Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Questo è un magnete Max MIDI. Dice, attenzione ai campi magnetici estremamente forti. Ciao, sono Melanie Matthew del laboratorio Mike Collins presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California Irvine.

Oggi vi mostreremo una preparazione di selezione negativa di cellule T positive CD four utilizzando i kit biotecnologici Milton. Quindi qui abbiamo il minimax e i magneti minimax e il minimax sono usati per separazioni più grandi. È possibile eseguire fino a 10 celle fino alla nona attraverso una colonna che si adatta al minimax e i minimax vengono utilizzati per volumi molto più piccoli di celle.

Quindi, a seconda che tu stia facendo o meno una separazione positiva o negativa, etichetterai le tue cellule con l'anticorpo appropriato. Hanno un battito magnetico su di essi che si attaccherà al magnete. Nel caso di una selezione negativa, le celle che ti interessano passeranno attraverso la colonna e potrai raccogliere l'inquinante EL, che conterrà le tue celle di interesse.

Dovrei menzionare che le tecniche che vi sto mostrando stasera non sono sterili. Quindi, se si desidera utilizzare queste cellule per la coltura cellulare, è necessario fare tutto nella cappa di coltura tissutale con strumenti sterili. Quindi, anche se vi sto mostrando un preparato per le cellule T positive CD quattro, molte di queste tecniche sono applicabili nella purificazione di altri tipi di cellule utilizzando i minuscoli kit biotecnologici.

Ok, quindi ho rimosso i linfonodi dal topo, e vi mostro come farlo in dettaglio nel numero sette di Joe lymphnode preparation for two photon imaging. E ora macinerò i linfonodi in una singola sospensione cellulare all'interno di un colino cellulare da 70 micron. Ok, ora macinerò i linfonodi in una sospensione a cellula singola usando il retro di una siringa da sei millilitri.

I linfonodi si trovano in RPMI all'interno di un filtro ed è importante effettuare una corretta sospensione a singola cellula. E il motivo per cui lo stiamo facendo in un filtro è che vuoi assicurarti di non avere grumi di cellule. Quindi, quando ho finito di macinare, tolgo il filtro dal media e poi uso tutto ciò che è passato attraverso il filtro e la sospensione a cella singola.

Quando stai macinando, vuoi assicurarti di distruggere tutto il tessuto il più possibile. Questa sospensione a cellula singola è ciò da cui purificheremo le nostre quattro cellule T positive CD. Ok, ora ho finito di macinare il tessuto e puoi vedere che la maggior parte dei linfonodi è praticamente sparita.

Abbiamo ancora alcuni piccoli pezzi di grasso e una specie di guscio di un linfonodo qui con un po' di tessuto connettivo che è tutto attaccato insieme da tutti e sei i linfonodi. E ora tolgo il filtro cellulare. E potete vedere qui che i media sono molto nuvolosi.

È pieno di celle dalla sospensione a cella singola per garantire che otteniamo un numero massimo di celle dal filtro e alcune di esse si attaccheranno ad esso. Lo lavo con un paio di mil di terreno e poi pipeggio tutto il terreno nel tubo Falcon da 15 mil e lo faccio girare verso il basso per far cadere le cellule attraverso la successiva purificazione. Ecco la mia sospensione a cellula singola, centrifugata e pellettata a 300 G per 10 minuti.

Se pensi di avere un'elevata popolazione di cellule morte nella tua sospensione a cellula singola, è una buona idea utilizzare il kit per la rimozione delle cellule morte di Milit Tene. Quindi, ora che ho fatto questo, verserò il terreno e farò una lisi dei globuli rossi, e poi conterò le cellule e poi farò un kit di selezione negativa di quattro cellule T positive su queste particolari cellule. Ok, ora vado a fare una lisi dei globuli rossi.

Liceremo i globuli rossi che abbiamo pellettato insieme ai linfociti diminuendo l'osmolarità della soluzione aggiungendo prima acqua e poi riportandola a una soluzione uno x aggiungendo 10 X-D-B-P-S. I nostri linfociti sono più resistenti al cambiamento di osmolarità rispetto ai globuli rossi, ma dobbiamo comunque lavorare rapidamente o lenteciti, cosa che non vogliamo fare. Parte del lavoro rapido consiste nel riempire i volumi di cui avrò bisogno per la lisi prima di aggiungere effettivamente l'acqua al sistema.

