Un approccio semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm mediante lo sviluppo spiegazzato Colony

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e misurare i cambiamenti nella formazione del biofilm valutando lo sviluppo della formazione di colonie rugose nel tempo. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando i ceppi batterici di interesse in coltura liquida. Il secondo passaggio consiste nell'innestare le colture su agar nutriente.

Successivamente, le colonie vengono monitorate nel tempo per identificare il momento in cui iniziano a sviluppare strutture tridimensionali indicative dell'avvio della formazione di colonie rugose. Lo sviluppo della morfologia coloniale viene seguito fino a quando non si osservano ulteriori cambiamenti. Infine, il microscopio delle colonie viene utilizzato per evidenziare le differenze nello sviluppo del biofilm nel tempo da parte di ceppi specifici o in condizioni specifiche, in modo semi-quantitativo.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nella possibilità di effettuare un'analisi semi-quantitativa della formazione di biofilm batterici attraverso lo sviluppo di una morfologia coloniale rugosa. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla formazione di biofilm in Vireo fishery, può essere applicato anche alla caratterizzazione di fenotipi di biofilm in altri sistemi batterici come basc, slus, pseudomonas osa e vial cholera. L'idea iniziale di questo metodo è nata quando abbiamo identificato dei mutanti batterici che mostravano un ritardo nello sviluppo della formazione di colonie rugose.

La formazione del biofilm è generalmente influenzata dalla densità cellulare e dalla velocità di crescita. Pertanto, prima di valutare la morfologia delle colonie rugose, è necessario determinare la velocità di crescita e il rendimento delle ceppi di interesse. Misurare l'aumento della densità ottica o OD di ciascun ceppo nel tempo e tracciare una curva di crescita per determinare il rendimento o il numero finale di cellule.

È possibile utilizzare un saggio di semina cellulare. I ceppi batterici di interesse vengono coltivati in coltura liquida, quindi vengono effettuate diluizioni delle colture che vengono seminate su piastre di agar. Dopo l'incubazione, il numero di cellule vitali viene calcolato e rappresentato graficamente come mostrato qui.

È inoltre importante identificare le migliori condizioni di inoculo che evidenziano le differenze più marcate tra il ceppo di controllo e il mutante di interesse. A tale scopo, prima di effettuare l'inoculo, coltivare i ceppi in brodo liquido in diverse condizioni, come diversi terreni o temperature, e in diversi stadi di crescita, come la fase esponenziale o la fase stazionaria; quindi prelevare 10 microlitri di coltura a diverse densità cellulari e inoculare sul terreno opportuno, incubando alla temperatura desiderata finché non diventano evidenti le morfologie delle colonie. In questo modo, è possibile determinare la densità ottica iniziale ottimale per un determinato insieme di ceppi o condizioni, da cui partire per questa procedura.

Inoculare le cellule oculari di pesce Fisher da piastre in agar in cinque millilitri di terreno LB salato o terreno LBS contenente gli antibiotici necessari, incubare con agitazione a 28 gradi Celsius durante la notte; nella mattina successiva, effettuare un'innesto secondario delle cellule con un'abbondanza di 1 a 100 in cinque millilitri di terreno LBS fresco, incubare nelle stesse condizioni fino a quando le cellule hanno raggiunto il valore di densità ottica desiderato a 600 nanometri. Per Vibrio fii, i migliori risultati si ottengono quando le colonie sono generate da colture con una densità ottica di circa 0,2. Successivamente, prelevare con una pipetta un millilitro di ciascuna coltura in una provetta microcentrifuga e centrifugare alla velocità massima.

Per un minuto, rimuovere il soprannatante mediante aspirazione e risospendere il pellet in un millilitro di acqua marina artificiale sterile al 70% o in un’A SW centrifugata. Questo passaggio di lavaggio, nuovamente, rimuoverà i residui di mezzo e i componenti extracellulari. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet lavato in un millilitro di A SW al 70% per assicurare che ogni campione contenga il numero di cellule stimato tramite la DO a 600 nanometri.

Effettuare eventuali aggiustamenti diluendo i campioni più concentrati con ulteriore A SW al 70%. Depositare 10 microlitri di ciascuna coltura su piastre LBS contenenti gli antibiotici necessari. Assicurarsi di tenere la pipetta con il dito appena sopra la superficie dell'agar e di depositare il campione verticalmente, non in modo inclinato. Espellere lentamente il liquido per una distribuzione uniforme del spot, includendo i controlli positivi e negativi appropriati sulla stessa piastra.

Quando si valuta la formazione di colonie rugose come piastre minori, la variazione AFL può influenzare lo sviluppo del biofilm. L'aspetto più difficile di questa procedura è l'identificazione dell'inizio della formazione delle colonie rugose. A volte diventa evidente solo dopo che lo sviluppo è già iniziato.

Per osservare l'inizio dello sviluppo delle colonie con rugosità, effettuiamo rilevamenti orari entro un intervallo di tempo specifico. Ciò ci permette inoltre di tornare indietro ed effettuare confronti dopo l'avvio dello sviluppo. Per garantire che la coltura inoculata rimanga uniformemente distribuita, lasciare asciugare la goccia prima di spostare la piastra nell'incubatore, capovolgere le piastre e incubarle a 28 gradi Celsius.

