Protocollo di raccolta per pancreas umano

L'obiettivo generale di questa procedura è sezionare il pancreas umano in modo da mantenere l'orientamento anatomico. Ciò si ottiene rimuovendo il duodeno e la milza dal pancreas, quindi eliminando il grasso e i vasi in eccesso dal pancreas. Il secondo passo consiste nel dipingere la superficie anteriore con inchiostro blu e la superficie posteriore con inchiostro nero.

Successivamente, il pancreas viene diviso in tre regioni. Ogni regione viene quindi tagliata trasversalmente in lastre uniformi e posta su cassette di paraffina, stampi OCT o ulteriormente tritata e posta in fiale. Infine, i campioni vengono raccolti da tutte e tre le regioni del pancreas, mentre viene mantenuto il corretto orientamento anatomico per le analisi future.

Questo metodo può aiutare ad affrontare le domande chiave nella ricerca sul diabete di tipo uno, come i meccanismi alla base della perdita di massa o funzione delle cellule beta e la natura dell'attacco delle cellule immunitarie. La dimostrazione visiva del metodo di lavorazione del pancreas è fondamentale poiché il mantenimento dell'orientamento in vivo del pancreas richiede attenzione ai dettagli. A dimostrare la procedura saranno Linda Snyder, isto-tecnologa ed Emily Montgomery, biologa nel mio laboratorio.

Inizia preparando tutti i materiali necessari per la procedura. Innanzitutto, etichettare le cassette che conterranno i blocchi di paraffina con un identificatore del donatore, un tipo di campione, un numero di aliquota e qualsiasi informazione aggiuntiva. Quindi, etichettare gli stampi OCT allo stesso modo.

Taglia abbastanza pezzi di carta stagnola per avvolgere ogni blocco OCT e mettili da parte per usarli in seguito. Preparare tutte le fiale necessarie per conservare i campioni freschi e congelati. Aggiungere RNA in un secondo momento e terreni RPMI quando appropriato.

Successivamente, preparare le aree di lavoro, posizionare le schede di dissezione, gli strumenti sterilizzati e tutte le altre forniture necessarie per la procedura sia in una cappa di biosicurezza che su un piano di lavoro. Disporre tutte le cassette e gli stampi OCT in ordine di utilizzo. Vicino. Crea un bagno gelido aggiungendo abbastanza isop pentano da coprire il ghiaccio secco sul fondo di una scatola di polistirolo.

Per iniziare la dissezione, rimuovere il duodeno e la milza. Inizia a separare il duodeno e il pancreas a un'estremità e continua fino a quando non si stacca completamente. La milza è attaccata in modo lasco e viene facilmente rimossa dal grasso e dal pancreas.

Successivamente, pulire il pancreas dai vasi adiposi e dai nervi estranei utilizzando una combinazione di dissezione smussata e tagliente. Mettere da parte il grasso e i linfonodi da processare in seguito. Una volta pulito, posizionare il pancreas su una tavola da dissezione coperta con carta assorbente.

Mantenere il corretto orientamento del pancreas è l'aspetto più difficile di questa procedura. Per garantire il successo, le superfici anteriore e posteriore sono verniciate con inchiostri di colore diverso. Immergere un applicatore con punta di cotone nell'inchiostro blu, stendere l'inchiostro sulla superficie anteriore del pancreas e tamponare l'eccesso.

Quindi, immergi un nuovo applicatore nell'inchiostro nero e stendilo sulla superficie posteriore del pancreas. Riportare il pancreas al suo orientamento normale. Con la superficie anteriore rivolta verso l'alto, il pancreas è ora pronto per essere tagliato in tre sezioni.

Per prima cosa, taglia la giunzione tra la testa e il corpo. Quindi, dividere la parte rimanente in porzioni approssimativamente uguali per separare il corpo e la coda, registrare il peso di ciascuna regione del pancreas. A partire dal poggiatesta.

Dividi ogni regione in sezioni di circa 0,5 centimetri tagliando in modo trasversale, in modo simile a tagliare una pagnotta di pane. Una volta che ogni regione del pancreas è stata affettata, rimuovere l'ultima sezione della regione della testa, che è la sezione di giunzione del corpo della testa, e posizionarla su una tavola da dissezione separata. Tritare questa sezione in piccoli pezzi e dividere i pezzi in modo uniforme tra fiale criogeniche etichettate con e senza RNA.

Successivamente, le fiale vengono congelate. Seguendo le procedure standard. Ripetere questa procedura per la sezione di giunzione della coda del corpo.

Una volta raccolti i campioni macinati, inclinare tutte le sezioni trasversali verso destra. Le sezioni alternate di ciascuna regione verranno rimosse. Per i blocchi di paraffina e OCT, rimuovere la prima sezione per il blocco della paraffina.

Se una sezione è troppo grande, tagliala a metà. Etichettare le cassette come A e B.Se il pezzo è ancora troppo grande, tagliare ogni sezione perpendicolarmente al taglio precedente, quindi etichettare le cassette da A a D in senso orario. Come mostrato qui, posizionare la cassetta in modo che l'etichetta sia a sinistra.

Quindi, posiziona il fazzoletto nella cassetta e chiudi il coperchio. Trasferire la cassetta in un contenitore contenente formina tamponata neutra. Numerare il blocco in sequenza all'interno di ogni regione, a partire dalla sezione più mediale per i blocchi OCT.

Versare uno strato sottile di terreno OCT in uno stampo pre-marcato Prima di introdurre il tessuto, coprire il tessuto con il terreno OCT e congelare rapidamente il campione per un uso successivo tornando al tessuto che è stato messo da parte in precedenza. Isolare i linfonodi pancreatici tagliando via il grasso e il tessuto connettivo che circonda la capsula linfonodale. Mettere i nodi in una capsula sterile contenente DMEF macinare nodi grandi in pezzi non più grandi di 0,5 centimetri.

Una volta isolati i linfonodi pancreatici, dividere il tessuto tra le fiale e le cassette preparate per un'ulteriore elaborazione. Dopo aver terminato i linfonodi, la milza viene tritata e conservata in modo simile. Per elaborare il duodeno, utilizzare una garza inumidita per pulire la mucosa dal muco, tagliare la mucosa e quindi tagliarla in sezioni.

Dividere i campioni di mucosa come mostrato in precedenza. Utilizzando questa procedura, vengono raccolti campioni rappresentativi di ciascuna regione del pancreas come si vede qui. I pesi della testa, del corpo e della coda erano approssimativamente uguali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare un pancreas umano in diversi tipi di campioni, in particolare la capacità di mantenere l'orientamento, nonché come isolare i linfonodi dal grasso peripancreatico.