Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic C. elegans

Lo scopo di questa procedura è quantificare in modo efficiente le dimensioni e la luminosità dei segnali fluorescenti puntiformi nei gans. In questo modo, è possibile analizzare popolazioni molto ampie di oggetti. Vengono acquisite immagini di proteine sinaptiche a livello statistico.

In questa dimostrazione, il primo passaggio del procedimento consiste nel generare colture sincronizzate ad alta densità di ELEGANS di interesse. Successivamente, ottenere immagini confocali delle sinapsi marcate, minimizzando la variabilità da immagine a immagine. Le puntine sinaptiche vengono identificate automaticamente e distinte dalla fluorescenza di fondo.

L'ultimo passaggio consiste nel tabulare e organizzare i dati per un'analisi successiva efficiente. In definitiva, i risultati possono mostrare con precisione come le condizioni sperimentali influenzino la distribuzione delle proteine sinaptiche o di qualsiasi altra proteina localizzata in punti ad alto contrasto. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi delle proiezioni di Zack, è che tutti i dati vengono conservati, inclusi i volumi delle sinapsi, e l'identificazione automatizzata permette la rapida raccolta di centinaia di campioni per ogni condizione. Testato.

Questo protocollo richiede colture ad alta densità di vermi adulti CL egan cresciuti su piastre in agar NGM con peptone da 10 centimetri su batteri NA 22 e Coli; preparare esattamente una piastra per ogni colorazione immunologica prevista. Iniziare raccogliendo i vermi con alcuni millilitri di acqua. Trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri e ripetere questo processo fino a quando la maggior parte dei vermi è stata raccolta.

Centrifugare i vermi e lavare il pellet con acqua fino a tre volte, fino a quando il soprannatante è limpido. Questo passaggio elimina i batteri residui; trasferire sempre le soluzioni che potrebbero o contengono vermi o uova utilizzando pipette di plastica, poiché questi possono aderire al vetro. Ora è fondamentale procedere rapidamente attraverso i passaggi rimanenti per evitare la perdita della vitalità delle uova.

Rilasciare le uova del verme ripiegandole in cinque millilitri di soluzione alcalina di ipoclorito. Agitare delicatamente i tubi ed esaminarli al microscopio stereoscopico circa una volta al minuto. Dopo cinque minuti, o non appena circa metà dei vermi in un tubo appare piegata e aperta.

Riempire il tubo fino all'orlo con buffer per uova e capovolgerlo più volte. Dopo aver centrifugato i vermi, aspirare e scartare il sopranatante. Quindi lavare il pellet tre volte con buffer per uova.

Dopo i lavaggi, Reese sospende il pellet in cinque millilitri di acqua, quindi aggiunge cinque millilitri di saccarosio sterile al 60% in acqua e mescola bene. Dopo la centrifugazione della sospensione, le uova si troveranno al menisco e appariranno torbide.

Trasferire ogni raccolta di uova su una propria piastra di Agar NGM da 10 centimetri non seminata. Si può usare acqua per risciacquare X sulla piastra, ma cercare di minimizzare la quantità di liquidi trasferiti. Incubare le piastre tutta la notte a 20 gradi Celsius per le prime ore. Arieggiare le piastre lasciando i coperchi leggermente sollevati, ma assicurarsi di coprirle durante la notte.

Dopo l'eclosione, trasferire i larvi L1 in un tubo conico da 15 millilitri riempito con S basilico. Raccogliere i L1 in pellet e risospendere in un volume minimo di S basilico. Quindi suddividere ciascuna raccolta di L1 su due piastre in agar NGM da 10 centimetri seminate con batteri NA22.

Monitorare le colture una o due volte al giorno. Se sono a rischio di denutrizione, trasferirle su piastre NA 22 fresche prima che avvenga la denutrizione, mentre le linee di raccolta di tipo N si muovono insieme come un'onda lontano dalle zone prive di cibo; su queste piastre, il cibo verrà completamente esaurito nell'arco di poche ore.

Quando i vermi raggiungono l'età desiderata, sono pronti per l'immunomarcatura o per l'imaging in vivo per il montaggio dei vermi. Per l'imaging confocale, utilizzare il mezzo di montaggio Antifa per regolare la loro densità a poche centinaia di vermi per microlitro.

Con l'esperienza, questa densità può essere riconosciuta dalla torbidità della sospensione. Idealmente, i vermi dovranno essere fitti sul vetrino del microscopio, ma senza sovrapporsi eccessivamente. Sul vetrino, preparare un cuscinetto di 2%aros in basilico ESP circondato da un sottile anello di vaselina.

Per evitare l'evaporazione durante l'acquisizione delle immagini, applicare il Vaseline mediante una siringa da tre millilitri munita di un ago da 25 gauge con la punta tagliata. Pipettare ora alcune microlitri della sospensione di vermi su un cover slip utilizzando un puntale di pipetta con l'estremità tagliata per evitare il taglio meccanico dei vermi, quindi abbassare delicatamente il pad di agarosio sul cover slip, distribuendo uniformemente i vermi sul pad osservando al microscopio. Le sinapsi di interesse devono essere orientate in modo da puntare direttamente verso l'obiettivo o entro 45 gradi rispetto ad esso.

