Name: NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Impara l'imaging di NADH a fluorescenza in cuori biventricolari isolati di coniglio per studiare il metabolismo cardiaco. Questo metodo permette di monitorare lo stato redox mitocondriale in condizioni fisiologiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del NIH (R01-HL095828 di Kay MW).

1. Impostazione per lo Studio <ol><li> Preparare quattro litri di modifica Krebs-Henseleit soluzione di 16 (in mM: 118 NaCl, 3,30 KCl, CaCl 2 2,00, 1,20 MgSO 4, 24,0 NaHCO 3, 1,20 KH 2 PO 4, glucosio 10,0, 2,00 NaPyruvate, e 20,0 mg / L albumina ). La soluzione deve essere preparata come prossimità dell&#39;inizio dell&#39;esperimento possibile. Il pH deve essere regolato a 7,4 dopo la filtrazione sterile (dimensione dei pori: 22 micron, Corning). Osmolalità soluzione deve essere tra 275 e 295 mOsm / kg. </li><li> Sciacquare tutti i tubi e le camere di cuore del sistema di lavoro con acqua purificata. Eseguire pompe finché tutta l&#39;acqua è stata rimossa dal sistema. </li><li> Aggiungi filtri a membrana di cellulosa (dimensione dei pori: 5 micron, ADVANTEC) in linea con ciascuna delle pompe di perfusione (pompa di perfusione Langendorff, a sinistra della pompa perfusione cardiaca, e proprio la pompa perfusione cardiaca). </li><li> Eseguire una calibrazione a due punti (0 e 60 mmHg) per ogni sensore di pressione. </li><li>Accendere i bagni. Un bagno riscaldato acqua circolante (Cole Palmer) viene utilizzato per riscaldare l&#39;acqua con camicia tubi e scambiatori di calore. Perfusato viene pre-riscaldato in un bagno di acqua separata (Oakton Instruments). Entrambi i bagni sono impostati per mantenere una temperatura soluzione di 37 ° C. </li><li> Accendere le pompe per far circolare il perfusato in un anello chiuso. Perfusato passa attraverso ossigenatori in microfibra (hemofilters) gasati con il 95% O 2 e 5% CO 2 a 80 kPa. Perfusato ossigenata scorre poi attraverso scambiatori di calore per mantenere ad una temperatura di 37 ° C prima di entrare nella cannule cuore. </li></ol> 2. Cuore Escissione <ol><li> Iniziare impostando il sistema di cuore al lavoro per operare in modo costante Langendorff pressione. Impostare la pressione del blocco aortica entro l&#39;intervallo da 50 a 60 mmHg. </li><li> Anestetizzare la coniglio con una iniezione intramuscolare di ketamina (44 mg / Kg) e xilazina (10 mg / Kg). Dopo il coniglio è sedato, pentobarbital (50 mg / Kg) ed eparina (2000 U) viene iniettata per via endovenosa attraverso la vena marginale dell&#39;orecchio o la vena safena laterale all&#39;interno dell&#39;arto posteriore. </li><li> Quando il coniglio è completamente non-reattivo, come determinato da una mancanza di dolore riflesso, la cavità toracica viene aperto rapidamente, il pericardio è tagliato, l&#39;aorta viene bloccato, e il cuore e polmoni sono rimossi. A questo punto i polmoni dovrebbe essere lasciata attaccata al cuore per aiutare a isolare le vene polmonari. </li><li> Isolare e incannulare l&#39;aorta con una cannula diametro di 5 mm che è attaccato ad una siringa riempita con 60 ml perfusato e 200 unità di eparina. Fissare l&#39;aorta alla cannula con sutura di seta zero dimensioni e lentamente premere il siringa per lavare il cuore di sangue. </li></ol> 3. Cannulazione biventricolare <ol><li> Collegare il cuore al blocco aortica del sistema cardiaco di lavoro. Impedire all&#39;aria di entrare nella aorta, che può causare emboli coronarica. Si consiglia di allegare la cannula al bl aorticaOCK avvicinando il connettore aortica ad un angolo obliquo e consentendo perfusato a gocciolare dolcemente dal connettore nella cannula mentre è installata. </li><li> Mentre il cuore è perfuso in modo costante Langendorff pressione, togliere il grasso e tessuto connettivo e individuare i vasi seguenti: inferiore e vena cava superiore, vena azygos, arteria polmonare, vene polmonari. </li><li> Legare la vena cava superiore. Tagliare l&#39;arteria polmonare appena al di sotto dove si dirama verso le arterie polmonari destra e sinistra. </li><li> Raggruppare tutti i vasi rimanenti (delle vene polmonari) tra il cuore ei polmoni e legare il tutto con una sutura. Rimuovere i polmoni. </li><li> Praticare un piccolo foro in un angolo dell&#39;appendice atriale sinistra. Assicurarsi che il LA è pieno di perfusato. Incannulare la LA assicurando nel contempo che la cannula è completamente riempito con perfusato mentre viene inserito. Suturare la cannula per l&#39;appendice LA. </li><li> Accendere la pompa del lato sinistro (pompa # 2) per fornire un flusso di tha lasciato atrio. Impostare la pressione precarico tra 2-6 mmHg e regolare ± 2 mmHg, come determinato dalla dilatazione atriale. </li><li> Accendere il cuore a cuore la modalità di lavoro disattivando la pompa Langendorff (pompa # 1). </li><li> Momentaneamente diminuire la pressione aortica a 10 mmHg e poi lentamente per aumentare nell&#39;intervallo da 80 a 100 mmHg. Questo permetterà la valvola aortica per aprire e funzionare come sarebbe in condizioni fisiologiche normali. La pressione finale postcarico dipenderà la contrattilità del LV. Esso dovrebbe essere impostato ad un valore che è circa 20 mmHg inferiore alla pressione di picco LV. </li><li> LV portata cardiaca può essere determinata misurando la portata del perfusato all&#39;uscita dal blocco aortica (ml / min). Gittata cardiaca normale è tra 14,77 e 16,43 mL / min per 100 g di peso corporeo 17 e medie 340 mL / min per un coniglio 2,2 kg. Pressione aortica dovrebbe assomigliare il segnale di pressione illustrato in Figura 1. </li><li> Cannulare il RA attraverso l&#39;inferior vena cava. Verificare che il RA e la cannula vengano riempiti con perfusato e inserire la cannula evitando la formazione di bolle d&#39;aria. Suturare la cannula per la vena. </li><li> Accendere la pompa del lato destro (pompa # 3) per fornire un flusso all&#39;atrio destro. Impostare la pressione di circa 3 mmHg. </li><li> Assicurarsi che il RV è pieno di perfusato e incannulare