Immunoistochimica Wholemount per rivelare Topografia Cervello Complex
5 aprile 2012
Circuiti neurali sono topograficamente organizzate in compartimenti funzionali con specifici profili molecolari. Qui, forniamo i passi pratici e tecnici per rivelare la topografia globale del cervello utilizzando un approccio versatile wholemount colorazione immunoistochimica. Abbiamo dimostrato l'utilità del metodo che utilizza il ben capito citoarchitettura e circuiti del cervelletto.
L'obiettivo generale di questa procedura è rivelare i complessi modelli di espressione genica in una struttura cerebrale intera e intatta. Questo risultato si ottiene innanzitutto perfondendo l'animale ed estraendo il cervello. Successivamente, il cervelletto viene dissezionato e processato utilizzando il protocollo di colorazione in toto.
L'ultimo passaggio consiste nella visualizzazione dell'espressione genica mediante una reazione colorimetrica istochimica. In definitiva, si utilizza la microscopia in campo chiaro per acquisire i modelli di espressione genica sulla superficie. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunohistochimica su sezioni di tessuto, è la capacità di visualizzare modelli complessi in tre dimensioni senza la necessità di ricostruzione.
La procedura è dimostrata da Joshua White, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo aver sacrificato l'animale ed estratto il cervello dal cranio, separare il cervelletto dal resto del cervello inserendo prima le punte di una pinzetta nel mezzo dei collicoli superiori e inferiori. Quindi, utilizzando una seconda pinzetta, staccare lentamente i collicoli e la corteccia dal cervelletto.
Orientare il cervelletto in modo che il lato anteriore sia rivolto verso il basso e il tronco encefalico sia rivolto verso l'alto. Inserire ora la pinza nel quarto ventricolo tra il tronco encefalico e i lobi 9 e 10 del cervelletto. Recidere i peduncoli stringendo con la pinza su entrambi i lati, quindi sollevare delicatamente il cervelletto dal tronco encefalico.
Postfissare il cervelletto per immersione in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per un periodo minimo di 24 fino a 48 ore. Il cervelletto può essere conservato in paraformaldeide al 4% per un periodo prolungato. Mentre si lavora in cappa, versare delicatamente la soluzione di paraformaldeide e sostituirla con fissativo denso.
Posizionare il tubo contenente il cervelletto e la soluzione fissante su un agitatore e far oscillare delicatamente per sei-otto ore. Trascorso il tempo di incubazione, versare via il fissativo denso e sostituirlo con candeggina concentrata. Incubare il cervelletto in questa soluzione tutta la notte a quattro gradi Celsius con agitazione anche il giorno successivo.
Sostituire la soluzione nel tubo con metanolo al 100%. Posizionare il tubo sul mutatore e agitare dolcemente a temperatura ambiente per 30 minuti. Trascorso il tempo di incubazione, sostituire la soluzione con metanolo al 100% fresco e ripetere l'incubazione per garantire la disidratazione del cervelletto.
Ora, congelare e scongelare il tessuto in metanolo al 100% posizionando il tubo in un contenitore con ghiaccio secco e congelando per 30 minuti. Trascorso questo tempo, utilizzare pinze per rimuovere il tubo dal ghiaccio secco, quindi posizionarlo sul bancone per farlo scongelare per 15 minuti. Ripetere la procedura di congelamento e scongelamento almeno quattro volte per migliorare la penetrazione delle soluzioni di marcatura.
Dopo l'ultimo scongelamento, inserire il tubo in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per tutta la notte. Il tessuto può essere conservato per lunghi periodi di tempo a meno 80 gradi Celsius, sia immediatamente prima che dopo i passaggi di congelamento-scongelamento. In caso contrario, il protocollo deve proseguire.
Il giorno successivo. Riidratare il cervelletto immergendolo in 50% metanolo, 50% PBS, seguito da 15% metanolo, 85% PBS e infine 100% PBS, agitando delicatamente per 60-90 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Successivamente, per il cervelletto adulto di topo, sottoporre il tessuto a digestione enzimatica con 10 microgrammi per millilitro di proteinasi K in PBS per due-tre minuti a temperatura ambiente, agitando delicatamente.
Questo passaggio di digestione non è necessario per i cervelletti di topi di P cinque o più giovani. Dopo la digestione, versare immediatamente il proteinasi K e lavare il cervelletto in PBS per 3 volte, 10 minuti ciascuno, per prevenire una digestione eccessiva. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire la soluzione con P-B-S-M-T e ROCK e lasciare in overnight a quattro gradi Celsius per bloccare il tessuto il giorno seguente.
