A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Lo scopo di questa procedura è catturare in parallelo fitness quantitativi delle colture microbiche su scala genomica in modo preciso e ad alto rendimento. Questo viene ottenuto innanzitutto trasferendo un'array library di colonie microbiche in piastre a 96 pozzetti e coltivando la coltura fino alla saturazione. Successivamente, le colture sature vengono diluite in acqua e quindi depositate su piastre solide di agar.

Successivamente, le piastre solide con agar vengono fotografate periodicamente fino a quando la crescita della colonia microbica non raggiunge la saturazione. Infine, le fotografie sequenziali della crescita di ciascuna coltura vengono convertite in misure quantitative della densità cellulare e le curve di crescita osservate vengono analizzate mediante modelli di crescita, sintetizzando misure quantitative del fitness microbico. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano evidenze di interazioni genetiche, dimostrando che ceppi microbici presentano fitness diversi quando sono combinati con diverse mutazioni o cresciuti in condizioni differenti.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i metodi di pinning ad alta densità o gli esperimenti di competizione con barcode, è che le misurazioni del fitness sono più accurate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo di farmaci antitumorali, ad esempio quali geni e processi siano importanti nella risposta al danno del DNA e nel controllo del ciclo cellulare, e a comprendere e tradurre tali ricerche e organismi microbici di base nella forma di potenziali bersagli farmacologici nelle cellule tumorali umane. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione dei telomeri e sulla visi.

Si può applicare anche ad altre aree della biologia dei lieviti o, in generale, a qualsiasi settore in cui i fenotipi di fitness possano fornire informazioni sulla biologia microbica. Speriamo che la QFA possa essere applicata a molti altri organismi microbici per i quali esistono librerie in array. Ad esempio, povi e coli, orilla surplus A partire da colture sature notturne, sono stati seminati fino a 96 ceppi indipendenti di lievito in volumi di 200 microlitri di mezzo liquido ricco.

In una piastra da coltura a 96 pozzetti, sterilizzare un replicatore manuale a 96 perni, con diametro di un ottavo di pollice, immergendolo prima in etanolo al 100%, quindi flameggiandolo e lasciandolo raffreddare. Disporre 200 microlitri di acqua sterile nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, vortexare colture di lievito sature e diluirle immergendo lo strumento a perni sterilizzato nelle colture per tre volte, quindi una volta nella piastra contenente l'acqua. Sterilizzare nuovamente lo strumento a perni e lasciarlo raffreddare prima di immergerlo per tre volte nelle colture diluite. Trasferire quindi il perno su una piastra solida di agar.

Dopo l'incubazione delle piastre di agar, utilizzare un lettore SP robotico s and p per acquisirne manualmente le immagini a fini di coltura automatizzata. Iniziare con un array rettangolare di ceppi indipendenti di lievito coltivati su agar solido. In questo esempio, i ceppi iniziali sono il risultato dell'incrocio tra una mutazione query sensibile alla temperatura e la collezione di delezioni del lievito.

1.536 colture, rappresentanti quattro repliche di 384 ceppi indipendenti di lievito, vengono coltivate su piastre SGA utilizzando un robot con uno strumento sterile a 96 perni, ciascuno con diametro di un millimetro, trasferendo 384 dei 1.536 ceppi in 4 piastre colturali da 96 pozzetti contenenti 200 microlitri di mezzo selettivo; le colture vengono fatte crescere a 20 gradi Celsius fino alla saturazione. Per effettuare il prelievo delle colture di lievito sature, iniziare trasferendole su un robot per la manipolazione di liquidi e Resus, sospendendole su uno shaker magnetico; diluire le colture a circa uno a 70 utilizzando uno strumento robotico sterile a 96 perni per trasferirle in 200 microlitri di acqua sterile.

Dopo aver pulito e sterilizzato lo strumento a spilli, depositare le colture diluite su piastre di agar. Nel formato a 384 pozzetti, trasferire le piastre in un incubatore umidificato a temperatura controllata dotato di carosello automatico e sportello di accesso. Per acquisire le immagini delle colture, utilizzare un imaginer automatico robotizzato, che rimuove ripetutamente le piastre dall'incubatore, ne toglie i coperchi, le trasferisce in uno spazio uniformemente illuminato al di sotto di una fotocamera da 35 millimetri e acquisisce un'immagine a 5.184 per 3.456.

La risoluzione dei pixel sostituisce il coperchio, quindi rimette le piastre sul carosello dell'incubatrice per tracciare le posizioni delle colture sulle piastre e i trattamenti applicati. Le piastre vengono codificate automaticamente con un codice a barre in base al nome dell'incubatrice, alla temperatura, al numero di serie univoco del lotto e alla posizione all'interno dell'incubatrice. I nomi delle immagini sono una concatenazione del nome della piastra e del timestamp, e vengono generati automaticamente al momento dell'acquisizione dell'immagine.

Le piastre vengono spesso etichettate manualmente anche per garantire che mantengano lo stesso ordine durante il trasferimento tra i caroselli robotizzati. I file di metadati sono file di testo separati da tabulazioni, generati manualmente. Il file descrittivo dell'esperimento FT due.