l&#39;arteria polmonare. Assicurarsi che la cannula è completamente riempito con perfusato mentre viene inserita per evitare bolle d&#39;aria. Suturare la cannula per l&#39;arteria polmonare. </li></ol> 4. Acquisizione del segnale: Pressioni, potenziali d&#39;azione monofasici e fNADH <ol><li> Una volta cannulazione biventricolare è completa, cura di inserire il catetere trasduttore di pressione (Millar) nell&#39;aorta attraverso la cannula aorta. Delicatamente navigare oltre la valvola aortica e nella LV. Monitorare il segnale di pressione LV per garantire il corretto posizionamento della punta del catetere. Un esempio di pressione LV è mostratoin figura 1. </li><li> Premere delicatamente il potenziale d&#39;azione monofasico elettrodo contro epicardio ventricolare. Monitorare il segnale per ottenere adeguate misure di potenziale d&#39;azione. Artefatto lieve movimento del segnale è normale. </li><li> Posizionare un elettrodo bipolare stimolo sulla atrio destro a passeggiare per il cuore. Nel nostro protocollo, cuori erano in ritmo la durata del ciclo tra i 300 e 150 msec, corrispondenti a 200 e 400 bpm, rispettivamente. </li><li> Misurare la temperatura della superficie epicardica LV. Se lo studio richiede che la temperatura è mantenuta a 37 ° C poi posizionare il cuore all&#39;interno di una camicia d&#39;acqua della camera cardiaca o immergere il cuore in un bagno superfusate riscaldata per mantenere una temperatura costante in tutto il cuore. </li><li> Posizionare la fotocamera CCD (Andor ixon DV860, 128x128 pixel) e la messa a fuoco in modo tale che un campo appropriato di vista si osserva. La fotocamera è collegata a una workstation e le immagini vengono acquisite a 2 fps utilizzando Andor SOLIS softwari. </li><li> Accendere la luce lampada a mercurio prima dell&#39;inizio di imaging. La luce è diretta attraverso un filtro di eccitazione (350 ± 25 nm, la tecnologia Chroma) e in un breve fibre ottiche (Horiba Jobin Yvon modello 1950-1M) per illuminare la superficie del cuore. L&#39;attenuazione della luce UV attraverso la guida di luce è piccola. Illuminazione UV potrebbero essere forniti anche con un sistema ad alta potenza LED costituito da faretti LED (Mightex PLS-0365-030-S) e un&#39;unità di controllo (Mightex SLC-SA04-US). </li><li> Spegnere la luce della stanza e ridurre al minimo l&#39;illuminazione ambiente. Puntare le boccole della guida di luce (o faretti LED) al centro per rendere uniforme l&#39;illuminazione epicardico. Emissione NADH fluorescenza (fNADH) passa attraverso un filtro per le emissioni (460 ± 20 nm tecnologia Chroma) e viene ripreso dalla telecamera CCD. </li><li> FNADH monitorare i cambiamenti nel tempo, selezionando una regione di interesse utilizzando il software di imaging. Selezionare live-modalità di aggiornamento per monitorare l&#39;intensità media dei pixel all&#39;interno della regione of interesse. </li><li> Il cuore dovrebbe funzionare in modalità biventricolare lavorando per generare pressioni adeguate. livelli fNADH deve essere bassa e stabile sulla superficie epicardica per confermare adeguata perfusione coronarica. A questo punto in studio uno specifico protocollo sperimentale dovrebbe essere attuata per verificare una ipotesi. </li><li> Quando lo studio è completato, togliere il cuore dal sistema e far defluire tutto perfusato. Sciacquare il tubo del sistema e le camere con acqua purificata. Per la manutenzione ordinaria, il sistema deve essere periodicamente risciacquato con una soluzione diluita Mucasol o una soluzione di acqua ossigenata, come necessario. </li></ol> 5. Off-line Elaborazione delle immagini fNADH <ol><li> Un modo per confrontare dataset NADH (fNADH (i, j, t)) tra esperimenti è normalizzare ogni immagine di fluorescenza usando un&#39;immagine di riferimento (fNADH (i, j, t 0)) dal set di dati 9, come mostrato nella seguente equazione . Un altro modo per normalizzare NADH fluorescenza è plasso un piccolo pezzo di vetro uranile nel campo visivo prima dell&#39;esperimento 9, 18, ​​19. Vetro uranile volontà fluorescenza (450 - 550 nm) quando illuminate con luce UV per fornire un segnale che può essere usato come un riferimento stabile. </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6. Risultati rappresentativi Viste anteriore e basale di una preparazione biventricolare coniglio lavoro cardiaco sono illustrati nella Figura 1. Pressione ventricolare sinistra è stata misurata mediante la navigazione di un catetere trasduttore di pressione (Millar SPR-407) oltre la valvola aortica e nel ventricolo sinistro. Pressioni ventricolari aortica, l&#39;arteria polmonare, ea sinistra (LVP) sono mostrati in figura 1C. Diastolica LVP è solitamente tra 0 e 10 mmHg. La pressione minima aortica diastolica è di circa 60 mmHg. Picco sistolico LVP dipende dalla pressione di riempimento (il precarico o la pressione LA) e della contrattilitàe, in modo ottimale, dovrebbe essere tra 80 e 100 mmHg. La pressione aortica massima e LVP dovrebbe strettamente corrispondere, come mostrato nella figura 1C. Potenziali d&#39;azione monofasici (MAP) con una fase di depolarizzazione veloce e una fase di ripolarizzazione, che sono tipici cuore di coniglio sono mostrati nella figura 1D. MAP può essere registrato con relativa facilità da un cuore appaltante ma avrà solitamente artefatto piccolo movimento durante la diastole, come mostrato nella figura 1D. MAP sono utili per verificare il successo trascinamento del cuore (cattura) durante la stimolazione e può anche essere usato per misurare variazioni locali elettrofisiologiche dovute a ischemia o altre perturbazioni acute. Un ECG può anche essere misurata immergendo il cuore in un bagno di superfusate caldo e ponendo un elettrodo in bagno sui lati sinistro e destro del cuore. Un terzo elettrodo indifferente o è posto nel bagno, lontano dal cuore, o è collegato al aorta.Un ECG fornirà informazioni riguardanti il ​​processo di eccitazione globale e ripolarizzazione, che è utile per la valutazione globale funzioni elettriche e per rivelare la