Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall'intestino mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare rapidamente cellule dendritiche intestinali o DCs e macrofagi da mouse per la caratterizzazione fenotipica e funzionale. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando il tessuto intestinale. Il secondo passaggio consiste nel dissociare l'epitelio intestinale dalla lamina propria.

Successivamente, la lamina propria intestinale viene digerita durante le fasi finali della procedura. Le cellule della lamina propria vengono marcate con anticorpi coniugati a fluorescenza e selezionate per specifiche popolazioni cellulari. Infine, le popolazioni di DC intestinali e macrofagi possono essere caratterizzate e purificate con maggiore accuratezza per studi funzionali volti a valutare la produzione di citochine, la presentazione dell'antigene e la regolazione delle cellule immunitarie.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la rapidità della digestione del tessuto garantisce un'espressione ottimale degli antigeni sulla superficie cellulare, la vitalità cellulare e o la condizione cellulare. Dopo l'eutanasia del topo e la conferma della morte mediante il riflesso della pressione sulle dita dei piedi, spruzzare un test con etanolo al 70% sull'addome e sul torace dell'animale. Quindi, utilizzare un paio di forbici per praticare una piccola incisione orizzontale al centro dell'addome e staccare la pelle per esporre il peritoneo.

Aprire il peritoneo utilizzando le forbici dopo aver effettuato un'incisione allo sfintere pilorico per separare lo stomaco dall'intestino tenue superiore e usando pinze per dissezionare il mesentere. Effettuare un’altra incisione alla valvola ileocecale per liberare l'intero intestino tenue dal colon. Continuare a dissezionare il mesentere dal colon ed effettuare un'incisione al margine anale.

Utilizzare le forbici per aprire longitudinalmente il colon e utilizzare C-M-F-P-B-S a temperatura ambiente per lavare via i contenuti fecali e il muco dalla lume intestinale. Quindi utilizzare le forbici e la pinzetta per dissezionare macroscopicamente le placche di Peyer lungo la superficie antimesenterica dell'intestino tenue e aprire longitudinalmente l'intestino tenue.

Successivamente, rimuovere il lume dell'intestino tenue dai contenuti fecali e dal muco utilizzando ulteriore C-M-F-P-B-S a temperatura ambiente. A parte, tagliare l'intestino tenue e quello crasso in pezzi di circa 1,5 centimetri e porre i pezzi in singole provette coniche da 50 millilitri contenenti 30 millilitri di C-M-F-H-B-S-S preriscaldata con FBS e 2 millimoli di EDTA. Posizionare ogni provetta conica da 50 millilitri in posizione orizzontale su un agitatore orbitale, agitando le provette a 250 giri al minuto per 20 minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, posizionare un singolo setaccio in filo metallico sopra un contenitore per rifiuti. Versare il contenuto di ogni provetta conica da 50 millilitri attraverso il setaccio per recuperare i pezzi di intestino, quindi trasferirli in nuove provette coniche individuali da 50 millilitri contenenti 30 millilitri di C-M-F-H-B-S-S preriscaldata con FBS e 2 millimoli di EDTA. Infine, rimettere le provette nell’agitatore orbitale per altri 20 minuti.

Dopo il secondo ciclo di agitazione, versare il contenuto di ogni provetta attraverso il setaccio. Ancora una volta, asciugare l'eccesso di mezzo con un tovagliolo di carta, quindi trasferire i pezzi di intestino in una piccola barchetta di plastica per siero. L'aspetto più difficile di questa tecnica è la digestione del tessuto: per garantire il successo, è necessario considerare tutti i diversi parametri, come la durata della digestione, le proprietà della collagenasi, l'integrità del tessuto e le dimensioni del tessuto da digerire, il tutto da eseguire rapidamente con le forbici.

Tagliare i pezzi di intestino e quindi aggiungere l'intestino tritato in un tubo conico da 50 millimetri contenente 20 millilitri di soluzione di collaghenasi. Posizionare il tubo conico in posizione orizzontale nell'agitatore orbitale e digerire i pezzi di intestino a 200 giri al minuto per 10-20 minuti a 37 gradi Celsius. Vortexare brevemente il tubo per assicurare una completa dissociazione di qualsiasi tessuto intestinale residuo, quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 micron direttamente in un tubo conico da 50 millilitri.

Infine, aggiungere fino al bordo del tubo conico C-M-F-H-B-S-S con FBS e centrifugare la soluzione cellulare due volte per cinque minuti a 425 ×g a quattro gradi Celsius. Quindi versare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in C-M-F-H-B-S-S con FBS freddo di ghiaccio, ponendo i campioni sul ghiaccio. Dopo aver colorato le cellule per le proteine di superficie di interesse.

Iniziare creando un dot plot escludendo le cellule positive per la colorazione delle cellule morte, come mostrato qui. Successivamente, escludere gli eventi di doppiotti, come illustrato qui e qui. Ora utilizzare i canali di scattering anteriore e laterale per selezionare le cellule di interesse, assicurandosi di escludere i detriti.

Quindi creare un altro grafico a dispersione con porte sulla frazione positiva per CD45 e positiva per IAB. Presentare le cellule in un grafico a dispersione separato, creando regioni per distinguere i sottotipi specifici di DC e macrofagi. La regione R1 mostrata qui include le cellule positive per CD11C e negative o debolmente positive per CD11B.

La regione R due delimita le cellule che presentano un livello simile di espressione superficiale di CD11C rispetto alle cellule nella regione R uno, ma che esprimono anche CD11B. Le regioni R tre indicano le cellule CD11B positive e CD11C debolmente negative. Queste tre regioni possono essere ulteriormente analizzate per l'espressione di F480 e CD103 al fine di differenziare rispettivamente le popolazioni di macrofagi e DC. Come mostrato in questo dot plot, le cellule CD11C positive e CD11B debolmente negative nella regione R uno esprimeranno alti livelli dell'alfa ein CD103 e bassi livelli di F480.

Questo diagramma a punti mostra che le cellule CD11B positive e CD11C positive nella regione R2 saranno composte sia da DC che da macrofagi, in base alla loro espressione dicotomica di CD103 e F480. Infine, sulla base del loro profilo fenotipico positivo per F480 e negativo per CD103 nella regione R3, le cellule CD11B positive e CD11C del negative, selezionate mediante gating, saranno costituite da macrofagi. La relazione tra la durata della digestione del tessuto e il rendimento totale di cellule, nonché l'espressione di CD11B e CD11C, è illustrata nelle seguenti sei figure. Il tessuto intestinale digerito per tre minuti produce un numero totale di cellule basso, risultando in poche DC e macrofagi disponibili per la caratterizzazione; al contrario, una digestione del tessuto di 11 minuti produce un elevato rendimento di cellule vitali, ottenendo popolazioni di DC e macrofagi che esprimono alti livelli di CD11B e CD11C e che sono fenotipicamente distinte.

Al contrario, una digestione di 50 minuti determina un rendimento cellulare simile rispetto alla digestione ottimizzata. Tuttavia, la delimitazione delle diverse popolazioni cellulari mediante CD11b e CD11c diventa più difficile. Poiché l'espressione di CD11c diminuisce e il numero di cellule morte aumenta.

Pertanto, ottimizzando i parametri per la digestione del tessuto intestinale, è possibile ottenere rapidamente un’elevata resa cellulare. Di conseguenza, l’isolamento rapido di DC intestinali e macrofagi murini può risultare utile per valutare le proprietà funzionali delle cellule immunitarie con antigeni di superficie intatti.