Name: Modello murino di MCAO intraluminale: valutazione infarto cerebrale da colorazione viola cresile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Impara il modello murino di MCAO intraluminale per studiare l'ictus ischemico nei topi. Questo metodo utilizza la colorazione viola cresile per valutare il volume dell'infarto cerebrale con elevata riproducibilità.

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Questo studio è stato sostenuto da una borsa di TEAM CIHR # 82946 CTP, una sovvenzione CIHR # 102741 MOP, così come una sedia Canada # 216684 e una Fondazione Strauss. ER è stato sostenuto da una borsa di studio dal Cuore canadese &amp; Stroke Foundation.

Transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) 1. Chirurgia Procedura (Figura 1) Transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (tMCAO) viene eseguito il 2 - a 3 mesi maschio topi C57BL / 6 (22-28g). Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali IRCM comitato di bioetica. Strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave (121 ° C a 15 psi per 60 min). Tra ogni animale, sono stati sterilizzati con il caldo tallone sterilizzatrice (15 sec). Tavolo Chirurgia e altre attrezzature sono disinfettati con etanolo al 70%. Due ore prima dell&#39;intervento chirurgico, i topi sono stati analgesized con buprenorfina (0,03 mg / kg BWIP). Figura 1A. <ol><li> Profondamente anestetizzare topi con isoflurano 5% e poi mantenere l&#39;anestesia al 2,5% isoflurano. Temperatura corporea dei topi è mantenuta costante durante l&#39;intervento con un cuscinetto riscaldante. </li><li> Disinfettare la pelliccia e skcon il 70% in etanolo o Betadine. Dal momento che la rasatura produce frammento rilascio capelli, microabrasioni e infiammazione che possono avere un impatto sulla fisiopatologia corsa, non di rado pelliccia del mouse. </li><li> Effettuare una incisione mediana del collo e delicatamente separare i tessuti molli. </li><li> Sotto un microscopio stereo (Stemi 2000, Zeiss), una dissezione smussa viene eseguita per esporre la trachea e ritrarre i muscoli per individuare la carotide. </li><li> La sinistra arteria carotide comune (CCA) è attentamente sezionato dal tessuto circostante e il CCA è temporaneamente occluso da una sutura temporanea (1) con sutura di seta 5-0 tagliato in 20 segmenti mm. Grande attenzione deve essere esercitata non danneggiare il nervo vagale. </li><li> Separare la biforcazione della sinistra interna carotide comune (ICA) ed esterni carotide comune (ECA). Una sutura permanente (2) è posizionato intorno alla ECA, più distalmente possibile, e un&#39;altra sutura leggermente stretto temporanea (3) è posto sulla ECA distale albiforcazione. </li><li> Agganciare la sinistra ICA (4) utilizzando un reverse-azione pinzette per evitare emorragie. Grande attenzione deve essere esercitata non danneggiare il nervo vagale. </li><li> Tagliare un piccolo foro in ECA (5) tra permanenti (2) e temporanei (3) punti di sutura. </li></ol> Figura 1B. <ol start="9"><li> Introdurre un 12 mm di lunghezza 6-0 siliconato (circa 9-10mm è siliconata) sutura monofilamento (Doccol Corporation) nel ECA (6), completamente tagliato l&#39;ECA distale alla sutura permanente e invertire il occlusore nella ICA . La sutura è strettamente legato intorno al monofilo per prevenire le emorragie e le reverse-azione pinzette vengono rimossi. </li><li> L&#39;occlusione è introdotto per occludere l&#39;origine del MCA nel cerchio di Willis. Interrompere l&#39;inserimento circa il 9-10 mm oltre la biforcazione di ECA e CCA. L&#39;occlusione è bloccato e non può più muoversi. La cura deve essere esercitata non a penetrare l&#39;arteria pterigopalatino. La sutura (3) sul ECA è tightly legato per fissare il monofilo in