Quindi voglio essere in grado di aggiungere i miei 10 X-D-B-P-S-pochi secondi dopo aver aggiunto la mia acqua per assicurarmi di non lisare i miei linfociti e di regolare i globuli rossi. Quindi prendo 900 microlitri di acqua. È quasi un mulino e cento microlitri di 10 X-D-B-P-S.

Ho entrambi i tubi pronti per l'uso. Nella lisi, aggiungo l'acqua, aspetto un paio di secondi, magari scuoto un po' il tubo e poi aggiungo il 10 X-D-B-P-S, scuoto ancora un po' il tubo. E se avete un sacco di globuli rossi che sono lisina, vedrete una grande forma di blob amorfo di tutte le membrane cellulari rotte.

Ne abbiamo un po' qui e potete vedere che si tratta di un po' di membrane cellulari rotte. Quindi, dopo aver eseguito la lisi, nel caso in cui ci sia stato un errore di pipettaggio, mi piace aggiungere alcuni macinatori di terreno alle cellule per assicurarmi che l'osmolarità sia corretta e non si continui più con la lisina. Ok, quindi ora ho i miei linfociti nella sospensione unicellulare.

Ancora una volta, ho fatto la lisi dei globuli rossi e li farò girare e pellettare. Prima di fare ciò, li conterò sull'emocitometro per determinare la quantità di anticorpi che dobbiamo aggiungere per il kit di selezione negativa delle cellule T positive CD quattro. Ok, quindi ora spendo le celle nel buffer massimo e puoi vedere che il pellet è molto più bianco dopo aver fatto la lisi dei globuli rossi.

E farò una selezione negativa per le cellule T positive di quattro CD. Quindi verserò via tutto il supporto, tutto il buffer massimo in cui spendo le cellule. E etichetterò con il cocktail di anticorpi alla biotina, che è il primo passo nella selezione negativa per le cellule T positive per la CD.

E poi incubasco in frigorifero per 10 minuti. Ok, quindi le mie cellule hanno finito con la loro incubazione iniziale. Ora aggiungo l'antibiotico alle microsfere e le rimetto in frigorifero per 15 minuti.

Quindi, per questa particolare separazione cellulare, usiamo una colonna LS di Milit tiny biotech e noi, quello che faremo è metterla sul supporto magnetico e preparare la colonna facendo scorrere tre mulini di tampone massimo Attraverso di essa, apriremo la colonna e la posizioneremo in modo che i rebbi siano rivolti verso l'interno nel magnete. Ora aggiungerò il buffer massimo alla colonna e dovresti vederlo scendere nella colonna LS e iniziare a gocciolare in basso. Non preoccuparti che la colonna si esaurisca.

La tensione superficiale del liquido impedirà che si asciughi fino a quando non aggiungi le cellule. Prima di aggiungere le celle, è importante lasciare che il buffer massimo beva completamente attraverso la colonna. Ok, quindi dopo i 15 minuti di incubazione con le nostre perle magnetiche di biotina che ho speso sulle cellule e sul tampone massimo, verserò via il tampone, le sospenderò nuovamente in una quantità di tampone appropriata al nostro numero di cellule.

Quindi dovrai controllare il tuo protocollo milli minuscolo per questo. E poi li applicherò alla colonna che abbiamo appena risciacquato con max buffer. Quindi ora aggiungeremo la sospensione della cella alla colonna.

E poiché questa è una colonna di selezione negativa, raccoglieremo le cellule che sono fluite attraverso e quelle dovrebbero essere tutte cellule T positive CD quattro in questo caso. Quindi ora laverò la colonna con 12 mil di tampone massimo e, di nuovo, stiamo raccogliendo l'eluizione, che dovrebbe contenere solo quattro cellule T positive CD. Quindi ora farò girare le quattro cellule T positive del CD, le risospenderò e poi le etichetterò con il colorante appropriato che userò per l'imaging tau.

Prendo anche un piccolo campione delle cellule che ho purificato e le etichetterò con anti CD tre e anti CD quattro e le eseguirò sui fatti per assicurarmi di avere una popolazione pulita di cellule T positive per CD quattro. Quindi ecco uno sguardo alle celle che abbiamo appena fatto girare. Questa dovrebbe essere una popolazione di cellule T CD 3 pure, CD quattro positive.

Quindi vi ho appena mostrato la selezione negativa per la CD con quattro cellule T positive. Usando il minuscolo kit biotecnologico Milit, trasferiremo in modo adottivo queste cellule in un topo e le useremo per uno dei nostri esperimenti con il fotone T e la macchina. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.