Dedicare alcuni secondi a questa operazione per evitare lo sbiancamento fotochimico. La coltura e le condizioni devono fornire un numero sufficiente di vermi per soddisfare questo rigido criterio mostrato qui come orientamento ideale, con il cordone ventrale orientato direttamente verso l'obiettivo della lente. Questo esempio successivo verrebbe scartato perché il cordone ventrale è orientato direttamente in senso opposto rispetto all'obiettivo della lente.

Si noti come il cordone dorsale orientato verso l'obiettivo in questo campione produca un'immagine più nitida. Ecco un altro esempio che verrebbe scartato perché i cordoni dorsale e ventrale sono orientati ai margini del verme. Pertanto, la luce di eccitazione e quella di emissione devono attraversare una maggiore quantità di tessuto del verme e risulterebbero distorte.

La sfida principale è ridurre al minimo la variabilità all'interno dei gruppi sottoposti a trattamento; la sincronizzazione per età e la selezione di vermi in cui la struttura di interesse è orientata direttamente verso l'obiettivo microscopico possono essere di grande aiuto. Partire da colture numerose aumenta la possibilità di scelta dei vermi, garantendo una maggiore uniformità. Per ottenere i migliori risultati di imaging, scegliere campioni relativamente piatti che possano essere contenuti in una serie di 14 o meno immagini sovrapposte.

Sezioni di spessore di 0,4 micron. Immagini ad alta velocità e bassa risoluzione sono sufficienti per una raccolta dati rapida e accurata. Evitare di saturare il rilevatore con segnali eccessivamente intensi, poiché ciò causerebbe una sottostima dei segnali di fluorescenza.

Questa dimostrazione utilizza il pacchetto software disponibile in commercio Velocity, che deve essere almeno nella versione 4.0. Molte alternative software perdono informazioni tridimensionali. Dopo aver aperto i file di output multi-tiff provenienti dal microscopio confocale, selezionare immagine, quindi messa a fuoco estesa e infine disegno a mano libera.

Ora l'area di interesse ritaglia le zone dell'immagine che non contengono la struttura di interesse. Utilizzando lo strumento attivato, la messa a fuoco estesa fornisce una proiezione del piano Z per facilitare la selezione dell'area di interesse. Questo non influisce sui dati sottostanti.

Analogamente, le regolazioni di luminosità e contrasto non influiscono sui dati sottostanti. Completare il ritaglio selezionando azioni e ritaglio alla selezione. Successivamente, misurare la lunghezza dell'area analizzata.

Utilizzando lo strumento linea, la lunghezza della linea verrà calcolata e aggiunta alla tabella dei dati. Ora, identificare gli oggetti utilizzando il filtro oggetti per intensità in modalità misurazione. L'inclusione di un marcatore sinaptico indipendente marcato con un colore univoco può aiutare a identificare in modo inequivocabile le sinapsi; specificare una soglia tale per cui gli aggregati sinaptici vengano evidenziati e lo sfondo non sinaptico non lo sia.

Eseguire questa operazione una sola volta utilizzando un campione di controllo e utilizzare tale valore per tutti i campioni successivi; effettuare la sogliatura di ciascun campione separatamente è inaccettabile poiché introduce la possibilità di un bias sperimentale. Gli oggetti vengono selezionati e tabulati automaticamente. Le sinapsi tipiche variano da pochi a qualche centinaio di voxel; prima di esportare i dati, ordinare i dati in base alla dimensione degli oggetti.

Questo facilita la rimozione successiva di oggetti costituiti da due o meno voxel, che di solito sono semplici imperfezioni di fondo. Ora esportare i dati in formati CSV, apribili con qualsiasi programma di foglio elettronico. Ogni immagine produce un singolo file di output per ordinare ed esportare micrografie del cordone nervoso ventrale dei gangli CL in cui si osservano 49 recettori GABA, ottenute con il protocollo descritto.

Tutti gli animali apparivano molto simili per dimensioni e maturità. I valori totali della fluorescenza sinaptica per cinque vermi sono stati normalizzati rispetto alla lunghezza del cordone nervoso analizzato. Questi dati mostravano valori di errore standard di circa il 10% della media.

L'immagine a sinistra è grezza, senza soglia né rimozione del fondo specifico. Le sinapsi sono state trattate con mus carmal, un agonista del recettore GABA che induce il downregolamento dei recettori dopo un'esposizione prolungata. La fluorescenza totale è stata quantificata e normalizzata rispetto alla lunghezza del cordone nervoso e alla probabilità cumulativa.

Sono stati calcolati gli istogrammi del contenuto di fluorescenza individuale delle sinapsi. Lo stesso è stato calcolato per il volume sinaptico. Queste misurazioni mostrano che l'esposizione all'agonista riduce significativamente il contenuto sinaptico e il volume.

Complessivamente, i risultati quantitativi dovrebbero sempre rispecchiare ciò che può essere apprezzato visivamente. In caso contrario, l'ispezione delle immagini e degli oggetti identificati in base alla velocità dovrebbe rivelare dove si è verificato l'errore e suggerire azioni correttive come il thresholding o la rimozione di artefatti durante il tentativo di questa procedura. È fondamentale scegliere i vermi da sottoporre a imaging in base al loro orientamento geometrico piuttosto che a una valutazione soggettiva della qualità dell'immagine; laddove possibile, si raccomanda vivamente l'uso di un punteggio cieco.