posizione. </li><li> Chiudere la pelle con un sistema di chiusura AutoClip ferita. </li><li> Iniettare 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea e posizionare topi sotto una lampada di riscaldamento a infrarossi durante tutto il periodo post-occlusione (60 min). </li></ol> 2. Restauro del Medio flusso ematico cerebrale Arteria Prima reanesthesia, il neuroscore può essere controllato per valutare il successo della chirurgia. <ol><li> Anestetizzare i topi come precedentemente descritto e rimuovere le autoclips. </li><li> Aprire leggermente la sutura (3) sulla Corte dei conti per riunire la revoca monofilamento e riperfusione sangue. </li><li> Permanente legare la sutura temporanea della Corte dei conti per evitare la perdita di sangue. Il monofilo è tenuto per il riutilizzo. </li><li> Rimuovere la sutura temporaneo (1) sul CCA per consentire ricircolo di sangue. </li><li> Chiudere la ferita. I topi dovrebbero ricevere un altro 1 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea. </li><li> Posizionare i topi sotto la lampada di riscaldamento a raggi infrarossi per 1 ora. Dopo aver verificato che l&#39;animale riprenda mobilità, il mouse viene restituito alla sua gabbia e lasciato sotto il termoforo e asciugamani per 72 ore. Si noti che solo la metà della gabbia è collocata sul cuscinetto di riscaldamento per permettere topi di scegliere il loro ambiente. Poiché post-chirurgica perdita di peso è generalmente osservata, cibo purè è posto in una capsula di Petri per incoraggiare mangiare. Dodici ore dopo la chirurgia, i topi hanno ricevuto un&#39;altra dose di buprenorfina (0,03 mg / kg BWIP). </li></ol> 3. Sham Funzionamento Per le operazioni fittizie, tutte le procedure sono identiche tranne che l&#39;occlusione non è inserita. 4. Neuroscore Deficit neurologici consentire la valutazione del successo di tMCAO appena dopo riperfusione e successivamente la stima del grado di gravità della lesione. Deficit neurologici sono segnati come descritto in precedenza 5 &lt;/ Sup&gt; ed eseguito a 1, 24, 48 e 72 ore post-riperfusione. Un espanso scala di sei punti viene utilizzato: <ul><li> 0: normale. </li><li> 1: lieve cerchio comportamento con o senza rotazione incoerente se preso per la coda, i tentativi &lt;50% per ruotare verso il lato controlaterale. </li><li> 2: lieve coerente cerchio,&gt; tentativi 50% per ruotare verso il lato controlaterale. </li><li> 3: in linea forte e immediato girando, il mouse ha una posizione di rotazione per più di 1-2 secondi, con il suo naso quasi a raggiungere la coda. </li><li> 4: rotazione grave procedendo in burattatura, la perdita di camminare o di riflesso di raddrizzamento. </li><li> 5: in coma o moribondi. </li></ul> 5. Violet colorazione cresolo (Figura 2) Seguendo soluzione perfusione PBS, cervelli vengono rapidamente congelati in isopentano a -80 °C. cervello del mouse può essere anche perfusi con 4% paraformaldeide (PFA) in base agli studi di immunoistochimica previsti. Criostato-tagli di sezioni cerebrali coronali (17 micron) vengono eseguite. Una sezione su ogni 30 viene raccolta nello stesso vetrino di avere una lesione cerebrale rappresentativo. Per la quantificazione del volume, 2 alla colorazione mediante colorazione violetto cresolo ed un sistema di analisi di immagine (Scion Corporation, Frederick, MD) è stato utilizzato per valutare la lesione. Il volume pregiudizio è stato calcolato in unità arbitrarie (pixel), ed espressa come percentuale del controlaterale non lesionato area per ciascuna sezione. Altre diapositive sono mantenuti a -80 ° C per studi di immunoistochimica. In alternativa, PFA-fisso cervello può essere tagliato a 30-50 micron utilizzando vibratomo e il volume dell&#39;infarto misurata come raccomandato da Han et al. (2009) 6.