Versare la soluzione bloccante P-B-S-M-T e incubare il tessuto nell'anticorpo primario diluito in P-B-S-M-T, supplementato con DMSO al 5%, per 48 ore a quattro gradi Celsius con agitazione. Trascorso il tempo di incubazione, lavare il cervelletto da due a tre volte per due-tre ore ciascuna in P-B-S-M-T a quattro gradi Celsius con agitazione per rimuovere gli anticorpi primari non legati.
Quindi incubare il tessuto nell'anticorpo secondario in una soluzione di P-B-S-M-T con DMSO al 5% a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, con agitazione, lavare il cervelletto in P-B-S-M-T come in precedenza. Successivamente eseguire un lavaggio finale in PBT da una a due ore con agitazione a quattro gradi Celsius.
Questo passaggio rimuove il latte in eccesso e migliora la chiarezza della colorazione. Infine, incubare il tessuto nella soluzione di DAB. Finché non si raggiunge l'intensità di colorazione ottimale, è preferibile utilizzare il DAB al buio.
La luce provoca la precipitazione del cromogeno, il che può aumentare la colorazione di fondo. Il prodotto della reazione marrone dovrebbe essere chiaramente visibile entro 10 minuti, quando si raggiunge l'intensità ottimale di colorazione. Arrestare la reazione ponendo il cervelletto in PBS con azide di sodio allo 0,4%.
Il tessuto può essere conservato a lungo termine in questa soluzione. Il tessuto colorato in toto deve essere osservato immergendolo in PBS o in un altro mezzo che fornisca un indice di rifrazione ottimale. Per posizionare agevolmente il preparato in toto durante l'osservazione, preparare un gel di agar al 1% in una piastra di Petri in plastica.
Successivamente, praticare piccoli fori nel gel e quindi inserire il cervelletto in questi fori nell'orientamento desiderato per l'acquisizione delle immagini; coprire il cervelletto con PBS. Il tessuto colorato è ora pronto per essere analizzato mediante microscopia ottica. ZEIN two Adelaide c.
L'immunoeistochimica rivela bande sagittali in sezioni trasversali del cervelletto. I labiali quattro, cinque e tre sono indicati nel diagramma. A scopo orientativo, la barra della scala rappresenta 500 micron.
ZEIN due. La C di Adelaide è espressa esclusivamente in sottoinsiemi di cellule kinji sata e dendriti. In questa immagine, la barra della scala rappresenta 150 micron.
Questa immagine mostra un cervelletto intero colorato per la zeina due, Adela C, che evidenzia le strisce delle cellule a bikini nelle immagini delle zone anteriore, centrale e posteriore del cervelletto. I numeri romani indicano i lobi del cervelletto. LS è il lobulo simplex.
PML indica il labiale paramediano. COP indica i parametri copulari e le etichette. Crosta uno e crosta due indicano i nomi di due LOE emisferiche, le denominazioni P uno e P tre si basano su una nomenclatura standard utilizzata per indicare specifiche strisce BR due.
Per ulteriori dettagli, Sillitoe e Hawks 2002. La barra della scala rappresenta un millimetro. Qui il cervelletto è stato immunomarcato con un anticorpo contro il peptide regolato dalla cocaina e dall'anfetamina (cocaine and amphetamine regulated transcript).
Si può osservare. Quel carrello è espresso in sottoinsiemi di fibre rampicanti che attraversano il livello delle cellule bikini etichettato PCL e terminano nel livello molecolare indicato come ml. Qui, la barra della scala rappresenta 100 micron.
Da questa immagine si può osservare che le fibre positive al cart proiettano strisce di dendriti delle cellule del bikini nello strato molecolare della corteccia cerebellare, comprese regioni come l'Oculus etichettato PFL e l'Oculus etichettato fl. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di evitare di lesionare il cervelletto. Qualsiasi danno esterno comprometterà la visibilità dei complessi schemi di colorazione.
Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rivelare modelli complessi e interessanti di espressione genica nei neuroni e nelle fibre che li contattano nel cervello integro.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per rivelare la topografia cerebrale globale mediante colorazione immunohistochimica su preparati interi. La tecnica consente la visualizzazione di complessi modelli di espressione genica in tre dimensioni, applicata specificamente al cervelletto.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunoeistochimica
- Topografia cerebrale
Sfondo
- I circuiti neurali sono organizzati in compartimenti funzionali.
