Singolo ovociti Mutagenesi bisolfito

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la metilazione del DNA in un singolo ovocita. Ciò si ottiene rimuovendo prima le cellule del cumulo e la palita di sapone dagli ovociti raccolti. Il secondo passo consiste nell'incorporare l'ovocita in una soluzione di arolisi due a uno per proteggere la minima quantità di DNA dalla perdita o dal degrado.

Successivamente viene eseguita la mutagenesi del bi solfito, seguita dall'amplificazione attraverso la reazione a catena della polimerasi nidificata. Il passaggio finale consiste nel legare e clonare il prodotto PCR. I cloni vengono quindi prelevati, amplificati con PCR e inviati per il sequenziamento.

In definitiva, la mutagenesi e il sequenziamento del bisolfito vengono utilizzati per mostrare la metilazione del DNA nella citosina fosfato guina, o dinucleotidi CPG di una regione di interesse in un singolo ovocita. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mutagenesi del bisolfito di un numero elevato di cellule, è che i dati possono essere ottenuti da un singolo ovocita senza raggruppare i citi, la distorsione della PCR e la contaminazione delle cellule della chemio. Il giorno del prelievo degli ovociti, preparare nuovamente le soluzioni elencate nel protocollo scritto quando si preparano le soluzioni, ridurre la possibilità di contaminazione del DNA cambiando spesso i guanti e utilizzando i puntali filtranti, mantenere le provette angolate quando sono aperte e richiudere tutte le provette quando non sono in uso.

Iniziare la raccolta OSI posizionando gli ovadotti di topo sezionati in un mezzo M due e strappando la puleggia M per estrarre il complesso cellulare del cumulo. Quindi separare i citi dal complesso cellulare del cumulo utilizzando 0,3 milligrammi per millilitro di soluzione di ialuronidasi in una goccia da 30 microlitri di terreno M due. Conservare i citi in soluzione solo per il tempo necessario a rimuovere le cellule del cumulo poiché un'esposizione prolungata potrebbe danneggiarle.

Lavare gli ovociti in 30 microlitri di gocce di terreno M two trasferendo gli ovociti da goccia a goccia. Rimozione periodica delle cellule del cumulo per un totale di tre lavaggi. Rimuovere la Z di LUCITA utilizzando una soluzione acida di tiro.

Mettere prima gli ovociti in una goccia da 30 microlitri di soluzione, quindi trasferire in un'altra goccia da 30 microlitri. Poiché qualsiasi mezzo trasportato con sé, diluirà l'acido e ne ridurrà l'efficienza. Conservare i citi in soluzione solo per il tempo necessario a rimuovere la zona, poiché un'esposizione prolungata potrebbe danneggiarli.

Dopo la rimozione della zona, lavare nuovamente i citi in una goccia da 30 microlitri di terreno M due per eseguire l'inclusione agros, posizionare prima la soluzione di lisi su un blocco termico a 70 gradi Celsius. Aggiungere il punto di fusione basso preriscaldato, o LMP Agros, alla soluzione di lisi, producendo una soluzione AGROS a lisi due a uno. Quindi posizionare un singolo ovocita su un vetrino pulito in un terreno minimo di M due.

Il passo successivo consiste nell'incorporare il singolo cito nella soluzione Agros e lisi. Questo deve essere fatto rapidamente poiché gli agro si induriranno a temperature inferiori a 65 gradi Celsius. Prelevare al microscopio 10 microlitri della soluzione di lisi Agros in un puntale per pipetta.

Espellere delicatamente circa un microlitro o meno della soluzione agrolitica sul vetrino, lasciandola miscelare con il mezzo minimo. Raccogliere delicatamente l'ovocita nel puntale della pipetta. Quindi mettere tutti i 10 microlitri in un tubo einor con 300 microlitri di olio minerale in modo che la perlina risultante assuma una forma sferica.

