Name: Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Scopri come preparare estratti nucleari su piccola scala da cellule HeLa per saggi di espressione genica. Questo metodo consente di studiare trascrizione e splicing con campioni cellulari limitati.

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Siamo grati a M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng utili per le discussioni. Cellule HeLa sono stati ottenuti dal National Center cultura cellulare (Minneapolis, MN). Ringraziamo anche Eisai Co., Ltd per la fornitura di E7107 e la Nikon Imaging Center della Harvard Medical School per un aiuto con microscopia ottica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione al NIH GM043375 RR e FEG e NRSA borsa di studio per JLH.

1. Le cellule HeLa in crescita per l&#39;estrazione del nucleare <ol><li> Cellule HeLa piastre su tre piastre da 150 mm con DMEM mezzo supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina / streptomicina. Crescere in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 fino a quando le cellule sono al 90% confluenti. </li></ol> Tip-Split cellule 1:10 da un piatto confluenti e del raccolto 3 giorni dopo la divisione. Tip-Un posto aggiuntivo può essere coltivata in caso non vi sono abbastanza cellule con tre piastre (per esempio, se le cellule sono meno del 90% confluenti). 2. Preparare Chill-Solutions estratto nucleare <ol><li> Preparare le soluzioni fresche come indicato nella Tabella 2. </li><li> Aliquotare 10 ml di tampone ipotonico in una provetta da 15 ml Falcon. Aliquotare 1 ml di tampone di sale e 1 ml di Buffer Low Salt in 1,5 ml provette Eppendorf. Raffreddare i buffer sul ghiaccio. Aggiungere i volumi appropriati di PMSF e DTT per ogni buffer immediatamente prima dell&#39;uso (vedi <strong&gt; Tabella 1). </li></ol> 3. Raccolta di cellule HeLa per estrazione nucleare <ol><li> Aspirare supporti dalle cellule e le cellule lavate una volta con 13 ml di temperatura ambiente 1X PBS per piastra. </li><li> Aspirare il lavaggio PBS. </li></ol> Tip-Aspirare tanto del PBS come possibile aspirante primo, poi in piedi la piastra su un lato, attendere qualche secondo, ed aspirando il resto. <ol start="3"><li> Utilizzo di un sollevatore cella, raschiare le cellule al bordo inferiore delle piastre, e poi trasferire le cellule ad un tubo Eppendorf. Evita di fare le bolle. Le 3 piastre di cellule raschiate dovrebbe inserirsi in una provetta 1,5 ml Eppendorf. </li></ol> Tip-È facile stimare il volume di celle se una provetta Eppendorf viene utilizzato. Per la scala, usare tubi Falcon. <ol start="4"><li> Centrifugare a 4 ° C in una microcentrifuga per 5 min a 100 xg per agglomerare le cellule. </li></ol> 4. Swell cellule HeLa in tampone ipotonico </p&gt; <ol><li> Aspirare accuratamente la PBS dalla cella pellet e stimare l&#39;ematocrito (PCV), cercando in la gradazione sul tubo. Tre piastre confluenti di cellule HeLa producono circa 500 microlitri di PCV. </li><li> Aggiungi 2X il PCV di tampone ipotonico al pellet cellulare. Agitare delicatamente per risospendere le cellule. Utilizzare un Pipetman P1000 per risospendere le cellule delicatamente pipettando su e giù, se necessario. </li><li> Centrifugare a 4 ° C in una microcentrifuga per 5 min a 100 xg per agglomerare le cellule. * Le cellule hanno iniziato a gonfiarsi da questo momento, e il volume cellulare dovrebbe essere di circa 750 pl-1000 pl. </li><li> Aspirare accuratamente la Buffer ipotonica e aggiungere nuovi buffer ipotonico ad un volume finale di 1,5 ml. Risospendere le cellule. </li><li> Incubare le cellule risospese gonfi su ghiaccio per 10 min. </li></ol> 5. Lyse celle usando un omogeneizzatore Dounce <ol><li> Utilizzare tampone ipotonico per sciacquare il Dounce e poi raffreddare sul ghiaccio. Pulire a secco con un pestello WIP delicato compitoer (es Kimwipe). Rimuovere il buffer rimanente dal Dounce utilizzando una punta di 1.000 ul micropipetta estesa. </li><li> Trasferire le cellule gonfie nella Dounce. Spostare lentamente il pestello stretta del Dounce su e giù per 5 volte per lisare le cellule, facendo attenzione a evitare le bolle. </li><li> Saggio per la lisi delle cellule usando Un&#39;aliquota di 5 microlitri di cellule dalla Dounce. Posizionare l&#39;aliquota in un tubo Eppendorf e aggiungere un volume uguale di Trypan Blue. Mettere il composto su un vetrino ed esaminare le cellule con un microscopio ottico. I nuclei delle cellule lisate apparirà blu. Circa il 90% lisi è l&#39;ideale. </li></ol> Tip-Il numero di volte delle cellule deve essere dounced varierà a seconda della tenuta del Dounce. Nell&#39;effettuare tale protocollo per la prima volta, determinare il numero di volte per Dounce effettuando passo 5,3 dopo ogni corsa con la Dounce. Non esagerare con Dounce, douncing eccessiva distruggerà i nuclei. <ol start="4"><li> Trasferire le cellule lisate in un pre-chilled tubo Eppendorf e rotazione in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min a 1500 x g. Il pellet contiene i nuclei. Con attenzione trasferire il surnatante in una nuova provetta senza interrompere i nuclei. Il supernatante contiene il citoplasma. </li></ol> Tip-Il citoplasma può essere utilizzato così com&#39;è o ulteriormente lavorato per uno S100 utilizzando lo stesso ad alta velocità di centrifuga usata per gli estratti di bulk (cfr. 1 per preparare uno attivo S100 da estratti di bulk). 