<ol><li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%2C+I%3A+a+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn. J. Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare. Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Zeiss, Inc.

Diversi modelli ictus sono stati sviluppati per imitare conseguenze ictus nei pazienti. La scelta del modello dipende dalla corsa questione biologica. Il modello intraluminale MCAO imita uno dei tipi più comuni di ictus ischemico nei pazienti ed è meno invasivo e più coerente rispetto al modello Tamura 4,7. Si tratta di un modello molto interessante per le analisi di morte neuroprotezione, neurorepair e cellula. Il successo del modello intraluminale dipende da molti fattori quali il sesso animale, età e peso, la temperatura, l&#39;anestesia e l&#39;intervento chirurgico, che devono essere controllati. Le proprietà fisiche del occlusore (diametro della punta, lunghezza, forma e fessibilità) sono critici per la consistenza del MCAO 4. Qui, usiamo i 12 mm di lunghezza 6-0 monofilamento ricoperti in silicone il 9-10 mm dalla Corporation Doccol. Il grande vantaggio di questo monofilo è quello di ridurre le emorragie subaracnoidea e per la sua lunghezza coperto tutta l&#39;ACIlunghezza, il flusso di sangue residuo, che proviene dalle arterie comunicanti anteriore e posteriore del Circolo di Willis e PPA, sia precluso e il variabilità diminuisce volume di infarto (15% della variabilità nelle nostre mani) 8. La sutura di CCA diminuisce anche la variabilità del volume dell&#39;infarto 9. L&#39;entità del seguente tMCAO lesioni cerebrali può essere valutata per vie diverse. Deficit neurologici può essere misurata come accennato in precedenza. Tuttavia, è difficile avere una misura efficace in questo modo. L&#39;entità dell&#39;infarto è comunemente eseguita mediante colorazione TTC. Più recentemente, tecniche di risonanza magnetica sono utilizzati anche, una tecnologia particolarmente interessante per trattamenti neuroprotettivi. Per comprendere i meccanismi cellulari coinvolti nella corsa come neurorepair morte cellulare o proliferazione cellulare, lo studio dei diversi marcatori di immunoistochimica è critica e molto informativo. Così, il nostro protocolo di preparati sezione del cervello ha il grande vantaggio di consentire queste analisi, e riduce al minimo il numero di topi utilizzati. Inoltre, Tureyen et al. 10 hanno riportato che esiste una buona correlazione tra colorazione violetto cresolo e TTC.

<table border="1"&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Descrizione</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Stereomicroscopio</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt; Stemi 2000</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fibra-illuminatore a luce ad alta intensità</td&gt;<td&gt; Dolan-Jenner Industries Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema di Anestesia per isoflurano</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurano</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 108737</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Riscaldamento coperta</td&gt;<td&gt; Gaymar Medsearch</td&gt;<td&gt; TP22G</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lampada di riscaldamento a raggi infrarossi</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ultra fine pinzette, stile 5</td&gt;<td&gt; Scienze della microscopia elettronica</td&gt;<td&gt; 78320-5TI</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Forbici Vannas Cutting Edge 3 mm, dritto</td&gt;<td&gt; Scienze della microscopia elettronica</td&gt;<td&gt; 72932-01</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Stile LA-1 e MPF-1 Tutte le lame lisce</td&gt;<td&gt; Scienze della microscopia elettronica</td&gt;<td&gt; 77926-5S</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzette ad azione negativa, stile KOPINC 5</td&gt;<td&gt; Scienze della microscopia elettronica</td&gt;<td&gt; 72850-F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dissezione forbici 5 1/2 &quot;Straight</td&gt;<td&gt; Cedarlane</td&gt;<td&gt; 72960</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; AutoClip STARTER SET</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt; 34-0557</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BD AutoClip Wound Syst chiusura., 9mm lungo, 100/conf</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 01-804-5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5-0 sutura</td&gt;<td&gt; Harvard Apparatus</td&gt;<td&gt; 517763</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Materiale di sutura PDS II monofilamento viola, 5-0, RB-1; Z303H</td&gt;<td&gt; CDMV</td&gt;<td&gt; 6167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12 mm di lunghezza 6-0 siliconato sutura monofilamento</td&gt;<td&gt; Doccol Corporation</td&gt;<td&gt; 60SPRePK5</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Seringes 1ml</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 14-823-2F</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Aghi 26G1 / 2</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; BD-305111</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td<em&gt; C57BL / 6</emHome&gt; mouse</td&gt;<td&gt; IRCM</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</table