presenza di ischemia. fNADH immagini rivela cambiamenti nello stato redox mitocondriale del cuore, che possono essere utilizzati per misurare la progressione spazio-temporale di regioni ischemiche o ipossia. Per questo studio, epicardico fNADH è stata misurata per monitorare i cambiamenti nello stato redox nel corso di tre frequenze di stimolazione alla durata del ciclo (CLS) di 300, 200 e 150 msec. Valori medi fNADH provenienti da una regione di interesse (scatola rossa, figura 2) mostrano che i livelli basali fNADH aumentare la durata del ciclo si accorcia. Quando frequenza di stimolazione è vicino a ritmo sinusale (CL = 300 msec) fNADH livello basale è relativamente costante. Poiché la durata del ciclo si accorcia inferiore a 300 msec, di base fNADH aumentare i livelli, con il maggiore incremento alla minima CL (150 msec). FNADH immagini ad alta risoluzione di tutta la superficie anteriorea 200 e 400 bpm è mostrato in Figura 3. livelli fNADH a 200 bpm erano costanti e spazialmente omogenei. A 400 bpm, i livelli di fNADH aumentato notevolmente in tutta l&#39;epicardio. Significativa eterogeneità spaziale è stata osservata con gli incrementi maggiori si verificano nelle regioni del setto della RV e LV. Il segnale fNADH oscilla con contrazione (artefatti movimento) e la frequenza di oscillazione corrisponde alla frequenza cardiaca (Figura 2). In incannulamento biventricolare, la base del cuore è tenuto da 4 cannule, che aiuta a prevenire il cuore di oscillazione durante la contrazione. Pertanto, ampiezza di oscillazione è sempre inferiore rispetto a qualsiasi arco temporale più lungo (5-10 sec) tendenze fNADH che sono causate da ischemia o ipossia. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> Figura 1. Pressioni tipiche e potenzialità di azione monofasici da un isolato di lavoro biventricolare rabbit cuore. A. vista basale del cuore che mostra i quattro cannule: 1, aortica, 2, arteria polmonare, 3, atriale sinistra, e 4, atriale destra vista anteriore, B. del cuore che mostra il ventricolo sinistro (LV) e il ventricolo destro. (RV). C. rappresentativi pressioni. Top: pressione ventricolare sinistra (linea continua) e la pressione aortica (linea tratteggiata). In basso: la pressione polmonare. D. potenziali d&#39;azione monofasici rappresentativi. Il segnale è allineato con le pressioni indicate nel pannello di C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> Figura 2. fNADH immagini di un biventricolare lavoro cuore di coniglio isolato. Top: Una vignetta del campo di vista (a sinistra) e tre immagini fNADH vengono visualizzati. Il corrispondente lunghezza del ciclo di stimolazione (CL) è indicata su ogni immagine.La regione di interesse per il segnale fNADH nel pannello inferiore è indicato dal riquadro rosso. La punta dell&#39;elettrodo monofasica potenziale di azione si vede a destra della regione di interesse. Il epicardio era illuminata con la lampada a mercurio e guida di luce, come mostrato nella Figura 5. Solo la superficie epicardica circonda la regione di interesse è stata illuminata basso:. FNADH medio per la regione di interesse indicato dal riquadro rosso nel pannello superiore. Aumenti medi fNADH con la lunghezza di ciclo ridotti. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> Figura 3. fNADH immagini di tutta la superficie anteriore di un isolato di lavoro biventricolare cuore di coniglio. Il cuore è stato stimolato dalla RA a 200 bpm e 400 bpm. fNADH è stato ripreso (2 fps, 128x128 pixel con una risoluzione di 0,4 mm), mentre illumina l&#39;intera epicardio anteriore con due LED ad alta potenza (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il cuore isolato Langendorff perfuso rimane uno strumento importante per studiare la fisiologia cardiaca 2. È particolarmente utili negli studi di aritmie cardiache, in particolare quelle che utilizzano immagini di fluorescenza potenziale transmembrana 20. Un vantaggio è che l&#39;intero epicardio del cuore isolato può essere osservato 21, 22. Un altro vantaggio è che, in contrasto con sangue, perfusione con una soluzione limpida tampone cristalloide non interferisce con i segnali di fluorescenza. Una limitazione è che la tecnica Langendorff non è adatto per studi di metabolismo cardiaco, che spesso richiedono il cuore per eseguire lavori nel contesto di precarico fisiologica e pressioni citotossici. Per elevare la rilevanza dei preparativi cuore isolato per studi metabolici, Neely ha introdotto modifiche alla tecnica Langendorff per stabilire appropriate del ventricolo sinistro (LV) precarico e le pressioni citotossici 3.Il modello è noto come isolato cuore modello LV lavoro ed è stato ampiamente utilizzato per studiare le prestazioni LV e metabolismo 4-6. Il cuore del modello LV di lavoro è superiore al modello Langendorff per le valutazioni funzionali, ma non fornisce un ventricolo caricata correttamente destro (RV). Demmy et al. prima riportato un modello biventricolare (LV e RV) come una modifica del modello LV cuore di lavoro 7, 8. Essi hanno scoperto che lo sviluppo della gittata sistolica, la gittata cardiaca e la pressione migliorato nei cuori convertiti dalla modalità di lavoro LV a biventricolare modalità di lavoro 8. A RV caricata correttamente inoltre migliora la funzione del setto diminuendo gradienti di pressione anomale attraverso il setto. Biventricolare cuori di lavoro hanno dimostrato di mantenere la produzione aortico, flusso polmonare, la pressione aortica, pressione media polmonare, la frequenza cardiaca e infarto del miocardio ATP, ei livelli di creatina fosfato per un massimo di 3 ore 8. Biventricolare studi cardiaci di lavoro in genere utilizzano i cuori from piccoli animali quali ratti e conigli, perché la gittata cardiaca e il volume richiesto di perfusato sono molto inferiore a quella dei cuori degli animali più grandi. Tuttavia, biventricolare studi cardiaci di lavoro sono stati eseguiti utilizzando i cuori di suini, canini, e anche esseri umani 23, 24. Il fabbisogno metabolico dei cuori isolati in modo