Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex

Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l'utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rivelare modelli complessi di espressione genica in un'intera struttura cerebrale intatta. Ciò si ottiene prima perfondendo l'animale e rimuovendo il cervello. Il cervelletto viene quindi sezionato e processato utilizzando il protocollo di colorazione dell'intera montatura.

Il passo finale consiste nel visualizzare l'espressione genica utilizzando una reazione istochimica del colore. In definitiva, la microscopia a riempimento luminoso viene utilizzata per visualizzare i modelli di espressione genica di superficie. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunoistochimica delle sezioni di tessuto, è la capacità di visualizzare modelli complessi in tre dimensioni senza la necessità di ricostruzione.

A dimostrare la procedura è Joshua White, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver sacrificato l'animale e rimosso il cervello dal cranio, separa il cervelletto dal resto del cervello inserendo prima le punte di un paio di pinze al centro dei calli superiori e inferiori. Quindi, usando un secondo paio di pinze, stuzzica lentamente i calli e la corteccia lontano dal cervelletto.

Orientare il cervelletto in modo che il lato anteriore sia rivolto verso il basso e il tronco encefalico sia rivolto verso l'alto. Ora inserisci la pinza nel quarto ventricolo tra il tronco encefalico e le labiale nove e 10 del cervelletto. Taglia i peduncoli pizzicando con la pinza su entrambi i lati, quindi solleva delicatamente il cervelletto dal tronco encefalico.

Postfissare il cervelletto mediante immersione in paraldeide al 4% a quattro gradi Celsius da un minimo di 24 a 48 ore. Il cervelletto può essere conservato in paraldeide al 4% per un lungo periodo di tempo mentre si lavora in una cappa aspirante. Versare delicatamente la soluzione di paraldeide e sostituirla con un fissaggio denso.

Posizionare il tubo contenente il cervelletto e la soluzione fissativa su un mutatore e agitare delicatamente per sei-otto ore. Trascorso il tempo di incubazione, versare il fix denso e sostituirlo con candeggina densa. Incubare il cervelletto in questa soluzione durante la notte a quattro gradi Celsius con dondolo il giorno successivo.

Sostituire la soluzione nel tubo con metanolo al 100%. Posizionare il tubo sul mutatore e farlo oscillare delicatamente a temperatura ambiente per 30 minuti. Trascorso il tempo di incubazione, sostituire la soluzione con metanolo fresco al 100% e ripetere l'incubazione per garantire la disidratazione del cervelletto.

Ora, congelare, scongelare il tessuto in metanolo al 100% mettendo la provetta in un contenitore con ghiaccio secco e congelare per 30 minuti. Trascorso questo tempo, utilizzare una pinza per rimuovere il tubo dal ghiaccio secco e quindi posizionarlo sul piano di lavoro per scongelare per 15 minuti. Ripetere la procedura di congelamento e scongelamento almeno quattro volte per migliorare la penetrazione delle soluzioni coloranti.

Dopo lo scongelamento finale, posizionare il tubo in un congelatore a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Il tessuto può essere conservato per periodi di tempo prolungati a meno 80 gradi Celsius, immediatamente prima o dopo le fasi di congelamento-scongelamento. In caso contrario, il protocollo deve essere continuato.

Il giorno dopo. Reidratare il cervelletto per immersione con dondolo al 50% di metanolo, 50% di PBS, 15% di metanolo, 85% di PBS e poi 100% di PBS per 60-90 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Successivamente, per il cervellare del topo adulto, sottoporre il tessuto alla digestione enzimatica con 10 microgrammi per millilitro di proteinasi K in PBS per due o tre minuti a temperatura ambiente con oscillazione.

Questa fase di digestione non è necessaria per i topi cerebellari di P cinque o più giovani. Dopo la digestione, versare immediatamente la proteinasi K e lavare il cervelletto in PB S3 volte per 10 minuti ciascuna per prevenire una digestione eccessiva. Dopo il lavaggio finale, sostituire la soluzione con P-B-S-M-T e ROCK durante la notte a quattro gradi Celsius per bloccare il tessuto il giorno successivo.