modello murino di mcao intraluminale: valutazione infarto cerebrale da colorazione viola cresile

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

L&#39;ictus è la terza causa di mortalità e la principale causa di disabilità nel mondo. Ischemici conti del tratto per circa l&#39;80% di tutti gli ictus. Tuttavia, il tessuto trombolitico plasminogeno (tPA) è l&#39;unico trattamento dell&#39;ictus ischemico acuto che esiste. Ciò ha indotto i ricercatori a sviluppare diversi modelli di ictus ischemico in una varietà di specie. Due principali tipi di modelli di roditori sono stati sviluppati modelli di ischemia cerebrale globale o ischemia cerebrale focale. Per simulare ictus ischemico nei pazienti, in cui circa l&#39;80% ictus trombotico o embolico si verificano nel territorio dell&#39;arteria cerebrale media (MCA), il intraluminale occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) modello è molto rilevante per gli studi ictus. Questo modello è stato sviluppato nei ratti di Koizumi et al. Nel 1986 1. Grazie alla facilità di manipolazione genetica nei topi, questi modelli sono stati sviluppati anche in questa specie 2-3. contenuto &quot;&gt; Qui, presentiamo il transitorio MCA procedura occlusione in C57/Bl6 topi. Precedenti studi hanno riportato che le proprietà fisiche del occlusore come diametro della punta, lunghezza, forma e flessibilità sono critici per la riproducibilità del volume dell&#39;infarto 4. qui, un monofilamenti commerciali al silicio rivestite (Doccol Corporation) sono stati utilizzati. Un altro grande vantaggio è che questo monofilo riduce il rischio di indurre emorragie subaracnoidea. Uso stereomicroscopio Zeiss Stemi 2000, il monofilamento di silicio rivestito è stato introdotto nella carotide interna (ICA) attraverso un taglio nella carotide esterna (ECA) finché il monofilamento occlude la base del MCA. flusso di sangue è stato ripristinato dopo 1 ora dalla rimozione del monofilamento di imitare il ripristino del flusso sanguigno dopo la lisi di un coagulo in tromboembolica umani. Il grado di infarto cerebrale possono essere valutati prima da un punteggio neurologica e dalla misura del volume dell&#39;infarto.Ischemici topi sono stati quindi analizzati per il loro punteggio neurologico a diversi post-riperfusione volte. Per valutare il volume dell&#39;infarto, colorazione con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) è stato di solito eseguita. Qui, abbiamo usato la colorazione viola cresile in quanto offre la possibilità di testare molti indicatori critici di immunoistochimica. In questo video, si segnala la procedura MCAO; punteggi neurologici e la valutazione del volume dell&#39;infarto mediante colorazione violetto cresolo.