lavorazione biventricolare è notevolmente superiore a quello di perfusione Langendorff. E &#39;importante che la soluzione perfusato fornire abbastanza ossigeno e substrati metabolici per supportare la funzione cardiaca biventricolare. Soluzioni tampone standard cristalloidi, come Krebs-Henseleit 16, 17, 25 o Tyrodes 26, 27, hanno solubilità ossigeno alto come 5,6 mg / L. Quando queste soluzioni sono gasati con CarboGen (una miscela di gas del 95% O 2 e il 5% CO 2) e contiene gli opportuni substrato metabolico (glucosio, destrosio e / o di piruvato di sodio), che siano adatti biventricolare cuori di lavoro batte a normaAl tasso del seno (circa 180 bpm per un coniglio). Aumenta la richiesta metabolica di ritmi veloci e la quantità di ossigeno disciolto in perfusates standard potrebbe non essere sufficiente per supportare pienamente un cuore biventricolare di lavoro che si sta contraendo a tassi elevati. Soluzioni tampone cristalloidi contenenti eritrociti o miste con sangue intero sono stati usati in preparati cardiaci di lavoro per assicurare un&#39;adeguata disponibilità di ossigeno. Studi precedenti hanno dimostrato che l&#39;aggiunta di eritrociti a una soluzione di Krebs-Henseleit un miglioramento della funzione cardiaca di lavoro durante rigorosi protocolli di stimolazione e anche ridotto l&#39;incidenza di fibrillazione ventricolare 16. Una limitazione di utilizzare eritrociti o miscele di sangue intero è che l&#39;emoglobina interferisce con lunghezze d&#39;onda che vengono utilizzati per l&#39;imaging fluorescenza 13. Altri substrati, come albumina, possono anche essere aggiunti perfusato soluzioni per prolungare vitalità cuore e ridurre l&#39;edema 28. Durante l&#39;imaging di fluorescenza l&#39;intensità della luce di eccitazione deve essere elevata e la distribuzione della luce dovrebbe essere uniforme. Realizzare un&#39;illuminazione uniforme non è sempre facile a causa della curvatura della superficie epicardica. Nei nostri studi abbiamo fNADH immagine filtrando la luce (350 ± 25 nm) da una lampada al mercurio. Una biforcato guida ottica viene usato per dirigere la luce UV sulla superficie epicardica. Illuminazione uniforme può essere ottenuto il corretto posizionamento delle due ghiere di uscita. UV sorgenti LED potrebbero anche essere utilizzati, come abbiamo dimostrato nella Figura 3. Sorgenti LED sono relativamente poco costoso in modo più fonti potrebbero essere inserite in un sistema di imaging. I LED possono anche essere attivata e disattivata a tassi elevati di sincronizzare la luce di eccitazione, con acquisizione delle immagini. Photobleaching di NADH deve essere minimizzata 29 riducendo il tempo di illuminazione tessuto. Ciò può essere fatto bicicletta l&#39;illuminazione e spegnimento con un elettroneic otturatore e una lampada o con un sistema di illuminazione a LED ed un controllore. Se l&#39;illuminazione è sincronizzato con il ciclo cardiaco, quindi l&#39;acquisizione di immagini fNADH potrebbe essere limitato diastole, che ridurrebbe manufatto movimento nei segnali di fluorescenza. Trigging illuminazione e l&#39;acquisizione di immagini utilizzando un segnale di pressione, come la pressione LV, sarebbe un modo per fare questo. Nei nostri studi abbiamo osservato che le variazioni fNADH per unità di tempo può essere più di 5 volte superiore a 400 bpm rispetto a 200 bpm. Questo indica che ritmi veloci elevare lo stato redox del cuore. Sia o no questo è causato da ipossia o l&#39;incapacità dei miociti per ossidare NADH a NAD + con sufficiente rapidità per evitare l&#39;accumulo di NADH è ancora una domanda senza risposta. Le prestazioni di un preparato biventricolare cuore di lavoro è condizionato da molti fattori. Uno dei più importanti è quello di impostare adeguate pressioni di precarico e postcarico per imitare il fisiologicocondizioni che sono sotto inchiesta. In particolare, il postcarico LV (pressione aortica) deve essere regolato per rappresentare la pressione sistemica. Se è troppo elevato, il LV non sarà in grado di superare la pressione, con conseguente rigurgito. Pressione troppo bassa avrà effetti negativi sulla perfusione coronarica. La pressione di precarico LV (la pressione atriale sinistra) dovrebbe anche essere regolato per fornire un volume telediastolica che è appropriato per il protocollo sperimentale. fNADH imaging di tessuto vivente è una modalità consolidata di imaging di fluorescenza 13. La sua applicazione al tessuto cardiaco è stato illustrato da Barlow e Chance, quando hanno segnalato aumenti notevoli di fNADH all&#39;interno del tessuto regionale, dopo la legatura ischemico e 14 di un vaso coronarico. Le loro immagini fNADH sono state registrate su pellicola utilizzando una macchina fotografica oscilloscopio Fairchild e flash UV. Coremans et al. estesa, questo concetto utilizzando la fluorescenza / UV quoziente di riflettenze NADH a misurazionee lo stato metabolico del epicardio di Langendorff sangue perfusi cuori di ratto 30. A videofluorimeter è stato utilizzato per l&#39;imaging e dati è stato registrato utilizzando un registratore video. Più tardi, Scholz et al. utilizzato un array di fotodiodi spettrografo e misurare fNADH media da una vasta area del LV. Questo approccio riduce gli effetti di fluorescenza epicardici eterogeneità e le variazioni locali in circolazione mentre rivelare macroscopici legati al lavoro variazioni di fNADH 31. Questo approccio è simile a livelli medi fNADH calcolo per una regione di interesse in tutti i fotogrammi di un set di dati fNADH immagini, come illustrato in figura 2. Come abbiamo presentato in questo articolo, la tecnologia di oggi offre ad alta velocità telecamere CCD e controllo digitale ad alta potenza faretti UV. Queste tecnologie consentono le dinamiche spazio-temporali di fNADH cardiaca e il metabolismo di essere studiato da molte nuove prospettive. Il relativamente basso costo delle ottiche e delle sorgenti luminose rende fNADH immagine di un accessorio utile per sistemi convenzionali cardiaci mappatura ottici. 9, 32

