Nanotopology dell'adesione cellulare su angolo di inclinazione variabile Microscopia Total Internal Reflection Fluorescence (VA-TIRFM)

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare una topologia di adesione cellulare su un substrato con precisione nanometrica. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule su vetrini trasparenti e incubandole con un pennarello fluorescente. Quindi la posizione angolare dello specchio orientabile del microscopio viene calibrata e la posizione viene memorizzata nel programma di posizionamento dello specchio.

Il passo successivo è quello di registrare le immagini di fluorescenza al momento dell'irradiazione a circa 10 angoli diversi. Il passo finale consiste nel calcolare le distanze del substrato cellulare con una precisione di pochi nanometri. In definitiva, i risultati della topologia dell'adesione cellulare sul substrato vengono utilizzati per mostrare le differenze di adesione tra varie linee cellulari, ad esempio cellule tumorali e cellule meno maligne.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale, è che la risoluzione effettiva è nell'ordine di pochi nanometri. Anche se questo metodo può fornire informazioni sulle membrane cellulari. Può essere applicato anche ad altri sistemi come piccole vescicole o nanomateriali.

A dimostrare l'esperimento saranno la nostra postdoc Petra, che preparerà i campioni di cellule e il nostro ingegnere, Michael Wagner, che eseguirà l'esperimento per preparare le celle ad angolo variabile, riflessione interna totale. La microscopia a fluorescenza semina singole cellule a una densità di 100 cellule per millimetro quadrato su un vetrino in terreno di coltura integrato con il 10% di vitello fetale, siero e antibiotici. Coltiva le cellule per 72 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Successivamente, applicare sulle cellule la membrana fluorescente, il marcatore sei D, il decano due, il dimetilamminonaftalene o il lorano a una concentrazione di otto micromolari in coltura, incubare in terreno per 60 minuti prima della microscopia a fluorescenza. Lavare le cellule con la pipetta PBS e la soluzione tampone sul vetrino per rimuovere il terreno, quindi rimuovere la soluzione tampone dal retro del vetrino. Per l'angolo variabile viene utilizzato un microscopio verticale come un piano Zeiss Axio, dotato di una fotocamera retroilluminata e/o esone E-M-C-C-D.

T-I-R-F-M sostituisce il suo condensatore con un dispositivo di illuminazione su misura con un prisma cilindrico in vetro emi accoppiato otticamente alla slitta dell'oggetto. Il raggio laser è inciso da una fibra monomodale fascicolata, che dopo l'imaging da parte del prisma di vetro e di altri componenti ottici, si traduce nuovamente in un raggio parallelo sulla superficie del campione. Fare attenzione che il vettore del campo elettrico sia polarizzato, perpendicolare al piano degli incidenti.

Questa posizione è contrassegnata sull'accoppiatore di uscita della fibra. Utilizzare uno specchio regolabile situato all'interno del condensatore, che viene ripreso nel piano del campione e illumina il campione sotto un angolo variabile di incidenza o raggio dell'oggetto. Lo specchio orientabile può essere azionato da un motore passo-passo, controllato da un software.

Ogni posizione corrisponde a un angolo di incidenti ben definito, come determinato dalle misurazioni metriche effettuate. Per calibrare la posizione angolare dello specchio regolabile, utilizzare un colorante fluorescente come un nucleotide flavina millimolare, disciolto in acqua. Per visualizzare l'angolo critico al variare dell'angolo di incidenti, utilizzare l'angolo critico di 61,3 gradi per una transizione dell'acqua di vetro come valore fisso, la posizione angolare dello specchio in cui l'angolo di incidenza è uguale all'angolo critico è memorizzata nel programma di posizionamento dello specchio.

Utilizzando il software della fotocamera, impostare i parametri della fotocamera EMCC, inclusi l'aumento di temperatura, il tempo di registrazione e la velocità di spostamento. Utilizzare olio da immersione per garantire il contatto ottico del campione. Con un prisma di vetro, selezionare una lente dell'obiettivo di ingrandimento appropriato per le celle e un'apertura numerica moderata.

Per visualizzare l'oggetto nel microscopio, utilizzare un filtro passa-lungo o passa-banda appropriato per il rilevamento della fluorescenza. Registra immagini a fluorescenza di campioni identici al variare dell'angolo di illuminazione. Gli angoli degli incidenti devono essere uguali o superiori all'angolo critico.

Con l'angolo critico corrispondente a 64,5 gradi per un'interfaccia in vetro a celle, si consiglia un intervallo angolare compreso tra 66 gradi e 74 gradi con incrementi di 0,5 gradi o un grado. Per iniziare l'analisi dei dati, utilizzare il programma lab view per leggere le immagini registrate da varie angolazioni, nonché le impostazioni della fotocamera, la lunghezza d'onda di eccitazione e gli indici di rifrazione. Per il vetro, che è 1,52, e le celle, che è 1,37, le impostazioni vengono importate per una corretta valutazione dei dati.

Per ogni serie di parametri, la profondità di penetrazione e il fattore di trasmissione vengono calcolati automaticamente per il successo della procedura. È importante che le immagini siano accuratamente registrate e selezionate per l'analisi. Selezionare le immagini utilizzate per la valutazione delle distanze del substrato cellulare in base all'equazione.

Per un marcatore a membrana, possono essere escluse singole immagini all'interno di un'illuminazione omogenea, come mostrato in questo esempio. Calcola le immagini della topologia del substrato cellulare e seleziona un codice colore appropriato per la visualizzazione durante la valutazione. I profili dei singoli pixel possono essere visualizzati come illustrato in questa figura.

Questi profili possono essere utilizzati come indicatore della qualità della vestibilità. Infine, archiviare il protocollo di valutazione. Questa figura mostra le immagini di riflessione interna totale di cellule di glioblastoma U2 da 51 mg con un gene oncosoppressore TP 53 attivato.

All'incubazione con luan registrato a vari angoli di incidenza, 66 gradi corrispondenti ad una profondità di penetrazione del campo elettromagnetico evanescente di circa 140 nanometri, 69 gradi, corrispondenti ad una profondità di penetrazione di 75 nanometri e 73 gradi corrispondenti ad una profondità di penetrazione di 60 nanometri con penetrazione decrescente. La fluorescenza di profondità diminuisce di intensità e ha origine da siti più superficiali delle cellule, come i contatti focali sui bordi. Le distanze del substrato cellulare sono rappresentate nel pannello D da un codice colore che va da zero a 600 nanometri, come si vede qui.

Le distanze del substrato cellulare variano notevolmente tra pochi nanometri rappresentati dal bianco al giallo e da 250 a 300 nanometri rappresentati dal rosso scuro. Ciò indica che i contatti focali e le distanze maggiori del substrato cellulare sono nelle immediate vicinanze. Una variazione simile nelle distanze del substrato cellulare è calcolata per le cellule di glioblastoma U2 da 51 mg con un gene oncosoppressore attivato P 10.

Al contrario, le distanze del substrato cellulare sono piuttosto costanti per le cellule di controllo U2 51 mg rappresentate da gialle e per le cellule di tipo selvatico rappresentate da arancione a rosso Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della topologia del substrato cellulare per esplorare le cellule tumorali e i cambiamenti morfologici della terapia laser. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare le superfici con una risoluzione effettiva nell'ordine dei nanometri a bassa esposizione alla luce, che è ben tollerabile per gli organismi viventi.