La valutazione neuroscore conferma il successo tMCAO post-stroke e determina l&#39;efficienza del tMCAO post-riperfusione. Nelle nostre mani, tutti i topi sottoposti alla procedura intraluminale presentato almeno una lieve arricciatura consistente (neuroscore 2) ed i deficit neurologici sono generalmente stabili fino a 72 ore. La maggior parte dei topi mostrano un lieve arricciatura consistente (neuroscore 2). Topi mostrano assenza di arricciature sono esclusi dallo studio. Tuttavia, la valutazione neuroscore non ci permette di distinguere tra i topi con un ippocampo ferito e quelli con un ippocampo intatto. Nessuna mortalità è stata osservata durante il day surgery, suggerendo che emorragie subaracnoidea non si è verificato. Quando emorragia subaracnoidea è identificato in un topo, questo viene sistematicamente esclusi dall&#39;analisi. L&#39;uso di silicio rivestito monofilamento da Doccol Corporation, che è più liscia preparate in casa, monofilamenti, aumenta il successotMCAO e riduce emorragie subaracnoidea. La mortalità tra 24 ore e 72 ore è del 14% in questo modello, come generalmente riportato per 60 minuti di occlusione. La mortalità osservata è probabilmente dovuto ad un grande volume dell&#39;infarto in questo ceppo di topi. Una lesione riproducibilità forte è stata osservata anche (deviazione standard è del 15%), che è molto interessante studiare molecole neuroprotezione dove il suo effetto (s) potrebbe essere nascosti dalla variabilità del modello. Per valutare l&#39;entità del danno cerebrale dopo tMCAO, abbiamo scelto di utilizzare la colorazione cresyl violetto (Figura 2) anziché TTC per avere un sacco di materiale per testare marcatori pertinenti 6. L&#39;estensione della lesione è relativamente costante. Tuttavia, abbiamo notato che in alcuni topi, l&#39;ippocampo è stato ferito (circa il 30% dei topi). È interessante notare che la colorazione violetto cresolo può essere applicata fino a 1 settimana dopo. In letteratura, la percentuale di infarto cerebrale varia da unostudiare all&#39;altro. Essa dipende dalla scelta del ceppo di topo, l&#39;anestesia, lo spessore delle sezioni cerebrali, il monofilo utilizzata, o la colorazione utilizzata 6, 7. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4038/4038fig1highres.jpg" /> Figura 1. Schema della occlusione dell&#39;arteria cerebrale media utilizzando siliconato monofilo intraluminale. A. Schema semplificato di cervello di topo e arterie cerebrali che mostrano suture successive e clip per preparare l&#39;introduzione di silicio rivestito monofilamento. B. La posizione del monofilo attraverso il circolo di Willis è rappresentato. Il monofilamento è introdotto nella ICA via Corte a occludere alla base del MCA ACA, arteria cerebrale anteriore,. BA, arteria basilare, CCA, arteria carotide comune, C. Willis, circolo di Willis, Corte dei conti, carotide esterna artery, ICA, arteria carotide interna, MCA, l&#39;arteria cerebrale media, PCA, posteriore dell&#39;arteria comunicante, PPA, arteria pterigopalatino. <img src="/files/ftp_upload/4038/4038fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Rappresentative sezioni coronali di cervello di topo colorate con violetto cresolo, dopo 72 ore di post-riperfusione. Dell&#39;area infartuale (soprattutto striato, la corteccia e le aree cerebrali adiacenti) viene visualizzata in bianco (non colorati di violetto cresolo). Il volume lesioni (parte bianca, emisfero destro) era delimitato ed espressa come percentuale del controlaterale non lesionato area (emisfero sinistro).

Il modello intraluminale occlusione cerebrale nei topi viene qui presentato. Il grado di infarto cerebrale viene valutata da un punteggio neurologico e colorazione violetto cresolo, una colorazione alternativa alla TTC, che offre il grande vantaggio di testare in parallelo molti marcatori di interesse.