<table border="1"><tbody><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S-233 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> 423-316 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 158968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td> Albumina </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

nadh imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro hearts coniglio

NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Fin dalla sua nascita da Langendorff 1, il cuore isolato perfuso rimane uno strumento importante per studiare la fisiologia cardiaca 2. Tuttavia, non è adatto per studi di metabolismo cardiaco, che richiedono il cuore per eseguire lavori nel contesto di precarico fisiologica e pressioni citotossici. Neely modifiche introdotte alla tecnica Langendorff a stabilire appropriate del ventricolo sinistro (LV) precarico e le pressioni citotossici 3. Il modello è noto come isolato cuore modello LV lavoro ed è stato ampiamente utilizzato per studiare le prestazioni LV e metabolismo 4-6. Questo modello, tuttavia, non fornisce un ventricolo caricata correttamente destro (RV). Demmy et al. prima riportato un modello biventricolare come una modifica del modello LV cuore di lavoro 7, 8. Essi hanno scoperto che lo sviluppo della gittata sistolica, la gittata cardiaca e la pressione migliorato nei cuori convertiti dalla modalità di lavoro LV a biventricolare modalità di lavoro 8 </sup&gt;. A RV caricata correttamente diminuisce anche gradienti di pressione anomali attraverso il setto per migliorare la funzione del setto. Biventricolare cuori di lavoro hanno dimostrato di mantenere la produzione aortico, flusso polmonare, la pressione aortica, frequenza cardiaca e del miocardio livelli di ATP per un massimo di 3 ore 8. Studiando gli effetti metabolici di lesione del miocardio, quali ischemia, è spesso necessario per identificare la posizione del tessuto colpito. Ciò può essere fatto di imaging la fluorescenza del NADH (forma ridotta di nicotinammide adenina dinucleotide) 9-11, un coenzima trova in grandi quantità nei mitocondri. NADH fluorescenza (fNADH) che presenta un rapporto vicino lineare inversa con 12 locali concentrazione di ossigeno e fornisce una misura dello stato redox mitocondriale di 13. Imaging fNADH durante condizioni di ipossia e ischemica è stato usato come colorante libero metodo per identificare regioni ipossiche 14, 15 e per monitorare la progressione dicondizioni di ipossia nel tempo 10. L&#39;obiettivo del metodo è di monitorare lo stato redox mitocondriale di biventricolare cuori di lavoro durante protocolli che alterano il metabolismo miociti o indurre ipossia o creare una combinazione dei due. Cuori da conigli bianchi New Zealand stati collegati ad un sistema biventricolare cuore di lavoro (Hugo Sachs Elektronik) e perfusi con modificato Krebs-Henseleit soluzione 16 a 37 ° C. Aortica, LV, arteria polmonare, e la pressione atriale destra e sinistra sono stati registrati. L&#39;attività elettrica è stata misurata usando un elettrodo monofasica potenziale d&#39;azione. Per immagine fNADH, la luce da una lampada a mercurio è stato filtrato (350 ± 25 nm) e utilizzato per illuminare il epicardio. Luce emessa è stata filtrata (460 ± 20 nm) e ripreso con una telecamera CCD. Cambiamenti nella fNADH epicardica biventricolare cuori di lavoro durante frequenze di stimolazione differenti sono presentati. La combinazione del modello cuore e fNADH immaginifornisce un nuovo strumento prezioso e sperimentale per lo studio delle patologie cardiache acute nel contesto di realistici condizioni fisiologiche.

L&#39;obiettivo è quello di monitorare lo stato redox mitocondriale di cuori isolati nel contesto del precarico e le pressioni fisiologica postcarico. Un modello di lavoro biventricolare cuore di coniglio viene presentato. Fluorescenza ad alta risoluzione spaziotemporale immagini di NADH viene utilizzato per monitorare lo stato mitocondriale redox del tessuto epicardico.

NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

Dalla sua ideazione da parte di Langendorff1, il cuore isolato e profuso rimane uno strumento fondamentale per lo studio della fisiologia cardiaca2. Tuttavia, esso non è particolarmente adatto...

