine, le fotografie dell'andamento temporale della crescita di ciascuna coltura vengono convertite in misure quantitative della densità cellulare e vengono riassunte le curve di crescita osservate con modelli di crescita e misure quantitative di fitness microbica. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano l'esistenza di interazioni genetiche dimostrando che i ceppi microbici hanno fitness diverse quando sono combinati con mutazioni diverse o cresciuti in condizioni diverse.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i metodi di pinning ad alta densità come SGA o gli esperimenti di competizione con codici a barre, è che le misurazioni della fitness sono più accurate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo di farmaci antitumorali, come ad esempio quali geni e processi sono importanti nella risposta al danno al DNA e nel controllo del ciclo cellulare, comprendendo e traducendo tali ricerche e microrganismi di base sotto forma di potenziali bersagli farmacologici nelle cellule tumorali umane. Anche se questo metodo può fornire informazioni sulla funzione dei telomeri e sui visi.

Può anche essere applicato ad altre aree della biologia del lievito o a qualsiasi area in cui i fenotipi di fitness possono fornire informazioni sulla biologia microbica. Speriamo che la QFA possa essere applicata a molti altri organismi microbici per i quali esistono librerie di array. Ad esempio, povi e coli, orilla surplus A partire da colture notturne sature hanno riprodotto fino a 96 ceppi di lievito indipendenti in volumi di 200 microlitri di terreno liquido ricco.

In un piatto ben coltivato 96 sterilizzare un perno 96, un ottavo di pollice di diametro replica manuale platter immergendolo prima in etanolo al 100%, quindi fiammeggiandolo e lasciandolo raffreddare array, 200 microlitri di acqua sterile nei pozzetti di un vortice di piastre a 96 pozzetti ha colture di lievito sature e diluire immergendo lo strumento pin sterilizzato nei ceppi tre volte. Quindi, una volta nella piastra contenente l'acqua, sterilizzare lo strumento a spillo e lasciarlo raffreddare prima di immergerlo tre volte nelle colture diluite. Quindi trasferire il perno su una piastra di agar solida.

Dopo aver incubato le piastre di agar, utilizzare un imager SP di s and p robotics per visualizzarle manualmente per la coltura automatizzata. Inizia con una serie rettangolare di ceppi di lievito indipendenti coltivati su agar solido. In questo esempio, i ceppi iniziali sono il risultato dell'incrocio di una mutazione di query sensibile alla temperatura con la raccolta di delezione del lievito.

1.536 colture che rappresentano quattro repliche di 384 ceppi di lievito indipendenti vengono coltivate su piastre SGA utilizzando un robot con un pin sterile da 96 pin, un millimetro di diametro che trasferisce 384 dei 1.536 ceppi in 4.96. Le piastre di coltura contengono 200 microlitri di terreno selettivo per far crescere le colture a 20 gradi Celsius fino alla saturazione. Per individuare le colture di lievito saturo, inizia trasferendole su un robot per la manipolazione dei liquidi e Resus, sospendendole su un agitatore magnetico, diluisce le colture a circa uno a 70 utilizzando uno strumento a spillo robotico sterile a 96 pin per appuntare 200 microlitri di acqua sterile.

Dopo aver pulito e sterilizzato lo strumento a spillo, individuare le colture diluite su piastre di agar. Nel formato 384, trasferire le piastre in un'incubatrice umidificata a temperatura controllata con giostra automatica e portello di accesso. Per visualizzare le colture utilizzare un imager robotico automatizzato, che rimuove ripetutamente le piastre dall'incubatrice, rimuove i coperchi, li trasferisce in uno spazio illuminato uniformemente sotto una fotocamera da 35 millimetri, cattura un'immagine a 5, 184 per 3, 456.

La risoluzione dei pixel sostituisce il coperchio, quindi li riporta al carosello dell'incubatrice per tenere traccia delle posizioni delle colture sulle piastre e dei trattamenti applicati ad esse. Le piastre vengono automaticamente codificate a barre in base al nome dell'incubatrice, alla temperatura, al numero di lotto sequenziale univoco e alla posizione nell'incubatrice. I nomi delle immagini sono una concatenazione del nome della targa e del timestamp e vengono generati automaticamente al momento dell'acquisizione dell'immagine.

Le piastre sono spesso etichettate manualmente per garantire che rimangano nello stesso ordine durante il trasferimento tra i caroselli dei robot. I file di metadati sono file di testo delimitati da tabulazioni, che vengono generati manualmente. Il file di descrizione sperimentale FT due.