Modello murino di MCAO intraluminale: valutazione infarto cerebrale da colorazione viola cresile

L'ictus rappresenta la terza causa di mortalità e la principale causa di disabilità a livello mondiale. L'ictus ischemico costituisce circa l'80% di tutti i casi di ictus. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è riprodurre un ictus ischemico nei topi. Innanzitutto, l'arteria carotide comune viene legata in modo temporaneo, mentre l'arteria carotide esterna viene legata in modo permanente nel punto più distale possibile. Un altro punto di sutura temporaneo, leggermente stretto, viene posizionato sull'arteria carotide esterna al di sopra della biforcazione.Il secondo passaggio consiste nel clampare l'arteria carotide interna utilizzando pinzette a azione inversa per evitare emorragie. Successivamente, si taglia l'ECA tra la legatura permanente e quella temporanea. Quindi, si introduce il monofilamento rivestito di silicone nell'ECA.Successivamente, l'ECA viene invertita per introdurre il monofilamento nell'ICA fino a includere la base dell'arteria cerebrale media. Un'ora dopo, il flusso ematico viene ripristinato rimuovendo il monofilamento, simulando così il ripristino del flusso ematico dopo la lisi di un coagulo tromboembolico nell'uomo. Infine, il deficit neurologico, che riflette il successo della T-M-C-A-O e la gravità dell'infarto, può essere valutato subito dopo la riperfusione e in diversi momenti successivi alla riperfusione.Il software Cyan dell'NIH viene utilizzato per calcolare il volume dell'infarto su sezioni cerebrali rappresentative colorate con violetto cristallo. Uno dei principali vantaggi dell'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media mediante tecnica del filamento intraluminale è che riproduce l'ictus ischemico nel paziente con il ripristino del flusso ematico, e lo sviluppo di questa procedura nei topi offre la possibilità di utilizzare strumenti genetici marcatori per identificare il ruolo di una proteina bersaglio. Nell'ictus, l'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media viene eseguita su topi maschi C57BL/6 di età compresa tra due e tre mesi, del peso compreso tra 22 e 28 grammi.Questo protocollo è stato approvato dal Comitato di Bioetica e Cura dell'IRCM per aumentare la riproducibilità del volume dell'infarto. Utilizziamo un monofilamento riutilizzabile lungo 12 millimetri, con rivestimento al silicio da sei oh, della Doco Corporation. Due ore prima dell'intervento chirurgico.Somministrare una dose di 0,03 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina a un topo per via intraperitoneale. Per iniziare la procedura, anestetizzare i topi con il 5% di isoflurano e mantenere l'anestesia al 2,5% di isoflurano; utilizzare un tappetino riscaldante per mantenere costante la temperatura corporea del topo durante l'intervento chirurgico. Disinfettare la cute del collo del topo con etanolo al 70% o Betadine. Successivamente, praticare un'incisione mediana nel collo ed allargare i tessuti molli al microscopio stereoscopico.Dissezionare in modo netto il collo del mouse per esporre la trachea. Successivamente, ritrarre i muscoli per individuare l'arteria carotidea. Dissezionare con attenzione l'arteria carotide comune sinistra dal tessuto circostante.Posizionare una sutura temporanea in seta da cinque ohm, tagliata in segmenti da 20 millimetri, attorno all'arteria. Prestare attenzione a non danneggiare il nervo vago. Successivamente, separare la biforcazione dell'arteria carotide comune interna sinistra o ICA e dell'arteria carotide comune esterna o ECA, quindi posizionare una sutura permanente attorno all'ECA il più distalmente possibile.E un altro punto di sutura temporaneo sull'ECA al di sopra della biforcazione. Quindi clampare la CIA sinistra utilizzando pinzette a azione inversa per evitare emorragie. Ancora una volta, prestare molta attenzione a non danneggiare il nervo vago.Praticare un piccolo foro nell'arteria carotide esterna (ECA) prima della biforcazione tra ECA e arteria carotide interna (ICA) e tra i punti di sutura permanenti e temporanei posizionati in precedenza. Successivamente, introdurre un filo di sutura monofilamento da 12 millimetri, in silicone rivestito sei-oh, nell'ECA, recidere completamente l'ECA e ripiegare il monofilamento all'interno dell'ICA. Legare saldamente la sutura per prevenire emorragie e rimuovere le pinzette ad azione inversa.Quindi introdurre il monofilamento nel circolo di Willis fino a quando il monofilamento ostruisce la base dell'arteria cerebrale media. L'inserzione avviene di circa nove-dieci millimetri oltre la biforcazione dell'arteria carotide esterna e dell'arteria carotide comune. Generalmente, il monofilamento verrà bloccato e non potrà più muoversi.Attenzione a non penetrare l'arteria tegumentale palatina. Fissare saldamente il punto sulla ECA al fine di mantenere il filamento in posizione. Chiudere ora la cute utilizzando un sistema automatico di chiusura delle ferite con clip. Iniettare