L'obiettivo generale di questa procedura è lo studio del metabolismo. Utilizzando l'imaging del NADH in una preparazione di cuore funzionante, ciò si ottiene isolando innanzitutto il cuore di coniglio. Il secondo passaggio della procedura consiste nel cannullare con successo tutte e quattro le camere cardiache per ottenere un modello di cuore funzionante.L'ultimo passaggio consiste nell'impostare l'apparecchiatura per l'acquisizione delle immagini e nel raccogliere dati relativi all'NADH a diverse frequenze di stimolazione. In definitiva, i risultati possono mostrare le variazioni metaboliche del cuore mediante l'immagine dell'NADH fluorescente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la perfusione retrograda di Langendorff, è che il cuore opera nel suo stato fisiologico, con flusso nella direzione normale e con il cuore stesso che genera la pressione necessaria per la perfusione coronarica.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in elettrofisiologia e nei meccanismi delle aritmie letali. Ciò avviene fornendo un modello fisiologico per studiare il legame tra il flusso coronarico, il metabolismo e l'attività elettrica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di canulazione dei vasi e delle camere cardiache sono difficili da apprendere.Una tecnica inadeguata può danneggiare il cuore e compromettere il resto dell'esperimento. Prima di eseguire un esperimento, risciacquare tutti i tubi nelle camere del sistema cardiaco con acqua purificata, quindi rimuovere l'acqua dal sistema azionando le pompe. Aggiungere filtri a membrana di cellulosa in linea con la pompa di perfusione LOR, la pompa di perfusione del cuore sinistro e la pompa di perfusione del cuore destro.Dopo aver aggiunto il PERFUSE eight al sistema, eseguire una calibrazione a due punti per ogni sensore di pressione. Accendere il bagno d'acqua riscaldato a circolazione che riscalda i tubi rivestiti d'acqua e gli scambiatori di calore. Accendere il bagno d'acqua utilizzato per riscaldare il PERFUSE eight.Accendere le pompe che fanno circolare il PERFUSE eight in un circuito chiuso; accendere il serbatoio di circolazione per ossigenare il Perfuse. Eight, assicurarsi che l'ossigenatore in microfibra o i filtri ematici forniscano il 95% di ossigeno al perfuso eight a 80 chilopascal. Infine, verificare che gli scambiatori di calore mantengano la temperatura del perfuso in circolazione.A 37 gradi Celsius, iniziare l'escissione cardiaca impostando prima il sistema cardiaco in funzione in pressione costante. Modalità LRF. Impostare la pressione del blocco aortico tra 50 e 60 dopo aver sedato un coniglio.Iniettare pentobarbital e eparina nella vena marginale dell'orecchio o nella vena safena laterale sulla parte interna dell'arto posteriore. Una volta che il coniglio ha perso il riflesso del dolore, aprire rapidamente la cavità toracica. Tagliare il pericardio, clampare l'aorta ed escindere il cuore e i polmoni.I polmoni vengono mantenuti attaccati per facilitare l'isolamento delle vene polmonari. Successivamente, riempire una siringa con 60 millilitri per F otto e 200 unità di eparina. Applicare una cannula da cinque millimetri ed eseguire la cannullazione dell'aorta.Fissare l'aorta alla cannula con suture di seta di calibro zero. Quindi premere lentamente la siringa per espellere il sangue attraverso il cuore. Configurare il sistema del cuore funzionante collegando innanzitutto il cuore al blocco aortico.Avvicinarsi al connettore con un angolo obliquo e permettere al Perfuse eight di gocciolare delicatamente dal connettore nella cannula mentre è collegato. Questo impedisce all'aria di entrare nell'aorta, prevenendo così emboli coronarici durante la perfusione del cuore a pressione costante. Modalità L endorf.Rimuovere il tessuto adiposo e il tessuto connettivo e individuare i seguenti vasi. Vena cava inferiore e superiore, vena aortica, arteria polmonare e vene polmonari. Successivamente, legare la vena cava superiore.Tagliare l'arteria polmonare appena al di sotto del punto in cui si divide nelle arterie polmonari destra e sinistra. I vasi rimanenti sono le vene polmonari. Riunirle tra il cuore e i polmoni e legarle tutte insieme con un solo punto di sutura.Questo è fondamentale per due ragioni. Primo, legare i vasi collegati ai polmoni garantirà l'assenza di perdite una volta completata la cannullazione. E secondo, è importante isolare entrambe le vene cave per la successiva cannullazione.Ora rimuovere i polmoni. Praticare un foro di dimensioni appropriate nell'angolo del padiglione atriale sinistro e assicurarsi che sia riempito con abbondante eight. Successivamente, cannuccolare il padiglione mentre la cannula è completamente riempita con eight perfusione.Quindi, tenendo ferma la tessuto, suturare la cannula all'appendice. Il tessuto dell'appendice auricolare sinistra è estremamente delicato e può strapparsi facilmente. È quindi fondamentale cannulare l'atrio sinistro al primo tentativo, altrimenti potrebbe non essere più possibile.Accendere la pompa numero due per fornire flusso all'atrio sinistro. Impostare il pre-carico tra due e sei tor per tutta la durata dell'esperimento. Potrebbe essere necessario regolare la pressione.Mantenetelo entro due millimetri della pressione obiettivo. Ora passate al cuore in modalità lavoro spegnendo temporaneamente la pompa numero uno, la pompa langor. Riducete la pressione aortica a tend