- Comprendere la topografia cerebrale è fondamentale per la ricerca in neuroscienze.
- I metodi tradizionali potrebbero non visualizzare efficacemente i modelli complessi.
- La colorazione su preparati interi offre un approccio innovativo per lo studio delle strutture cerebrali.
Scopo dello studio
- Evidenziare complessi modelli di espressione genica in strutture cerebrali integre.
- Dimostrare l'utilità della colorazione immunohistochimica su preparati interi (wholemount).
- Visualizzare i modelli di espressione genica in tre dimensioni.
Metodi Utilizzati
- Perfusione dell'animale ed estrazione del cervello.
- Dissezione del cervelletto.
- Applicazione del protocollo di colorazione in toto.
- Visualizzazione dell'espressione genica mediante reazioni cromatiche istochimiche.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dei modelli di espressione genica sulla superficie.
- Dimostrazione dei vantaggi del metodo rispetto all'immunohistochimica su sezioni di tessuto.
- Capacità di osservare modelli complessi senza ricostruzione.
Conclusioni
- La tecnica di colorazione su preparato intero è efficace per lo studio della topografia cerebrale.
- Questo metodo migliora la comprensione dell'organizzazione dei circuiti neurali.
- Fornisce uno strumento prezioso per la futura ricerca in neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'immunohistochimica su preparati interi consente la visualizzazione diretta di complessi modelli di espressione proteica in strutture cerebrali integre, fornendo una visione tridimensionale della topografia molecolare senza artefatti di ricostruzione. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi rivelando distribuzioni spazialmente risolte di biomarcatori nei circuiti neurali rilevanti per la malattia, aumentando la fiducia predittiva nei modelli preclinici. Il metodo è particolarmente utile per ridurre i rischi nei programmi mirati al sistema nervoso centrale, chiarificando le relazioni anatomo-funzionali nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche mappando l'espressione proteica nell'architettura cerebrale tridimensionale nativa.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale delle target attraverso l'osservazione diretta del compartimentalizzazione molecolare.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio chiarificando la localizzazione dei biomarcatori nei percorsi cerebellari e afferenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive preservando la topologia integra del tessuto.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione dei saggi attraverso protocolli riproducibili di colorazione in toto.
- Scalabilità: Evidenzia il riutilizzo della piattaforma per studi comparativi tra specie e stadi di sviluppo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Discute la rilevanza delle malattie attraverso la visualizzazione delle proiezioni afferenti e della topografia molecolare.
- Allineamento Preclinico: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, utilizzando zebrinII/aldolaseC come esempio di biomarcatore.
- Decisioni Adeguate al Rischio: Si concentra sulla riduzione predittiva del rischio rivelando schemi complessi nella conformazione nativa.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica delle ipotesi all'identificazione dei composti promettenti, sostenendo la riduzione dei rischi biologici e la chiarificazione dei percorsi nel campo della ricerca sul sistema nervoso centrale.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi rivelando i modelli di espressione genica in lobuli e zone cerebellari integri.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso una colorazione e un'acquisizione standardizzate dell'espressione genica superficiale in tre dimensioni.
- Analisi: Mette in evidenza letture quantitative ottenute da reazioni cromatiche istochimiche che permettono il confronto dell'intensità di espressione tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica mediante la visualizzazione delle proiezioni delle fibre afferenti e dei loro campi terminali negli strati molecolari.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per studi comparativi di topografia in diversi modelli di roditori e regioni cerebrali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella mappatura dei circuiti neurali.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della colorazione su preparati interi per l'analisi dell'organizzazione tissutale ad alto rendimento.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci riguardo all'avanzamento o meno di un progetto, maggiore efficienza nell'uso del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di farmaci per il sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate su dati biomolecolari con risoluzione spaziale.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in neuroanatomia, immunohistochimica e microscopia.
- Esigenze di strumentazione e infrastruttura analitica, inclusi microtomi, agitatori orbitali, congelatori e microscopi a campo chiaro.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per le procedure di fissazione, disidratazione, bloccaggio e incubazione con anticorpi.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, inclusi i cervelletti di topo e ratto, e diverse fasi di sviluppo.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura, come l'evitare danni meccanici durante la dissezione per preservare la chiarezza della colorazione.