un millilitro di soluzione salina per via sottocutanea e posizionare i topi sotto una lampada riscaldante a infrarossi durante il periodo post-occlusivo, che dura 60 minuti. Anestetizzare i topi come in precedenza e rimuovere le clip automatiche, aprendo leggermente il punto di legatura sulla ECA per consentire il ritiro del monofilamento e la riperfusione del sangue. Quindi legare in modo permanente il punto di legatura temporaneo sull’ECA per prevenire la perdita di sangue.Un'ora dopo l'ictus, rimuovere il monofilamento e conservarlo per un successivo utilizzo. Successivamente, rimuovere la sutura temporanea sulla carotide comune per consentire la ricircolazione del sangue. Chiudere la ferita e praticare la sutura sottocutanea.Iniettare un altro millilitro di soluzione salina nei topi. Dopo aver verificato che l'animale riprenda la mobilità, riposizionarlo nella gabbia e posizionare metà della gabbia sul tappetino riscaldante per consentire ai topi di scegliere il proprio ambiente. Dodici ore dopo l'intervento chirurgico, ai topi sottoposti a intervento fittizio viene somministrata un’ulteriore dose di buprenorfina.Tutte le procedure sono identiche tranne per il fatto che il monofilamento non viene inserito dopo l'intervento chirurgico. Il deficit neurologico viene valutato per confermare il successo della T-M-C-A-O e determinarne il punteggio di efficienza, valutando i deficit neurologici dei topi a 1, 24, 48 e 72 ore dopo la perfusione, su una scala a sei punti come segue: zero equivale a normale, uno equivale a lieve, rotazione con o senza arrotolamento inconsistente quando sollevati per la coda. Più del 50% dei tentativi di arrotolarsi verso il lato controlaterale.Due indica un'arricciamento lieve ma costante in più del 50% dei tentativi di arricciamento verso il lato controlaterale. Tre indica un arricciamento costante, forte e immediato. Il topo mantiene una posizione arrotolata per più di uno o due secondi.Con il naso che quasi tocca la coda. Quattro indica un arrotolamento grave. Il progredire verso la perdita del baricentro, del riflesso della deambulazione o della scrittura; cinque indica stato comatoso o accasciamento.Dopo la perfusione con soluzione PBS, congelare rapidamente i cervelli in isopentano e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Si noti che i cervelli di topo possono anche essere perfusi con paraformaldeide al 4%, a seconda degli studi di immunohistochemica previsti. Successivamente, utilizzare un criostato per tagliare sezioni cerebrali coronali di 17 micron utilizzando 30 vetrini.Posizionare una sezione ogni 30 sullo stesso vetrino. Quindi colorare il primo e il quindicesimo vetrino con violetto di cresta. Per una stima più accurata del volume della lesione, utilizzare un sistema di analisi delle immagini come Scion Image del NIH per valutare il delimitatore della lesione, l'area infartuale che appare bianca negli emisferi cerebrali sinistro e destro.Ripetere questa limitazione D su tutte le sezioni cerebrali. Calcolare il volume dell'infarto in unità arbitrarie ed esprimerlo come percentuale dell'area controlaterale non lesa per ogni sezione. Mantenere gli altri vetrini a meno 80 gradi Celsius per studi di immunohistochimica.La valutazione del punteggio neurologico conferma il successo della T-M-C-A-O nei miei soggetti sottoposti alla procedura intraluminale. Come osservato qui, si verifica un arrotolamento consistente, forte e intermedio, e il topo mantiene una posizione arrotolata per più di uno o due secondi con il naso che quasi raggiunge la coda. Nel nostro esperimento, tutti i topi hanno mostrato almeno un arrotolamento lieve ma consistente, che corrisponde a un punteggio neurologico di due per tutto il periodo del test.La colorazione con violetto di Kressel &egrave; stata eseguita per valutare l'estensione dell'infarto cerebrale. Successivamente alla T-M-C-A-O, mostrata qui, una sezione coronale rappresentativa del cervello di topo &egrave; stata colorata con violetto di Kressel dopo 72 ore dal ripristino della perfusione. L'area infartuata, principalmente il corpo striato e la corteccia e le aree cerebrali adiacenti, indicata, appare in bianco poich&eacute; non &egrave; stata colorata dal violetto di Kressel.Il viola mostrato qui rappresenta il volume della lesione, ovvero la parte bianca dell'emisfero destro espressa come percentuale dell'area controlaterale non lesa nell'emisfero sinistro. Il volume dell'infarto nei topi maschi C57BL/6 dopo un ictus ischemico rappresenta circa il 70% dell'emisfero non leso. Questa procedura garantisce una riproducibilità elevata della lesione.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un ictus ischemico transitorio nei topi. Inoltre, l'approccio del quiz viol per misurare il volume dell'infarto cerebrale ti offre il grande vantaggio di disporre di molti campioni su cui testare marcatori rilevanti mediante immunoistochimica. Grazie per aver guardato il video e buona fortuna con il tuo esperimento.