Un modo per valutare la morfologia delle colture spot è mediante un saggio a punto finale, che prevede la valutazione della formazione di colonie rugose in un punto temporale predeterminato dopo lo spotting. Questo è un risultato rappresentativo di un saggio a punto finale in cui è stata valutata la formazione di colonie rugose. 40 ore dopo lo spotting, a sinistra è mostrata una ceppo non formante biofilm di Vibrio FII e a destra un ceppo formante biofilm.

Il saggio endpoint è utile per ceppi che mostrano o si ritiene mostrino gravi difetti nella formazione del biofilm. Un altro saggio per valutare la morfologia delle colonie è un saggio cinetico in cui la formazione di colonie rugose viene monitorata nel tempo dopo il posizionamento del campione, per tenere facilmente traccia del tempo trascorso dal posizionamento. Impostare un timer per il conteggio crescente.

In questa dimostrazione, l'aspetto morfologico della colonia in crescita verrà monitorato ogni ora, a partire da 12 a 15 ore dopo il prelievo, utilizzando una lente di dissezione dotata di telecamera e di software per l'acquisizione e l'analisi delle immagini. I programmi software vengono impiegati per osservare e documentare la morfologia delle colonie e per valutare l'inizio e il progressivo sviluppo della formazione di colonie rugose. Prima di acquisire le immagini delle colture inoculate, il coperchio della piastra di Petri viene solitamente rimosso per ottenere un'immagine più nitida.

Qui, le colonie vengono illuminate dal basso attraverso un piano di vetro trasparente con una sorgente di luce fredda, mentre le immagini sono acquisite dall'alto. Questa configurazione è ottimale per l'acquisizione dell'evoluzione delle colonie rugose poiché le colonie di Vibrio fisheri sono traslucide. Per visualizzare al meglio lo sviluppo delle colonie rugose, regolare sia l'intensità luminosa sia l'angolo di riflessione al di sotto delle colonie batteriche in modo che sia possibile distinguere la morfologia tridimensionale dei biofilm in via di sviluppo.

Determinare le condizioni ottimali di illuminazione che offrono il contrasto più forte tra la colonia spot e lo sfondo di agar circostante. È importante utilizzare sempre lo stesso ingrandimento durante l'acquisizione delle immagini nel corso dell'esperimento, utilizzando la leva situata sul retro della fotocamera; passare dalla visione attraverso l'oculare del microscopio a quella sullo schermo del computer, regolare l'inquadratura, mettere a fuoco opportunamente e quindi acquisire l'immagine; catturare immagini adeguate per documentare l'inizio e lo sviluppo della formazione di colonie rugose. La fine dell'esperimento avviene quando non si verifica più alcuno sviluppo del biofilm.

Al termine degli esperimenti effettuati, le immagini vengono consolidate in figure al fine di visualizzare l'evoluzione del modello nel tempo per ciascun ceppo o condizione. Si osservi quanto tempo intercorre tra il momento dell'inoculo e il momento in cui inizia la formazione delle colonie rugose; l'inizio della formazione delle colonie rugose è definito come il punto temporale in cui diventa visibile per la prima volta la formazione di strutture tridimensionali e di modelli. In questo esempio, l'inizio della formazione del biofilm è evidente a 12 ore per un ceppo di controllo competente per la formazione del biofilm di Vibrio FII, mostrato nel pannello superiore.

Nel pannello inferiore, un'immagine rappresentativa di un ceppo mutante di Vibrio FII che mostra un ritardo di quattro ore nell'inizio della formazione di colonie rugose nel tempo, con l'inizio della formazione del biofilm a 16 ore dall'inoculo. Si noti che, sebbene siano osservate differenze sottili tra questi ceppi nei punti temporali precedenti a 40 ore, i ceppi appaiono simili nell'intensità e nel modello di formazione del biofilm in ciascun punto temporale successivo all'inizio della formazione delle colonie rugose. Va annotato il modello di sviluppo delle colonie rugose.

L'architettura può svilupparsi dall'esterno verso l'interno, come illustrato nel pannello A, oppure dall'interno verso l'esterno, come illustrato nel pannello B. Questa valutazione fornisce un meccanismo per distinguere i biofilm formati da ceppi diversi o in condizioni diverse. Una seconda misura semi-quantitativa della formazione del biofilm sfrutta la variazione del diametro della colonia nel tempo. Come mostrato nel pannello superiore, un ceppo rappresentativo di competenza nel formare biofilm genera colonie che aumentano in complessità e diametro.

Al contrario, un altro ceppo mostrato nel pannello inferiore non forma biofilm. Infine, questa figura mostra una rappresentazione grafica dell'aumento del diametro della colonia nel tempo. Per i due stessi ceppi, il ceppo competente per la formazione di biofilm è rappresentato da cerchi bianchi.

Mentre il ceppo che non forma biofilm è rappresentato da quadrati neri. Questa analisi ha rivelato che la dimensione delle colonie competenti per la formazione di biofilm aumenta a un ritmo maggiore rispetto alle colonie negative per il biofilm, e al tempo finale, le due differivano di quasi due volte. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di posizionare con attenzione ciascun ceppo e di documentare la formazione iniziale della colonia rugosa per ciascun ceppo.

Seguendo questo protocollo, altri metodi come un saggio iCal o una colorazione su ampio raggio di cristalli possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sui processi coinvolti e sulla formazione del biofilm.