La tabella uno è unica per ogni esperimento, ma la descrizione della libreria FT tre, la tabella uno può essere riutilizzata ampiamente. Una volta costruito, l'esperimento è descritto nel file di descrizione dell'esperimento FT due tabella uno contenente colonne per il codice a barre o il nome della piastra generato automaticamente, l'esperimento di avvio del trattamento della piastra, il contenuto del trattamento della piastra dell'agar solido, il nome dello schermo del medium dell'agar, il numero della piastra della libreria per le librerie con più piastre e un numero di quadrante ripetuto per il ridimensionamento da 1.536, il formato del pozzetto a 384. La libreria dei ceppi è descritta con un file di descrizione della libreria FT tre, la cui tabella indica il genotipo coltivato in ogni luogo di coltura.

In ogni targa di una biblioteca, contiene le colonne quattro, il nome della biblioteca, l'ORF, la targa della targa, la colonna della targa della riga e una colonna delle note opzionale. Un file opzionale del nome del gene standard può essere fornito FT quattro, la tabella uno che descrive il nome del gene standard associato a ciascun numero ORFY sistematico, identificando i ceppi sottoposti a screening. Questo file contiene due colonne, ORF e nome del gene per l'analisi dei dati.

Il flusso di lavoro computazionale QFA richiede l'accesso a una workstation di computer multi-core ragionevolmente potente su cui è installato. Lo strumento software di analisi delle immagini del colonizzatore e il pacchetto QFAR, entrambi documentati online, sono disponibili gratuitamente e funzionano su una vasta gamma di sistemi operativi. Eseguire il colonizzatore con ciascuna delle immagini della lastra catturate come input generando un file di output del colonizzatore FT cinque, una tabella per ogni immagine acquisita file di output del colonizzatore, specificare le stime della densità della coltura, la cultura, l'area, la forma e il colore.

Per ciascuna delle 384 posizioni sulla lastra immagine, un nome di file di output viene copiato automaticamente dal nome del file di immagine sorgente. Il pacchetto QFAR contiene funzioni selezionate per i corsi temporali per ogni cultura per adattare i modelli logistici generalizzati della popolazione alle osservazioni e al tracciato. Entrambi vedono le figure due e tre per esempi.

I valori dei parametri adattati vengono scritti nei file dei parametri logistici QFA. Il pacchetto QFAR contiene anche funzioni per il controllo qualità. Le colonie di bordi vengono scartate a causa della maggiore disponibilità di nutrienti ai bordi della piastra e della difficoltà con l'analisi delle immagini.

Le pareti e le colture in prossimità delle placche, che hanno fallito l'SGA e i genotipi che mostrano un legame con i geni marcatori specifici dello schermo, vengono eliminati dall'analisi. Diverse misure quantitative di fitness sono derivate dai parametri del modello logistico della popolazione per ciascuna cultura. Questi includono i tassi massimi di raddoppio della popolazione e il numero di divisioni dall'inoculazione alla saturazione per ogni serie di colture replicate e per ogni definizione di fitness.

Diverse statistiche riassuntive delle stime di fitness sono calcolate la fitness media e media, la deviazione standard di fitness e il numero di repliche osservate. Le statistiche riassuntive vengono inviate ai file di riepilogo della forma fisica QFA FT otto, tabella uno per ulteriori analisi. Ad esempio, i calcoli dell'interazione genetica segnano FT nove tabella uno.

Questa figura mostra una tipica curva di crescita su scala logaritmica OUTTA 384 QFA. Colture che crescono a 20 gradi Celsius su agar solido quantificato dal colonizzatore con un aumento della densità cellulare rilevabile per la prima volta dopo circa due giorni. Questo ritardo è probabilmente un effetto combinato di una fase di ritardo della coltura dopo l'inoculazione su terreno solido e di un limite inferiore di rilevamento per la densità cellulare.

Qui, 308 curve di crescita simili sono state catturate da una singola piastra. Si noti che i ceppi che producevano una linea piatta erano molto malati o morti. Questa figura dimostra il confronto di due screening QFA a livello di genoma per dedurre i punti di forza dell'interazione genetica.

Il pacchetto QFAR include anche funzioni per produrre il precedente valore della curva di crescita e per produrre elenchi classificati di genotipi esaminati e stime della forza dell'interazione genetica. Insieme a un valore Q per il significato del GIS osservato, una volta padroneggiato un QF completo di quattro repliche a livello di genoma. Un esperimento può essere completato entro tre settimane. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di essere organizzati nel tracciamento e nella denominazione di tutte le lastre e le immagini.

Tutte le piastre devono essere inoculate e posizionate con l'orientamento corretto e l'ordine ulteriore. L'analisi dei dati si basa sulla correttezza dei file di testo ausiliari costruiti dallo scienziato sperimentale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stimare l'idoneità di migliaia di colture microbiche indipendenti.

Le fitness vengono stimate fotografando ripetutamente colture maculate, che crescono su piastre di agar solide, convertendo le immagini catturate in stime della densità cellulare e generando curve di crescita. La modellazione matematica delle curve di crescita fornisce stime quantitative di fitness, che possono quindi essere utilizzate per dedurre relazioni funzionali tra i prodotti genici su una scala genomica ampia.