NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il metabolismo. Utilizzando l'imaging NADH in una preparazione cardiaca funzionante, ciò si ottiene isolando prima il cuore del coniglio. Il secondo passo della procedura consiste nel cannulare con successo tutte e quattro le camere del cuore per ottenere un modello di cuore funzionante.

Il passaggio finale consiste nell'impostare l'apparecchiatura di imaging e raccogliere i dati NADH a diverse velocità di stimolazione. In definitiva, i risultati possono mostrare cambiamenti metabolici del cuore attraverso l'imaging del NADH fluorescente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la retroprofusione lanor, è che il cuore funziona nel suo stato fisiologico con il flusso nella direzione normale e con il cuore che fornisce la propria pressione per la perfusione coronarica.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in elettrofisiologia e ai meccanismi delle aritmie letali. Ciò viene fatto fornendo un modello fisiologico per studiare il legame tra il metabolismo del flusso coronarico e l'attività elettrica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di incannulamento dei vasi e della camera cardiaca sono difficili da imparare.

Una tecnica impropria può danneggiare il cuore e mettere a repentaglio il resto dell'esperimento. Prima di eseguire un esperimento, sciacquare tutti i tubi nelle camere del sistema cardiaco funzionante con acqua purificata, quindi spurgare l'acqua dal sistema facendo funzionare le pompe. Aggiungere filtri a membrana in cellulosa in linea con la pompa di perfusione LOR, la pompa di perfusione del cuore sinistro e la pompa di perfusione del cuore destro.

Dopo aver aggiunto perfuse eight al sistema, eseguire una calibrazione a due punti per ciascun sensore di pressione. Accendere il bagnomaria di circolazione riscaldato che riscalda i tubi rivestiti d'acqua e gli scambiatori di calore Accendere il bagnomaria. Utilizzato per riscaldare il PERFUSE eight.

Accendere le pompe che fanno circolare il PERFUSE otto in un circuito chiuso, accendere il serbatoio di circolazione per ossigenare il Perfuse. Otto, assicurarsi che l'ossigenatore in microfibra o i filtri emo forniscano il 95% di ossigeno all'otto perfuso a 80 kilopascal. Infine, assicurarsi che gli scambiatori di calore mantengano la temperatura del perfuso circolante.

Otto a 37 gradi Celsius, iniziare l'escissione cardiaca impostando prima il sistema cardiaco funzionante in modo che funzioni a pressione costante. Modalità LRF. Impostare la pressione del blocco aortico tra 50 e 60 a dopo aver sedato un coniglio.

Iniettare pentobarbital ed eparina nella vena marginale dell'orecchio o nella vena safena laterale all'interno dell'arto posteriore. Una volta che il coniglio manca di un riflesso del dolore, apri rapidamente la cavità toracica. Affettare il pericardio, bloccare l'aorta e asportare il cuore e i polmoni.

I polmoni vengono mantenuti attaccati per facilitare l'isolamento delle vene polmonari. Quindi, riempire una siringa con 60 millilitri per F otto e 200 unità di eparina. Collegare una cannula da cinque millimetri e incannulare l'aorta.

Fissare l'aorta alla cannula con punti di sutura di seta di misura zero. Quindi premere lentamente la siringa per espellere il sangue attraverso il cuore. Imposta il sistema cardiaco funzionante collegando prima il cuore al blocco aortico.

Avvicinarsi al connettore con un angolo obliquo e lasciare che Perfuse eight goccioli delicatamente dal connettore nella cannula mentre è collegato. Ciò impedisce all'aria di entrare nell'aorta, prevenendo così gli emboli coronarici mentre il cuore è perfuso a pressione costante. L endorf modalità.

Rimuovere il grasso e il tessuto connettivo e individuare i seguenti vasi. Vena cva inferiore e superiore, vena alosa, arteria polmonare e vene polmonari. Successivamente, ligate la vena cva superiore.

Taglia l'arteria polmonare appena sotto il punto in cui si dirama alle arterie polmonari destra e sinistra. I vasi rimanenti sono le vene polmonari. Raggruppali tra il cuore e i polmoni e legali tutti usando una sutura.

Questo è fondamentale per due motivi. Innanzitutto, legare i vasi collegati ai polmoni garantirà l'assenza di perdite una volta completata l'incannulamento. E in secondo luogo, è importante isolare entrambi i VNA cava avvolgono la successiva incannulamento.

Ora rimuovi i polmoni. Praticare un foro di dimensioni adeguate nell'angolo dell'appendice atriale sinistra e assicurarsi che sia riempito con abbondante otto. Quindi, incannulare l'appendice mentre la cannula è completamente riempita di perfuse otto.

Quindi, tenendo il tessuto, suturare la cannula all'appendice. Il tessuto dell'appendice atriale sinistra è estremamente delicato e può strapparsi facilmente. Quindi è importante incannulare l'atrio sinistro al primo tentativo, altrimenti potrebbe non essere possibile.

Accendere la pompa numero due per fornire flusso all'atrio sinistro. Impostare il precarico tra due e sei per tutta la durata dell'esperimento. Potrebbe essere necessario regolare la pressione.

