Modello murino di MCAO intraluminale: valutazione infarto cerebrale da colorazione viola cresile

L'obiettivo generale di questa procedura è riprodurre un ictus ischemico nei topi. Innanzitutto, l'arteria carotide comune viene legata in modo temporaneo, mentre l'arteria carotide esterna viene legata in modo permanente nel punto più distale possibile. Un altro punto di sutura temporaneo, leggermente stretto, viene posizionato sull'arteria carotide esterna al di sopra della biforcazione.

Il secondo passaggio consiste nel clampare l'arteria carotide interna utilizzando pinzette a azione inversa per evitare emorragie. Successivamente, si taglia l'ECA tra la legatura permanente e quella temporanea. Quindi, si introduce il monofilamento rivestito di silicone nell'ECA.

Successivamente, l'ECA viene invertita per introdurre il monofilamento nell'ICA fino a includere la base dell'arteria cerebrale media. Un'ora dopo, il flusso ematico viene ripristinato rimuovendo il monofilamento, simulando così il ripristino del flusso ematico dopo la lisi di un coagulo tromboembolico nell'uomo. Infine, il deficit neurologico, che riflette il successo della T-M-C-A-O e la gravità dell'infarto, può essere valutato subito dopo la riperfusione e in diversi momenti successivi alla riperfusione.

Il software Cyan dell'NIH viene utilizzato per calcolare il volume dell'infarto su sezioni cerebrali rappresentative colorate con violetto cristallo. Uno dei principali vantaggi dell'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media mediante tecnica del filamento intraluminale è che riproduce l'ictus ischemico nel paziente con il ripristino del flusso ematico, e lo sviluppo di questa procedura nei topi offre la possibilità di utilizzare strumenti genetici marcatori per identificare il ruolo di una proteina bersaglio. Nell'ictus, l'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media viene eseguita su topi maschi C57BL/6 di età compresa tra due e tre mesi, del peso compreso tra 22 e 28 grammi.

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato di Bioetica e Cura dell'IRCM per aumentare la riproducibilità del volume dell'infarto. Utilizziamo un monofilamento riutilizzabile lungo 12 millimetri, con rivestimento al silicio da sei oh, della Doco Corporation. Due ore prima dell'intervento chirurgico.

Somministrare una dose di 0,03 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina a un topo per via intraperitoneale. Per iniziare la procedura, anestetizzare i topi con il 5% di isoflurano e mantenere l'anestesia al 2,5% di isoflurano; utilizzare un tappetino riscaldante per mantenere costante la temperatura corporea del topo durante l'intervento chirurgico. Disinfettare la cute del collo del topo con etanolo al 70% o Betadine. Successivamente, praticare un'incisione mediana nel collo ed allargare i tessuti molli al microscopio stereoscopico.

Dissezionare in modo netto il collo del mouse per esporre la trachea. Successivamente, ritrarre i muscoli per individuare l'arteria carotidea. Dissezionare con attenzione l'arteria carotide comune sinistra dal tessuto circostante.

Posizionare una sutura temporanea in seta da cinque ohm, tagliata in segmenti da 20 millimetri, attorno all'arteria. Prestare attenzione a non danneggiare il nervo vago. Successivamente, separare la biforcazione dell'arteria carotide comune interna sinistra o ICA e dell'arteria carotide comune esterna o ECA, quindi posizionare una sutura permanente attorno all'ECA il più distalmente possibile.

E un altro punto di sutura temporaneo sull'ECA al di sopra della biforcazione. Quindi clampare la CIA sinistra utilizzando pinzette a azione inversa per evitare emorragie. Ancora una volta, prestare molta attenzione a non danneggiare il nervo vago.

Praticare un piccolo foro nell'arteria carotide esterna (ECA) prima della biforcazione tra ECA e arteria carotide interna (ICA) e tra i punti di sutura permanenti e temporanei posizionati in precedenza. Successivamente, introdurre un filo di sutura monofilamento da 12 millimetri, in silicone rivestito sei-oh, nell'ECA, recidere completamente l'ECA e ripiegare il monofilamento all'interno dell'ICA. Legare saldamente la sutura per prevenire emorragie e rimuovere le pinzette ad azione inversa.

Quindi introdurre il monofilamento nel circolo di Willis fino a quando il monofilamento ostruisce la base dell'arteria cerebrale media. L'inserzione avviene di circa nove-dieci millimetri oltre la biforcazione dell'arteria carotide esterna e dell'arteria carotide comune. Generalmente, il monofilamento verrà bloccato e non potrà più muoversi.

Attenzione a non penetrare l'arteria tegumentale palatina. Fissare saldamente il punto sulla ECA al fine di mantenere il filamento in posizione. Chiudere ora la cute utilizzando un sistema automatico di chiusura delle ferite con clip.