Incubare la provetta con ghiaccio per 10 minuti per eseguire la lisi. Rimuovere i 300 microlitri di olio minerale e aggiungere 500 microlitri del tampone di lisi SDS. Incubare il campione per una notte in un bagno d'acqua impostato a 50 gradi Celsius il secondo giorno.

Preparare le soluzioni di mutagenesi del bisolfuro fresche come descritto nel protocollo scritto. Iniziare la mutagenesi rimuovendo completamente i 500 microlitri di tampone di lisi SDS. Tieni presente che l'eventuale tampone di lisi rimanente diluirà l'agros quando viene riscaldato e il cordone sarà più suscettibile di dissolversi nei passaggi successivi.

Dopo la rimozione completa del tampone di lisi, aggiungere 300 microlitri di olio minerale. Incubare il campione per due minuti e mezzo su un blocco termico a 90 gradi Celsius. Prendi il carato per mescolare o mescolare, estendere o fluttuare la temperatura.

Dopo due minuti e mezzo. Incubare il campione su ghiaccio per 10 minuti. Per eseguire la denaturazione, rimuovere l'olio minerale e aggiungere un millilitro di idrossido di sodio molare 0,1 al movimento del tubo e capovolgere il tubo cinque o sei volte.

Incubare il campione per 15 minuti. In un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius che si inverte ogni tre o quattro minuti, la perlina dovrebbe galleggiare nell'idrossido di sodio. Si noti che il tallone non si trova più sul fondo del tubo.

Per eseguire il trattamento con solfito, centrifugare prima delicatamente il tubo dopo la rimozione dell'idrossido di sodio. Aggiungere 300 microlitri di olio minerale e 500 microlitri di soluzione di solfito BIS. Fare attenzione a evitare l'esposizione alla luce e incubare la provetta per tre ore e mezza in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius.

Ora esegui la desinazione. Per prima cosa, incubare il campione su ghiaccio per tre minuti prima di rimuovere l'olio minerale e la soluzione di solfito BIS. Dopo una leggera centrifuga, aggiungere un millilitro di idrossido di sodio molare da 0,3 e capovolgere il tubo cinque o sei volte.

Incubare il campione per 15 minuti. In un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius che si inverte ogni tre o quattro minuti, ancora una volta, la perla dovrebbe galleggiare nell'idrossido di sodio prima di iniziare la PCR. Lavare i campioni centrifugando prima delicatamente.

Quindi rimuovere l'idrossido di sodio e aggiungere un millilitro di un xte pH 7,5. Agitare per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Dopo una seconda centrifuga delicata, rimuovere quello XTE.

Ripetere questo processo di lavaggio due volte. Aggiungere quindi un millilitro di autoclave, acqua bidistillata. Agitare per cinque-10 minuti a temperatura ambiente, centrifugare delicatamente per la terza volta e rimuovere l'acqua.

Ripetere due volte il doppio lavaggio con acqua distillata. Infine, rimuovere tutto il surnatante, lasciando solo la perlina di aros. Verificare che il pH del surnatante sia 5,0.

Se il surnatante è ancora troppo basico, lavare nuovamente le perline con acqua distillata doppia. Nel frattempo, aggiungere la prima miscela di PCR alla provetta PCR come descritto nel protocollo scritto. Far scorrere l'agro speed solido fino al bordo del tubo dell'einor.

Quindi trasferire con cura la velocità agro nella provetta PCR, scaldare a 70 gradi Celsius per un minuto e mescolare, quindi amplificare, come suggerito nel protocollo scritto. Dopo l'amplificazione del primo ciclo, preparare la reazione PCR del secondo ciclo utilizzando cinque microlitri del prodotto del primo ciclo come modello. Assicurati di bipa sotto lo strato di olio minerale.