tor e quindi aumentatela lentamente fino a raggiungere un valore compreso tra 80 e 100 tor.Questo consente alla valvola aortica di aprirsi e funzionare come farebbe in normali condizioni fisiologiche. Impostare la pressione finale post-carico su un valore che sia approssimativamente 20. Tore inferiore alla pressione massima del ventricolo sinistro utilizzando una cannula direttamente collegata al sistema.Canulare l'atrio destro attraverso la vena cava inferiore e fissare la cannula alla vena con punti di sutura. Evitare l'introduzione di bolle d'aria. Accendere la pompa numero tre, la pompa del lato destro, per garantire il flusso all'atrio destro.Impostare la pressione a circa tre tor. Infine, cannuccolare il ventricolo destro senza permettere l'ingresso di aria e suturare la cannula all'arteria polmonare ery. Questo completa la cannuccolazione biventricolare.Ora procedere all'acquisizione del segnale. Inserire con attenzione il catetere del trasduttore di pressione nell'aorta attraverso la cannula aortica. Farlo avanzare delicatamente oltre la valvola aortica e all'interno del ventricolo sinistro.Il segnale della pressione del VD apparirà come previsto quando la punta del catetere è posizionata correttamente. Successivamente, premere delicatamente l'elettrodo del potenziale d'azione monofasico contro l'epicardio ventricolare. È normale la presenza di un lieve artefatto di movimento nel segnale dell'elettrodo.Successivamente, posizionare un elettrodo bipolare di stimolazione nell'atrio destro per stimolare il cuore secondo la posizione prevista dal disegno sperimentale. E focalizzare la telecamera CCD sulla regione di interesse del cuore. Alla telecamera dovrebbe essere applicato un filtro di emissione.Per rilevare la fluorescenza del NADH, spegnere le luci ambientali per illuminare in modo uniforme l'epicardio con una sorgente di luce UV presso la postazione di lavoro, alla quale è collegata la telecamera. Impostare il software per acquisire immagini a due fotogrammi al secondo. Quindi selezionare la modalità di aggiornamento in tempo reale per monitorare l'intensità media dei pixel all'interno della regione di interesse.Se la perfusione è stata adeguata, i livelli di NADH, rappresentati dalla fluorescenza, dovrebbero essere bassi e stabili sulla superficie epicardica. Ora, eseguire l'esperimento quando è completato. Rimuovere il cuore.Svuotare il PERFUSE otto e i tubi e le camere del sistema con acqua purificata. Sciacquare periodicamente il sistema con soluzione TM mucosale o con una soluzione di perossido di idrogeno diluita seguendo il protocollo descritto. I cuori sono stati stimolati a cicli compresi tra 200 e 400 battiti al minuto.La pressione ventricolare sinistra (LVP) diastolica era solitamente compresa tra zero e 10 tor; la pressione aortica diastolica minima era di circa 60 tor. La pressione ventricolare sinistra sistolica di picco dipende dalla pressione di riempimento e dalla contrattilità ed è ottimale quando compresa tra 60 e 80 tor; la pressione aortica massima e la pressione ventricolare sinistra massima dovrebbero corrispondere strettamente. I potenziali d'azione monofasici tipici del cuore di coniglio presentano una fase di depolarizzazione rapida e una fase di ripolarizzazione caratteristica. I potenziali d'azione sono stati registrati con facilità dai preparati, ma di solito presentavano un piccolo artefatto da movimento durante la diastole.Sono stati misurati i valori medi della fluorescenza di NADH in una regione di interesse all'interno del riquadro rosso per monitorare i cambiamenti dello stato redox mitocondriale durante tre cicli di stimolazione con lunghezze di stimolo di 300, 200 e 150 millisecondi, quando la frequenza di stimolazione era vicina al ritmo sinusale. Il livello basale di NADH è rimasto relativamente costante mentre la lunghezza del ciclo veniva accorciata. Sotto i 300 millisecondi, i livelli basali di NADH sono aumentati, con l'aumento maggiore osservato a 150 millisecondi; il segnale oscilla in concomitanza con la contrazione e la frequenza delle oscillazioni corrisponde alla frequenza cardiaca.L'ampiezza di queste oscillazioni è stata sempre inferiore rispetto alle tendenze su scale temporali più lunghe causate da ischemia o ipossia. L'imaging fluorescente ad alta risoluzione del NADH sulla superficie anteriore completa a 200 battiti al minuto è risultato costante e omogeneo dal punto di vista spaziale a 400 battiti al minuto. I livelli di NADH sono aumentati notevolmente in tutta l'epicardio.È stata osservata una notevole eterogeneità spaziale, con gli aumenti maggiori che si verificano nelle regioni settali del VD e del VS Una volta padroneggiata. Questa tecnica può essere eseguita in meno di 45 minuti se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di impedire l'ingresso di bolle d'aria nell'aorta o nell'atrio sinistro Dopo questa procedura.Metodi aggiuntivi, come il caricamento del cuore con un colorante sensibile al voltaggio, possono essere utilizzati per rispondere ad altre domande, ad esempio collegando l'attività elettrica e metabolica sulla superficie del cuore durante scenari patologici come l'ischemia locale dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in fisiologia cardiaca per studiare il metabolismo cardiaco e le alterazioni della conduzione durante condizioni patologiche, utilizzando un modello più fisiologicamente rilevante.