Iniettare un millilitro di soluzione salina per via sottocutanea e posizionare i topi sotto una lampada riscaldante a infrarossi durante il periodo post-occlusivo, che dura 60 minuti. Anestetizzare i topi come in precedenza e rimuovere le clip automatiche, aprendo leggermente il punto di legatura sulla ECA per consentire il ritiro del monofilamento e la riperfusione del sangue. Quindi legare in modo permanente il punto di legatura temporaneo sull’ECA per prevenire la perdita di sangue.

Un'ora dopo l'ictus, rimuovere il monofilamento e conservarlo per un successivo utilizzo. Successivamente, rimuovere la sutura temporanea sulla carotide comune per consentire la ricircolazione del sangue. Chiudere la ferita e praticare la sutura sottocutanea.

Iniettare un altro millilitro di soluzione salina nei topi. Dopo aver verificato che l'animale riprenda la mobilità, riposizionarlo nella gabbia e posizionare metà della gabbia sul tappetino riscaldante per consentire ai topi di scegliere il proprio ambiente. Dodici ore dopo l'intervento chirurgico, ai topi sottoposti a intervento fittizio viene somministrata un’ulteriore dose di buprenorfina.

Tutte le procedure sono identiche tranne per il fatto che il monofilamento non viene inserito dopo l'intervento chirurgico. Il deficit neurologico viene valutato per confermare il successo della T-M-C-A-O e determinarne il punteggio di efficienza, valutando i deficit neurologici dei topi a 1, 24, 48 e 72 ore dopo la perfusione, su una scala a sei punti come segue: zero equivale a normale, uno equivale a lieve, rotazione con o senza arrotolamento inconsistente quando sollevati per la coda. Più del 50% dei tentativi di arrotolarsi verso il lato controlaterale.

Due indica un'arricciamento lieve ma costante in più del 50% dei tentativi di arricciamento verso il lato controlaterale. Tre indica un arricciamento costante, forte e immediato. Il topo mantiene una posizione arrotolata per più di uno o due secondi.

Con il naso che quasi tocca la coda. Quattro indica un arrotolamento grave. Il progredire verso la perdita del baricentro, del riflesso della deambulazione o della scrittura; cinque indica stato comatoso o accasciamento.

Dopo la perfusione con soluzione PBS, congelare rapidamente i cervelli in isopentano e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Si noti che i cervelli di topo possono anche essere perfusi con paraformaldeide al 4%, a seconda degli studi di immunohistochemica previsti. Successivamente, utilizzare un criostato per tagliare sezioni cerebrali coronali di 17 micron utilizzando 30 vetrini.

Posizionare una sezione ogni 30 sullo stesso vetrino. Quindi colorare il primo e il quindicesimo vetrino con violetto di cresta. Per una stima più accurata del volume della lesione, utilizzare un sistema di analisi delle immagini come Scion Image del NIH per valutare il delimitatore della lesione, l'area infartuale che appare bianca negli emisferi cerebrali sinistro e destro.

Ripetere questa limitazione D su tutte le sezioni cerebrali. Calcolare il volume dell'infarto in unità arbitrarie ed esprimerlo come percentuale dell'area controlaterale non lesa per ogni sezione. Mantenere gli altri vetrini a meno 80 gradi Celsius per studi di immunohistochimica.

La valutazione del punteggio neurologico conferma il successo della T-M-C-A-O nei miei soggetti sottoposti alla procedura intraluminale. Come osservato qui, si verifica un arrotolamento consistente, forte e intermedio, e il topo mantiene una posizione arrotolata per più di uno o due secondi con il naso che quasi raggiunge la coda. Nel nostro esperimento, tutti i topi hanno mostrato almeno un arrotolamento lieve ma consistente, che corrisponde a un punteggio neurologico di due per tutto il periodo del test.

La colorazione con violetto di Kressel è stata eseguita per valutare l'estensione dell'infarto cerebrale. Successivamente alla T-M-C-A-O, mostrata qui, una sezione coronale rappresentativa del cervello di topo è stata colorata con violetto di Kressel dopo 72 ore dal ripristino della perfusione. L'area infartuata, principalmente il corpo striato e la corteccia e le aree cerebrali adiacenti, indicata, appare in bianco poiché non è stata colorata dal violetto di Kressel.

Il viola mostrato qui rappresenta il volume della lesione, ovvero la parte bianca dell'emisfero destro espressa come percentuale dell'area controlaterale non lesa nell'emisfero sinistro. Il volume dell'infarto nei topi maschi C57BL/6 dopo un ictus ischemico rappresenta circa il 70% dell'emisfero non leso. Questa procedura garantisce una riproducibilità elevata della lesione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un ictus ischemico transitorio nei topi. Inoltre, l'approccio del quiz viol per misurare il volume dell'infarto cerebrale ti offre il grande vantaggio di disporre di molti campioni su cui testare marcatori rilevanti mediante immunoistochimica. Grazie per aver guardato il video e buona fortuna con il tuo esperimento.