Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall'intestino mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare rapidamente le cellule dendritiche intestinali di topo o dcs e macrofagi per la caratterizzazione fenotipica e funzionale. Ciò si ottiene prelevando prima il tessuto intestinale. Il secondo passo consiste nel dissociare l'epitelio intestinale dalla lamina propria.

Successivamente, la lamina propria intestinale viene digerita durante le fasi finali della procedura. Le cellule della lamina propria sono colorate con fluorescenza, anticorpi coniugati e gated per specifiche popolazioni cellulari. In definitiva, le popolazioni intestinali di DC e macrofagi possono essere caratterizzate e purificate in modo più accurato per studi funzionali per valutare la produzione di citochine, la presentazione dell'antigene e la regolazione delle cellule immunitarie.

Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la rapidità della digestione dei tessuti garantisce un'espressione ottimale dell'antigene sulla superficie cellulare, la vitalità cellulare e/o cellulare. Dopo l'eutanasia del topo e aver confermato la morte per il riflesso di pizzicamento del dito del piede, testare lo spruzzo di etanolo al 70% sull'addome e sul torace dell'animale. Quindi usa un paio di forbici per praticare una piccola incisione orizzontale al centro dell'addome e staccare la pelle per esporre il peritoneo.

Aprire il peritoneo usando le forbici dopo aver tagliato lo sfintere del pilo per separare lo stomaco dall'intestino tenue superiore e usando una pinza per stuzzicare il mesentere. Tagliare nuovamente la valvola ileocecale per liberare l'intero intestino tenue dall'intestino crasso. Continua a staccare il mesentere dall'intestino crasso e fai un taglio sul bordo anale.

Usa le forbici per aprire longitudinalmente il colon e usa la temperatura ambiente C-M-F-P-B-S per lavare via il contenuto fecale e il muco dal lume intestinale. Quindi utilizzare le forbici e le pinze per macroscopicamente. Sezionare i cerotti di pire lungo la superficie anti-mesenterica dell'intestino tenue e aprire l'intestino tenue longitudinalmente.

Successivamente, ripulire il lume dell'intestino tenue dal contenuto fecale e dal muco con più temperatura ambiente C-M-F-P-B-S. Separatamente, tagliare l'intestino tenue e crasso in pezzi di circa 1,5 centimetri e posizionare i pezzi in singole provette coniche da 50 millilitri contenenti 30 millilitri di C-M-F-H-B-S-S prebellico con FBS e due millimolari EDTA. Posizionare orizzontalmente ogni provetta conica da 50 millilitri in un agitatore orbitale, agitando le provette a 250 giri/min per 20 minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi posiziona un colino a rete singola su un secchio dei rifiuti. Versare il contenuto di ogni provetta conica da 50 millilitri attraverso la rete per recuperare i pezzi di intestino e poi metterli in nuove provette coniche individuali da 50 millilitri contenenti 30 millilitri di Prewarm C-M-F-H-B-S-S con FBS con due EDTA millimolari. Infine, riposizionare i tubi nell'agitatore orbitale per altri 20 minuti.

Dopo il secondo giro di agitazione, versare il contenuto di ogni tubo attraverso il colino. Ancora una volta, tampona via il terreno in eccesso usando un tovagliolo di carta, quindi trasferisci i pezzi di intestino in una piccola barchetta di siero di plastica. L'aspetto più difficile di questa tecnica è la digestione dei tessuti per garantire il successo, tutti i diversi parametri della durata della digestione, le proprietà della collagenasi, l'integrità dei tessuti e le dimensioni del tessuto da digerire devono essere considerati utilizzando rapidamente le forbici.

Tritare i pezzi intestinali e poi aggiungere l'intestino tritato in un tubo conico da 50 millimetri contenente 20 millilitri di soluzione di collagenasi. Posizionare il tubo conico orizzontalmente nell'agitatore orbitale e digerire i pezzi di intestino a 200 giri/min per 10-20 minuti a 37 gradi Celsius. Ora agitare brevemente il tubo per garantire una completa dissociazione di qualsiasi tessuto intestinale rimanente, quindi filtrare il liquame cellulare attraverso un colino cellulare da 100 micron direttamente in un tubo conico da 50 millilitri.

Infine, rabboccare la provetta conica con C-M-F-H-B-S-S con FBS e centrifugare la soluzione cellulare due volte per cinque minuti a 425 volte G a quattro gradi Celsius. Quindi versare il surnatante e risospendere il pellet di cella in C-M-F-H-B-S-S ghiacciato con FBS e posizionare i campioni sul ghiaccio. Dopo aver colorato le cellule per le proteine di superficie di interesse.

Inizia creando un grafico a punti escludendo le celle che sono positive per la colorazione delle cellule morte, come mostrato qui. Quindi, escludere gli eventi doppietta come illustrato qui e qui. Ora usa i canali di dispersione anteriori e laterali per controllare le celle di interesse, assicurandoti di escludere i detriti.

Quindi creare un altro gating a punti sull'antigene CD 45 positivo e IAB positivo. La presentazione delle cellule in un dot plot separato crea regioni per distinguere specifici sottoinsiemi di DC e macrofagi. La regione R one mostrata qui cattura le cellule CD 11 C positive CD 11 B opache negative.

La regione R due delinea le cellule che hanno un livello di espressione superficiale simile per CD 11 C come le cellule nella regione R uno, ma che esprimono anche CD 11 B. Le tre regioni R designano le cellule che sono CD 11, B positive e CD 11 C opache negative. Queste tre regioni possono essere ulteriormente analizzate per l'espressione di F 4 80 e CD 1 0 3 per differenziare rispettivamente le popolazioni di macrofagi e DC. Come si vede in questo dot plot, le cellule negative opache CD 11 C positive CD 11 B nella regione R one esprimeranno alti livelli di alfa ein CD 1 0 3 e bassi livelli di F quattro 80.

Questo dot plot mostra che le cellule CD 11 B positive e CD 11 C positive nella regione R due saranno composte sia da MDD che da macrofagi in base alla loro espressione dicotomica di CD 1, 0, 3 e F quattro, 80. Infine, sulla base del loro profilo fenotipico F quattro 80 positivo e CD 1 0 3 negativo R tre, CD 11 B positivo GCATED CD 11 C del negative sarà costituito da macrofagi, la relazione tra la durata della digestione tissutale sulla resa cellulare totale e l'espressione di CD 11 B e CD 11 C è illustrata nelle seguenti sei figure. Il tessuto intestinale che viene digerito per tre minuti produce un basso numero totale di cellule con conseguente riduzione delle dcs e dei macrofagi disponibili per la caratterizzazione La digestione dei tessuti per 11 minuti produce una robusta resa di cellule vive, producendo popolazioni di dcs e macrofagi che esprimono alti livelli di CD 11 B e CD 11 C che sono fenotipicamente distinti.

Al contrario, la digestione per 50 minuti si traduce in una resa cellulare simile rispetto alla digestione ottimizzata. Tuttavia, la delineazione di diverse popolazioni cellulari utilizzando CD 11 B e CD 11 C diventa più difficile. Man mano che l'espressione di CD 11 C diminuisce e il numero di cellule morte aumenta.

Quindi, dopo aver ottimizzato i parametri per la digestione del tessuto intestinale, è possibile ottenere rapidamente una robusta resa cellulare. Di conseguenza, il rapido isolamento di dcs e macrofagi intestinali di topo può essere utile per valutare le proprietà funzionali delle cellule immunitarie con antigeni di superficie intatti.