La tabella uno è unica per ogni esperimento, ma la descrizione della libreria FT tre, tabella uno può essere riutilizzata ampiamente. Una volta costruito, l'esperimento viene descritto nel file di descrizione sperimentale FT due, tabella uno, contenente colonne per il codice a barre o il nome automaticamente generato della piastra, il timestamp di inizio dell'esperimento, il trattamento della piastra, il contenuto del mezzo solido agarizzato, il nome dello schermo, il numero della piastra della libreria (per librerie con più piastre) e un numero di quadrante di ripetizione per la riduzione dal formato 1.536 pozzetti al formato 384 pozzetti. La libreria di ceppi e viene descritta con un file di descrizione della libreria FT tre, tabella uno che indica il genotipo coltivato in ciascuna posizione di coltura.

In ogni piastra di una libreria sono presenti le colonne quattro, nome della libreria, ORF, numero della piastra, riga e colonna della piastra, e una colonna opzionale per note. Può essere fornito un file opzionale con i nomi standard dei geni FT quattro, tabella uno, che descrive il nome standard del gene associato a ciascun numero sistemico di ORFY, identificando i ceppi sottoposti a screening. Questo file contiene due colonne, ORF e nome del gene, per l'analisi dei dati.

Il flusso di lavoro computazionale QFA richiede l'accesso a un'unità centrale multi-core ragionevolmente potente su cui sia installato lo strumento software di analisi delle immagini colonizer e il pacchetto QFAR, entrambi disponibili gratuitamente e documentati online, che funzionano su diverse piattaforme operative. Eseguire colonizer utilizzando ciascuna delle immagini delle piastre acquisite come input, generando un file di output di colonizer FT5, tabella uno, per ogni immagine acquisita; i file di output di colonizer specificano le stime della densità delle colture, l'area, la forma e il colore delle colture.

Per ciascuna delle 384 posizioni sulla piastra dell'immagine, un nome di file di output viene automaticamente copiato dal nome del file immagine sorgente. Il pacchetto QFAR contiene funzioni seldens per i corsi temporali di ciascuna coltura, al fine di adattare modelli logistici generalizzati alle osservazioni e per creare grafici. Si vedano le figure due e tre per degli esempi.

I valori dei parametri stimati vengono scritti nei file dei parametri logistici QFA. Il pacchetto QFAR contiene inoltre funzioni per il controllo di qualità. Le colonie periferiche vengono scartate a causa della maggiore disponibilità di nutrienti ai bordi della piastra e delle difficoltà nell'analisi delle immagini.

Vicino alle pareti della piastra e alle colture che non hanno superato l'SGA e i genotipi che mostrano associazione con i geni marcatore specifici dello schermo vengono esclusi dall'analisi. Diversi parametri quantitativi della fitness sono derivati dai parametri del modello logistico della popolazione per ciascuna coltura. Questi includono i tassi massimi di raddoppiamento della popolazione e il numero di divisioni dal momento dell'inoculo fino alla saturazione, per ciascun insieme di colture replicate e per ogni definizione di fitness.

Vengono calcolate diverse statistiche riassuntive delle stime di fitness: media e mediana del fitness, deviazione standard del fitness e numero di repliche osservate. Le statistiche riassuntive vengono esportate nei file di sintesi del fitness QFA FT otto, tabella uno, per ulteriori analisi. Ad esempio, calcoli dei punteggi di interazione genetica FT nove, tabella uno.

Questa figura mostra una curva di crescita tipica su scala logaritmica ottenuta mediante QFA 384. Le colture crescono a 20 gradi Celsius su agar solido, come quantificato da colonizer, con un aumento della densità cellulare prima rilevabile dopo circa due giorni. Questo ritardo è probabilmente dovuto all'effetto combinato di una fase di latenza della coltura dopo l'inoculazione su mezzo solido e di un limite inferiore di rilevamento della densità cellulare.

Qui, 308 curve di crescita simili sono state ottenute da una singola piastra. Si noti che i ceppi che hanno prodotto una linea piatta erano molto deboli o morti. Questa figura illustra il confronto tra due schermate QFA su scala genomica per inferire l'intensità delle interazioni genetiche.

Il pacchetto QFAR include anche funzioni per produrre la figura della curva di crescita precedente e per generare liste ordinate di genotipi esaminati e stime dell'intensità dell'interazione genetica. Insieme a un valore Q per la significatività della GIS osservata, una volta acquisita padronanza, un esperimento QF.A a quattro repliche su scala genomica completa può essere portato a termine entro tre settimane. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di essere organizzati nel tracciamento e nella denominazione di tutte le piastre e delle immagini.

Tutte le piastre devono essere inoculate e i punti devono essere posizionati nell'orientamento e nell'ordine corretti. L'analisi dei dati si basa sulla correttezza dei file di testo ausiliari creati dallo sperimentatore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stimare la fitness di migliaia di colture microbiche indipendenti.

Le fitness vengono stimate riprendendo ripetutamente colture macchiate, cresciute su piastre solide di agar, convertendo le immagini acquisite in stime della densità cellulare e generando curve di crescita. La modellizzazione matematica delle curve di crescita fornisce stime quantitative della fitness, che possono quindi essere utilizzate per dedurre relazioni funzionali tra prodotti genici su scala genomica.