Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di analizzare l'espressione genica utilizzando macchinari nucleari funzionali estratti dalle cellule. Ciò si ottiene con la prima raccolta nel gonfiore delle cellule hela. Successivamente, le cellule vengono allacciate mediante downing e quindi centrifugate per pellettare i nuclei nella terza fase.

I nuclei vengono estratti, concentrati e dializzati con sale al fine di ottenere macchinari di espressione genica solubili e funzionali. In definitiva, la funzionalità degli estratti nucleari può essere valutata in base alle loro attività di trascrizione e splicing valutate con un RNA polimerasi accoppiato al sistema di trascrizione e splicing. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la preparazione dell'estratto di nuclei sfusi, è che con questa tecnica è possibile utilizzare una piccola quantità di cellule per preparare l'estratto di nuclei.

Iniziare con la placcatura delle cellule hela su tre piastre da 150 millimetri con terreni DMEM integrati con FBS e antibiotici, coltivare le colture in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 fino a quando le cellule raggiungono il 90% di fluenza, a questo punto aspirare i terreni dalle colture cellulari HELOC e lavarli una volta con 13 millilitri di temperatura ambiente. PBS per piastra, quindi aspirare. Il PBS posiziona ogni piastra su un lato per alcuni secondi e aspira il resto del PBS.

Quindi, utilizzare un sollevatore di cellule per raschiare le cellule fino al bordo inferiore di ciascuna piastra, quindi tirare le celle in una provetta da 1,5 millilitri. Infine, pellettare le celle in una micro fuge per cinque minuti a cento volte G e a quattro gradi Celsius. Ora aspirare il PBS dal pellet della cella e stimare il volume della cella impaccata o PCV osservando la gradazione sul tubo.

Quindi aggiungere il doppio del volume di tampone ipotonico del PCV al pellet cellulare. Agitare delicatamente il tubo per ririmetterlo in sospensione. Le cellule pipettano delicatamente la sospensione cellulare su e giù con una pipetta da 1000 microlitri per rimuovere i cluster cellulari secondo necessità.

Quindi pellettare le celle nelle stesse condizioni di centrifugazione di prima. Dopo la centrifugazione, aspirare accuratamente lo strato tampone ipotonico. Le cellule avranno iniziato a gonfiarsi e il volume cellulare sarà aumentato a circa 750-1000 microlitri.

Aggiungere un nuovo tampone ipotonico a un volume finale di 1,5 millilitri e risospendere le cellule nel tampone. Di nuovo. Infine, incubare le cellule gonfie risospese sul ghiaccio per 10 minuti mentre le cellule si stanno raffreddando. Sciacquare un omogeneizzatore con tampone ipotonico e poi metterlo sul ghiaccio insieme alle cellule.

Quindi, utilizzando un tergicristallo delicato come una salvietta Kim, asciugare il pestello. Utilizzare un puntale per micropipette esteso da 1000 microlitri per rimuovere il tampone dai bassi. Ora usa la pipetta per trasferire le cellule gonfie raffreddate nel piumino Down.

È la parte più difficile di questa procedura per entrare in successo Controllare la lisi. Dopo ogni discesa al microscopio, muovi lentamente il pestello stretto dei bassi su e giù cinque volte per pidocchiare le cellule facendo attenzione a evitare bolle. Quindi, trasferire un Eloqua da cinque microlitri della sospensione di cellule di lys in una provetta einor e aggiungere 10 microlitri di trian blue e 15 microlitri di un XPBS.

Aggiungere la soluzione cellulare a un vetrino ed esaminare le cellule al microscopio ottico per la lisi, i nuclei delle cellule di lys appariranno blu dopo tre once. Non c'è abbastanza lisi poiché sono visibili numerose cellule viventi. Dopo cinque once, c'è abbastanza lisi.

Infine trasferire le cellule di lys nel tubo einor pre-raffreddato e far girare la sospensione cellulare per cinque minuti in una micro fuga a 1500 volte G e quattro gradi Celsius. Quindi trasferire con cura il super natin in un nuovo tubo senza rompere il pellet. Ora, stimare il volume nucleare della patch o PNV osservando la gradazione sul tubo.

Riempire un puntale per micropipette con un tampone a basso contenuto di sale a metà del PNV. Quindi inserire il puntale della micropipetta nei nuclei sul fondo della provetta eore. Spruzzare lentamente il tampone nei nuclei mescolando delicatamente.

Muovere delicatamente il tubo per assicurarsi che il pellet sia completamente risospeso. Quindi, aggiungere un tampone ad alto contenuto di sale a metà del PNV e mescolare rapidamente una volta capovolgendo il tubo. Ruotare il tubo per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Infine, fai girare i nuclei nella micro-fuga per 15 minuti a 18.000 volte G e quattro gradi Celsius. Inizia trasferendo 500 microlitri di surnatante in micro cons refrigerati. Centrifugare l'estratto nucleare ad alto contenuto di sale per 15 minuti a 14.000 volte G e quattro gradi Celsius dopo la centrifugazione, capovolgere il mini racon e metterlo in una nuova provetta EOR individuale.

Dopo aver centrifugato per due minuti a 1000 volte G e quattro gradi Celsius, l'estratto nucleare ad alto contenuto di sale sarà concentrato a circa 115 microlitri. Ora trasferisci 45 microlitri di aliquote dell'estratto nucleare ad alto contenuto di sale in mini SLI per dialisi. Assicurarsi che la parte inferiore del vetrino sia con la parte inferiore del galleggiante.

Quindi posizionare gli SLI in 500 millilitri di tampone per dialisi refrigerato. Infine, mescola le aliquote per una o due ore a quattro gradi Celsius, l'estratto nucleare apparirà torbido dopo la dialisi. Questa figura mostra dati rappresentativi che confrontano una trascrizione accoppiata di RNA polimerasi due e una reazione di taglio in un estratto nucleare su piccola scala rispetto a un estratto nucleare di massa.

Quando il costrutto A-C-M-V-D-N-A è stato incubato negli estratti di massa o su piccola scala, livelli simili del pre mRNA nascente sono stati sintetizzati entro il punto temporale di cinque minuti dopo l'aggiunta di alfa e manina per bloccare l'ulteriore trascrizione, gli intermedi di splicing e i prodotti di splicing accumulati nel tempo con cinetiche simili in entrambi i tipi di estratti. Questi risultati rappresentativi confermano che le efficienze del sistema di trascrizione e splicing accoppiato a RNA polimerasi due sono simili negli estratti nucleari di massa e su piccola scala. Per dimostrare l'utilità dell'estratto su piccola scala, sono stati preparati estratti di metodo da cellule hela trattate con l'inibitore di splicing E 7 1 0 7 o il composto di controllo negativo Platy analy F e quindi è stato eseguito un test di trascrizione e splicing accoppiato con RNA polimerasi due, come dimostrato in questa figura la trascrizione da parte della RNA polimerasi due è avvenuta in modo efficiente in estratti preparati sia dal plaid F che da E 7 1 0 7 trattati cellule.

Al contrario, lo splicing si verificava normalmente nell'estratto preparato dalle cellule trattate con F analizzato, ma era abolito nelle cellule trattate con E 7 1 0 7. Questi dati forniscono la prova del concetto per l'utilizzo di estratti nucleari su piccola scala per il trattamento speciale di cellule su piccola scala. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di cinque ore.