Formulazioni per la liofilizzazione di batteri e la loro influenza sulla sopravvivenza cellulare

Lo scopo del seguente esperimento è osservare l'effetto che diversi tipi di formulazioni per la liofilizzazione hanno sulla sopravvivenza cellulare. Per iniziare, si preparano diverse formulazioni per la liofilizzazione della coltura cellulare. Successivamente, ciascuna formulazione viene mescolata con la coltura cellulare, quindi liofilizzata, reidratata e infine vengono misurati i tassi di sopravvivenza.

I risultati mostrano differenze nei tassi di sopravvivenza che possono essere correlate alle proprietà caratterizzate. Questo metodo può aiutare a comprendere quali proprietà fisiche e strutturali di una formulazione siano importanti per la sopravvivenza cellulare durante la disidratazione. Per preparare una coltura iniziale di pseudomonas putter, iniziare inoculando 100 millilitri di triptych soy broth, o TSB, con una colonia di cellule coltivate su agar arricchito con triptych soy broth o TSB; incubare la coltura a 30 gradi Celsius, agitando a 130 giri al minuto per sette ore.

Trasferire un’aliquota della coltura in TSB fresco e coltivare per 16 ore. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.500 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare il pellet cellulare mediante risospensione in cloruro di sodio 150 millimolare.

Centrifugare le cellule e risospendere. Sospendere le cellule in mezzo di formulazione. Per preparare le soluzioni di formulazione per la liofilizzazione delle cellule.

Pesare i rispettivi componenti della matrice e scioglierli in acqua per ottenere condizioni isotoniche. Regolare la soluzione con l'eccipiente, cloruro di sodio, o altri soluti compatibili con le cellule. Per ri-sospendere in modo omogeneo le cellule in una soluzione a bassa viscosità, vorticare le soluzioni ad alta viscosità.

Aggiungere una bacchetta magnetica e agitare la miscela. Successivamente, dividere le formulazioni in vial per liofilizzatore precedentemente pesati e pesare i vial. Prelevare 100 microlitri da ogni campione ed effettuare diluizioni seriali decimali, piastrando le diluizioni desiderate e incubando a temperatura ambiente. Se i vial devono essere sigillati all'interno del liofilizzatore, posizionare un tappo di gomma su ciascun vial a partire dalle cellule piastrate.

Enumerare le cellule in ogni formulazione. Utilizzando il metodo della duna, misurare la tensione superficiale delle miscele batteriche parzialmente essiccate. Pulire l'anello di platino posizionandolo in una fiamma incolore finché non diventa rosso.

Utilizzando acetone e un tessuto senza pelucchi, risciacquare e pulire il recipiente di misurazione e bruciarne l'interno con una fiamma. Riempire il recipiente con la soluzione e lasciare stabilizzare la superficie prima di effettuare la misurazione, per soluzioni che richiedono tempo per raggiungere l'equilibrio. L'allestimento qui utilizzato fornirà dati qualitativi per formulazioni con elevate viscosità.

Utilizzare una soluzione a concentrazione più bassa per misurare la tensione superficiale ed estrapolare che le condizioni di liofilizzazione devono essere adattate alle proprietà fisiche della formulazione. Il parametro più importante è la temperatura di transizione vetrosa o TG della formulazione, indicata come TG primario per il campione congelato concentrato, che indica la presenza residua di acqua. Per determinare il comportamento di congelamento della formulazione, racchiudere da cinque a dieci milligrammi del campione in un campione di alluminio per calorimetria differenziale a scansione o DSC con coperchio.

Preparare un crogiolo vuoto come riferimento. Impostare il programma di scansione termica del DSC in modo da riprodurre la fase di congelamento del programma di liofilizzazione. Questo viene fatto perché la cinetica di raffreddamento può influenzare la TG prime delle formulazioni non liofilizzate prima dell'inizio della scansione di riscaldamento.

Portare la temperatura ben al di sotto della tg prevista. Per le formulazioni in esame, scegliere un'adeguata velocità di riscaldamento. Il segnale di flusso termico registrato è espresso in watt e sarà influenzato dalla velocità di riscaldamento.