Mantenerlo entro due millimetri dalla pressione target. Ora passa il cuore alla modalità cuore funzionante spegnendo momentaneamente la pompa numero uno, la pompa langor. Diminuire la pressione aortica per tendere a tor e poi aumentarla lentamente fino a un intervallo compreso tra 80 e 100 tor.

Ciò consente alla valvola aortica di aprirsi e funzionare come farebbe durante le normali condizioni fisiologiche. Impostare la pressione finale di postcarico su un valore di circa 20. Strappato meno della pressione ventricolare sinistra di picco utilizzando una cannula collegata direttamente al sistema.

Incannulare l'atrio destro attraverso la vena inferiore CVA e suturare la cannula alla vena. Evitare di introdurre bolle d'aria. Accendere la pompa numero tre, la pompa sul lato destro per fornire il flusso all'atrio destro.

Impostare la pressione a circa tre tor. Infine, incannulare il ventricolo destro senza consentire l'ingresso di aria e suturare la cannula all'arteria polmonare. Questo completa l'incannulamento biventricolare.

Ora procedi con l'acquisizione del segnale. Inserire con cautela il catetere del trasduttore di pressione nell'aorta tramite la cannula dell'aorta. Navigalo delicatamente oltre la valvola aortica e nel ventriglio.

Il segnale di pressione ventricolare sinistra apparirà come previsto quando la punta del catetere è posizionata correttamente. Quindi, premere delicatamente l'elettrodo del potenziale d'azione monofasico contro l'epicardio ventricolare. Un leggero artefatto di movimento nel segnale dell'elettrodo è normale.

Successivamente, posizionare un elettrodo di stimolo bipolare sull'atrio destro per stimolare il cuore secondo la posizione del progetto sperimentale. E focalizza la telecamera CCD sulla regione di interesse del cuore. Dovrebbe esserci un filtro di emissione collegato alla fotocamera.

Per superare la fluorescenza NADH, spegnere le luci ambientali per illuminare uniformemente l'epicardio con una sorgente di luce UV sulla postazione di lavoro, a cui è collegata la telecamera. Per impostare il software in modo che acquisisca le immagini a due fotogrammi al secondo. Quindi seleziona la modalità di aggiornamento in tempo reale per monitorare l'intensità media dei pixel all'interno della regione di interesse.

Se la profusione è stata adeguata, i livelli di NADH rappresentati dalla fluorescenza dovrebbero essere bassi e stabili sulla superficie epicardica. A questo punto, esegui l'esperimento quando è completo. Togliete il cuore.

Svuotare il PERFUSE eight e i tubi e le camere del sistema con acqua purificata. Sciacquare periodicamente il sistema con una soluzione di TM per mucosa o una soluzione di perossido di idrogeno diluito utilizzando il protocollo descritto. I cuori sono stati incollati a lunghezze di ciclo comprese tra 200 e 400 battiti al minuto.

La LVP diastolica era solitamente compresa tra zero e 10 tor, la pressione aortica diastolica minima era di circa 60 Tor, la LVP sistolica di picco dipende dalla pressione di riempimento e dalla contrattilità e dovrebbe essere idealmente compresa tra 60 e 80. Per la pressione aortica massima e la LVP massima dovrebbero corrispondere strettamente all'azione monofasica I potenziali tipici del cuore di un coniglio hanno una fase di depolarizzazione rapida e una fase di ripolarizzazione caratteristica. I potenziali d'azione sono stati facilmente registrati dai preparati, ma di solito avevano un piccolo artefatto da movimento durante la diastole.

I valori medi di NADH fluorescente da una regione di interesse nella scatola rossa sono stati misurati per monitorare i cambiamenti nello stato redox mitocondriale durante tre cicli di stimolazione a lunghezze psicologiche di 300, 200 e 150 millisecondi quando la frequenza di stimolazione era vicina al ritmo sinusale. Il livello basale di NADH era relativamente costante man mano che la durata del ciclo si accorciava. Al di sotto dei 300 millisecondi di base, i livelli di NADH sono aumentati con l'aumento maggiore a 150 millisecondi, il segnale oscilla con la contrazione e la frequenza di oscillazione corrisponde alla frequenza cardiaca.

L'ampiezza di queste oscillazioni era sempre inferiore a qualsiasi tendenza su scala temporale più lunga causata da ischemia o ipossia. L'imaging fluorescente NADH ad alta risoluzione dell'intera superficie anteriore a 200 battiti al minuto era costante e spazialmente omogeneo a 400 battiti al minuto. I livelli di NADH sono aumentati notevolmente in tutto l'epicardio.

È stata osservata una significativa eterogeneità spaziale, con i maggiori aumenti che si sono verificati all'interno delle regioni settali del ventricolo destro e sinistro una volta padroneggiati. Questa tecnica può essere eseguita in meno di 45 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di evitare che bolle d'aria entrino nell'aorta o nell'atrio sinistro Dopo questa procedura.

Ulteriori metodi, come caricare il cuore con un colorante sensibile alla tensione, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come il collegamento dell'attività elettrica e metabolica sulla superficie del cuore durante scenari patologici come l'ischemia locale dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in fisiologia cardiaca per studiare il metabolismo cardiaco e i disturbi della conduzione durante le condizioni patologiche utilizzando un modello fisiologicamente più rilevante.