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Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

I modelli di cuore funzionante isolati possono essere utilizzati per misurare l'effetto delle condizioni di carico, della frequenza cardiaca e dei farmaci sulle prestazioni del miocardio e sul consumo di ossigeno. Descriviamo i metodi per la preparazione di un modello di lavoro del cuore sinistro di un roditore che consente lo studio delle prestazioni sistoliche e diastoliche e del consumo di ossigeno in varie condizioni.

Roditore Working Model Cuore per lo Studio della performance miocardica e consumo di ossigeno

Nel cuore, eventi molecolari coordinare le funzioni elettriche e contrattili dell'organo. Un insieme di campo fluorescenza tecniche di microscopia locali qui presentati consente la registrazione di variabili cellulari nei cuori intatti. Identificare i meccanismi che definiscono la funzione cardiaca è fondamentale per capire come funziona il cuore in situazioni patologiche.

Campo locale microscopia a fluorescenza: Imaging segnali cellulari nei cuori Intact

Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii murini che utilizza un sistema di mappatura ottico con un'alta risoluzione temporale e spaziale, tra cui registrazioni duale della tensione della membrana e Ca2 + transitoria sotto programmato stimolazione tramite un catetere elettrodo specializzato.

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Nuove strategie terapeutiche nella medicina rigenerativa cardiaca richiedono studi estesi e dettagliati nei modelli animali preclinici grande prima che essi possono essere considerati per uso in esseri umani. Qui, dimostriamo una tecnica di iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto in conigli, che è importante per l'efficacia di tali terapie innovarici di verifica delle ipotesi.

L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande

Qui introduciamo un metodo per utilizzare un catetere ottico intra-ventrico nei cuori perfusi per eseguire la spettroscopia di assorbimento attraverso la parete cardiaca. I dati ottenuti forniscono informazioni solide sulla tensione dell'ossigeno tissutale, nonché sull'utilizzo del substrato e sul potenziale della membrana contemporaneamente con misure di prestazione cardiaca in questa onnipresente preparazione.

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Presentiamo la metodologia per l'isolamento dei miociti murini e come ottenere tracce di tensione o calcio contemporaneamente con tracce di accorciamento sarcomero utilizzando la fotometria a fluorescenza con misurazioni simultanee della geometria cellulare digitale.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

L'obiettivo di questo studio era quello di stabilire un metodo per studiare le dinamiche cardiache utilizzando un modello animale traslazionale. L'approccio sperimentale descritto incorpora l'optocardiografia a doppia emissione in combinazione con uno studio elettrofisiologico per valutare l'attività elettrica in un modello cardiaco porcina isolato e intatto.

Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi

Il presente studio dimostra un modello animale altamente riproducibile di ischemia miocardica regionale acuta e danno da riperfusione nei conigli utilizzando una mini-toracotomia sinistra per i casi di sopravvivenza o una sternotomia della linea mediana per i casi di non sopravvivenza.

Modello di danno da ischemia e riperfusione nei conigli

Impara l'imaging di NADH a fluorescenza in cuori biventricolari isolati di coniglio per studiare il metabolismo cardiaco. Questo metodo permette di monitorare lo stato redox mitocondriale in condizioni fisiologiche.

NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

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