Versare la soluzione bloccante P-B-S-M-T e incubare il tessuto in anticorpo primario diluito in P-B-S-M-T. Integrato con il 5% di DMSO per 48 ore a quattro gradi Celsius con dondolo. Trascorso il tempo di incubazione, lavare il cervelletto due o tre volte per due o tre ore ciascuna in P-B-S-M-T a quattro gradi Celsius con dondolo per rimuovere gli anticorpi primari non legati.

Quindi incubare il tessuto in anticorpi secondari in una soluzione di P-B-S-M-T con il 5% di DMSO a quattro gradi Celsius durante la notte. Con il dondolio il giorno successivo, lavare il cervelletto in P-B-S-M-T come prima. Quindi eseguire un lavaggio finale in PBT per una o due ore con oscillazione a quattro gradi Celsius.

Questo passaggio rimuove il latte in eccesso e migliora la chiarezza della colorazione. Infine, incubare il tessuto in soluzione DAB. Fino a quando non viene raggiunta l'intensità di colorazione ottimale, è meglio utilizzare DAB al buio.

Quando la luce provoca la precipitazione del cromogeno, che può aumentare la colorazione di fondo. Il prodotto di reazione marrone dovrebbe essere chiaramente visibile entro 10 minuti quando viene raggiunta l'intensità di colorazione ottimale. Arrestare la reazione posizionando il cervelletto in PBS con azoturo di sodio allo 0,4%.

Il tessuto può essere conservato a lungo termine in questa soluzione. L'intero tessuto colorato della montatura deve essere visualizzato mentre è immerso in PBS o in un altro mezzo che fornisca un indice di rifrazione ottimale. Per posizionare facilmente l'intera montatura per l'imaging, creare un gel di agar all'1% in una piastra di Petri di plastica.

Quindi, praticare piccoli fori nel gel e quindi incastrare il cerebellare in questi fori con l'orientamento desiderato per l'imaging coprire il cerebellare con PBS. Il tessuto colorato è ora pronto per essere visualizzato utilizzando la microscopia ottica. ZEIN due Adelaide c.

L'immunoistochimica rivela bande sagittali nelle sezioni trasversali del cervelletto. I labici quattro, cinque e tre sono etichettati nel diagramma. Ai fini dell'orientamento, la barra della scala rappresenta 500 micron.

ZEIN due. Il C di Adelaide è espresso esclusivamente in sottogruppi di sata e dendriti a cellule kinji. In questa immagine, la barra della scala rappresenta 150 micron.

Questa immagine mostra un intero cervelletto colorato per zeina due, Adela C che mostra strisce di cellule bikini nelle immagini delle zone anteriore, centrale e posteriore del cervelletto. I numeri romani denotano i lecci cerebellari. LS è il loist simplex.

PML sta per il labiale paramediano. COP indica i parametri copulari e le etichette. Crosta uno e crosta due denotano i nomi di due LOE dell'emisfero, P uno e P tre si basano su una nomenclatura standard utilizzata per indicare specifiche strisce BR due.

Per ulteriori dettagli, Sillitoe e Hawks 2002. La barra della scala rappresenta un millimetro. Qui il cervelletto è stato immunocolorato con un anticorpo contro la cocaina e il peptide di trascrizione regolato dalle anfetamine.

Si può vedere. Quel carrello è espresso in sottogruppi di fibre rampicanti che viaggiano attraverso lo strato di cellule bikini etichettate PCL e terminano nello strato molecolare etichettato ml. Qui, la barra della scala rappresenta 100 micron.

In questa immagine si può vedere che le fibre positive del carrello proiettano una striscia di dendriti delle cellule bikini nello strato molecolare della corteccia cerebellare, comprese regioni come l'Oculus etichettato PFL e l'Oculus etichettato fl. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare di intaccare il cervelletto. Eventuali danni esterni oscureranno la visibilità di modelli di colorazione complessi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rivelare modelli complessi e interessanti di espressione genica nei neuroni e nelle fibre che li contattano nel cervello intatto.