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Dimostriamo nel video un metodo per produrre una occlusione dell'arteria cerebrale media in topi adulti utilizzando un monofilamento intraluminale. Mostriamo anche come valutare il grado di infarto cerebrale da 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione.

Modello murino di Mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale

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Monitoraggio perfusione cerebrale è stata dimostrata per migliorare l'accuratezza in modelli ictus ischemico. Le difficoltà tecniche spesso limitano l'uso di questo strumento essenziale per la ricerca cerebrovascolare. In questo video, un sistema ottimizzato viene mostrato per ottenere un monitoraggio singolo o multi-sito emodinamico durante intraluminale occlusione dell'arteria cerebrale media nel ratto.

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Cervello cellule mieloidi caratterizzazione seguente ictus può essere eseguita utilizzando il metodo stereologia frazionatore ottica, o da una analisi citofluorimetrica del cervello leucociti sospensioni. Entrambi sono tecniche utili per effettuare un'accurata distinzione fenotipica delle principali sottopopolazioni di cellule mieloidi trovati nel cervello ischemico.

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In questo studio, modifichiamo un metodo sperimentale esistente per ottenere più risultati riproducibili, stabilendo un modello murino di occlusione (MCAO) dell'arteria cerebrale media. La somministrazione orale di Glycyrrhizae Radix et Estratto del metanolo di Rizoma (GR) (GRex), dopo induzione di colpo, diminuito significativamente il volume di infarto totale rispetto al gruppo di controllo non trattato.

Valutare gli effetti Neuroprotective di Glycyrrhizae Radix et Rhizoma estrarre utilizzando un modello murino di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media

Diversi modelli di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) sono utilizzati nella ricerca sperimentale sull'ictus. Qui, viene descritto un modello sperimentale di ictus di MCAo transitorio attraverso l'arteria carotide esterna (ECA), che mira a imitare l'ictus umano, in cui il trombo cerebrovascolare viene rimosso a causa della lisi spontanea del coagulo o della terapia.

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