Procedere con l'esecuzione del secondo ciclo di amplificazione come indicato nel testo come test diagnostico. I campioni del secondo ciclo possono essere tagliati con un enzima di restrizione che è la metilazione o l'elettroforesi specifica del ceppo i prodotti della digestione su un gel di acrilammide all'8%. Tutte le bande eterogenee che risultano rappresentano più di una sequenza per clonare il prodotto del secondo round si legano nel vettore ed eseguire il clonaggio TA come descritto nel manoscritto che accompagna questo video dopo la piastra di clonazione TA, tutta la reazione si mescola su una piastra di agar e LB, integrata con ampicillina, ex gal e IPTG e incubare la piastra a 37 gradi Celsius durante la notte.

Quindi aggiungere la miscela master PCR della colonia alla provetta PCR come elencato nel protocollo scritto. Prelevare una colonia batterica bianca dalla piastra con la punta di una pipetta e farla roteare in 35 microlitri della miscela master PCR per colonie in una provetta per PCR. Procedere ad amplificare la sospensione come descritto nel testo successivo all'elettroforesi di amplificazione PCR quattro microlitri di prodotto PCR su un gel AGROS all'1,5%.

Infine, inviare circa 30 microlitri del prodotto PCR per il sequenziamento di cinque PCR di colonie per cito. Una volta ottenuti i risultati del sequenziamento, è possibile leggere i modelli di metilazione di qualsiasi citosina guanina originale rimasta tale. Al contrario, qualsiasi guanina di citosina originale che ora è una guanina tiamina è stata demetilata dopo l'amplificazione PCR nidificata utilizzando primer convertiti in bisolfito.

È possibile confermare una conversione riuscita visualizzando una dimensione corretta del frammento su una metafase individuale di aros gel. Due ovociti rappresentano un allele parentale e in teoria ha un modello di metilazione impresso in quanto tale. I prodotti PCR del secondo ciclo possono essere testati per la contaminazione non intenzionale.

Un enzima di restrizione sensibile alla metilazione del DNA può essere utilizzato per digerire il prodotto della PCR del secondo ciclo per valutare se contiene un allele metilato o non metilato. Qui, una citosina metilata all'interno della sequenza di riconoscimento dell'enzima viene scissa. Mentre una citosina non metilata che viene convertita in timina non è più riconosciuta dall'enzima e non è tagliata, qualsiasi campione di ovociti di metafase due contenente sia alleli metilati che non metilati deve essere scartato in quanto è indicativo di contaminazione cellulare del cumulo o inclusione di corpi polari dopo legatura e trasformazione.

L'amplificazione della PCR delle colonie può essere visualizzata su un gel AROS per garantire che i campioni con la dimensione corretta del prodotto vengano inviati per il sequenziamento. Per questo esempio, la dimensione prevista dell'amplicone dopo la legatura è di centinaia di 56 coppie di basi. In questo caso, il clone cinque ha una dimensione dell'amplicone errata e non dovrebbe essere inviato per il sequenziamento.

La sequenza di cinque singoli cloni da un ovocita in metafase due dovrebbe produrre cinque modelli di metilazione identici e tassi di conversione non CPG identici. Tutti i campioni che contengono più di un modello devono essere scartati. Poiché i due citi, la metafase ovulata ha due copie cromosomiche o un corpo polare attaccato, c'è la possibilità di ottenere due modelli di sequenza simili.

I dati devono essere scartati da tutti i citi che hanno pattern di metilazione altamente dissimili. Poiché non è possibile escludere la contaminazione delle cellule del cumulo Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare prima di lavare gli ovociti più volte in terreno fresco, dopo il trattamento HI IDE per rimuovere il maggior numero possibile di cellule cumuliformi. In secondo luogo, gli agro a basso punto di fusione si induriscono a temperature inferiori a 65 gradi Celsius, quindi lavora con attenzione ma rapidamente.

Infine, il sodio bis solfato e l'idrochinone sono sensibili alla luce, quindi le provette e le soluzioni di reazione devono essere avvolte in un foglio.