Un tasso di riscaldamento più elevato fornirà un segnale più intenso di TG prime; impostare il range di temperatura in modo da coprire sia TG prime che la fusione della formulazione. Una volta determinato il comportamento di congelamento, regolare i parametri del processo di liofilizzazione in modo che la temperatura del campione sia sempre al di sotto della TG del campione e che la pressione nella camera consenta una rapida sublimazione del ghiaccio e dell'acqua residua nella formulazione. Per proteggere i prodotti essiccati dopo la liofilizzazione.

Controllare l'atmosfera del campione sigillando i campioni nel liofilizzatore prima che il vuoto venga rilasciato al termine del ciclo di liofilizzazione. In alternativa, i vial possono essere riempiti con un'atmosfera preferita. È importante evitare di esporre i campioni a condizioni ambientali, poiché qualsiasi umidità o ossigeno presente nell'atmosfera di conservazione influenzerà la sopravvivenza delle cellule.

Infine, pesare i vial per analizzare i campioni mediante raggi X. Caricare una piccola quantità della matrice batterica su un portacampioni e montare il portacampioni nel refrattometro a raggi X. Utilizzare il software compatibile con l'apparecchiatura a raggi X per analizzare qualsiasi fase cristallina presente nel campione.

Per analizzare la matrice batterica mediante microscopia elettronica, depositare una piccola quantità su nastro di carbonio fissato su un supporto per microscopio elettronico a scansione (SEM). Inserire il portacampioni SEM in un apparecchio di metallizzazione e ricoprire il campione con oro e palladio o platino per ottenere l'immagine del campione. Inserire il portacampioni SEM nella camera e selezionare i parametri di imaging appropriati.

Ad esempio, su questo strumento utilizziamo una tensione di accelerazione di cinque chilovolt, una dimensione del spot pari a tre, una distanza di lavoro di cinque millimetri e il rilevatore di elettroni secondari. Questa tabella elenca i dati relativi a diverse formulazioni, inclusi gli eventi termici registrati mediante DSC durante il riscaldamento delle formulazioni congelate, la struttura dei campioni secchi e la tensione superficiale delle soluzioni delle formulazioni. La Tg' del saccarosio è di meno 40 gradi Celsius e può risultare difficile rilevare concentrazioni di saccarosio inferiori al 20% in peso.

L'evento termico a meno 35 gradi Celsius è probabilmente correlato all'inizio della dissoluzione del ghiaccio mostrato qui. Dati di sopravvivenza per P putter Gram-negativo e a CHLOROPHYL cus Gram-positivo formulati in diverse formulazioni a base di saccaridi. Si noti che l'andamento dell'efficacia della formulazione nel sostenere la sopravvivenza cellulare è simile per entrambe le specie batteriche.

Questo grafico illustra la correlazione tra la sopravvivenza dopo la liofilizzazione e le tensioni superficiali delle formulazioni, indicando che tensioni superficiali più elevate determinano tassi di sopravvivenza maggiori. Le immagini SEM mostrate qui rappresentano formulazioni essiccate di quattro polimeri diversi, i cui matrici hanno l'aspetto di carta croccante o di fogli lisci interconnessi con motivi corrugati in cui sono incapsulati batteri per fi, ccal e saccarosio. I fogli hanno uno spessore di circa un micron e una larghezza compresa tra 10 e 20 micron, con fi ccal che presenta una superficie più liscia rispetto a HPMC e HEC, che formano fogli molto più sottili.

E i batteri sono più facilmente visibili, probabilmente perché il rapporto polimero-batteri è inferiore in queste formulazioni a base di cellulosa. Inoltre, sono stati osservati cristalli di sale per HEC e HPMC, con quest'ultimo che mostrava una quantità maggiore di precipitati sulla superficie dei fogli di polimero. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come la sopravvivenza cellulare dipenda dalle proprietà della formulazione, utilizzando le tecniche qui mostrate.