6. Salt-Estrarre il Nuclei <ol><li> Stimare il volume al sacco nucleare (PNV), cercando in la gradazione sul tubo. Una PCV di 500 pl produce tipicamente una PNV di 400 microlitri. </li><li> Aggiungere ½ X PNV di tampone sale insufficiente alla nuclei inserendo una punta micropipetta al fondo della provetta e lentamente spruzzando il buffer in nuclei mentre delicatamente miscelazione. Non pipettare su e giù. Delicatamente a scatti i tubi per assicurarsi che il pellet è completamente risospeso nel tampone di sale basso prima di continuare. </li> &lt;li&gt; Add ½ X PNV di tampone di sale e mescolare velocemente 1 volta invertendo il tubo. Non agitare. Ruota a 4 ° C per 30 min. </li></ol> Tip-Sii gentile con i nuclei quando sono in Buffer di sale per evitare la loro lisi. <ol start="4"><li> Spin a 4 ° C in una microcentrifuga per 15 min a 18.000 x g. Il surnatante è l&#39;estratto di sale nucleare (HS-NE). Tre lastre di cellule genere permette di ottenere 500-600 microlitri di HS-NE. </li></ol> 7. Concentrato e Dializzare l&#39;estratto nucleare <ol><li> Trasferire 500 pl del HS-NE in refrigerati mini-centricons (Amicon) e centrifuga per 50 minuti a 4 ° C in una microcentrifuga a 14000 x g. Invertire la mini-centricon (Amicon) e collocarlo in una nuova provetta Eppendorf. Spin per 2 min a 4 ° C 1000 xg per recuperare l&#39;HS-NE. La HS-NE saranno concentrate a circa 115 microlitri. </li><li> Utilizzando una Pipetman P200, trasferire 45 aliquote pl della HS-NE in mini-dialisi Slide-A-Lyzers, e metterli in 500 ml di tampone di dialisi refrigerata. Assicurarsi che il fondo della Slide-A-Lyzer è allineato con la parte inferiore del corpo galleggiante. Mescolare per 1-2 ore a 4 ° C. La NE avrà un aspetto torbido dopo la dialisi. </li></ol> Tip-Non centrifugare per rimuovere il precipitato torbido che viene osservata dopo dialisi, in quanto questa centrifugazione riduce l&#39;attività dell&#39;estratto. <ol start="3"><li> La NE può essere usata immediatamente o aliquote. Aliquote dovrebbe essere lampo congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Il NE possono essere memorizzati e sottoposti ad almeno due cicli gelo-disgelo senza perdere attività. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Recentemente, efficienti sistemi in vitro per l&#39;accoppiamento RNAP trascrizione II di splicing sono stati sviluppati 2-5. Questi sistemi impiegati coltivate cellule HeLa in massa e quindi non sono suscettibili di rapido testare gli effetti di specifici trattamenti cellulari su più campioni. Sulla base di questo bisognond l&#39;utilità generale di un piccolo estratto di protocollo (vedi discussione), abbiamo stabilito un solido metodo di piccola scala nucleare estratto. I dati rappresentativi del confronto RNAP II trascrizione / splicing reazione in piccola scala estratto nucleare con l&#39;estratto bulk nucleare è mostrato in Figura 2. Un costrutto di DNA-CMV, che contiene il promotore CMV e codifica un substrato splicing standard (FTZ 3, Figura 2A) è stato utilizzato per l&#39;analisi. Quando questo costrutto è stato incubato nella massa (corsie 1-3) o di piccole dimensioni (corsie 4-6) estratto, livelli simili di nascente del pre-mRNA sono stati sintetizzati dal punto 5 min Tempo (figura 2, corsie 1 e 4 ). Dopo aggiunta di α-amanitina per bloccare la trascrizione ulteriormente, gli intermedi di giunzione e prodotti giuntate accumulata nel tempo con cinetiche simili in entrambi i tipi di estratti (figura 2, corsie 2, 3, 5, 6). Questi risultati rappresentativi mostrano che l&#39;efficienza del colpo<html> led RNAP II trascrizione / splicing sistema è simile negli estratti rinfusa e su piccola scala nucleari. Per dimostrare l&#39;utilità della piccola scala metodo estratto, estratti sono stati preparati da cellule HeLa trattati con l&#39;inibitore splicing, E7107, o il composto di controllo negativo pladienolide F 6,7 e quindi accoppiata RNAP II trascrizione / splicing saggio è stato effettuato. Come mostrato in figura 3, trascrizione da RNAP II verificato efficientemente estratti preparati sia dal Pladienolide F E7107 e cellule trattate (10 punti temporali min). Al contrario, si è verificato splicing normalmente l&#39;estratto preparato dalle cellule trattate con F Pladienolide ma è stata abolita in E7107 cellule trattate (Figura 3, 20-60 punti di tempo min). Questi dati forniscono la prova di concetto per l&#39;utilizzo degli estratti nucleari di piccole dimensioni per il trattamento speciale di cellule in piccola scala. jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema di piccola scala protocollo Extract. Punto P1. Le cellule sono coltivate come monostrati, raccolto da piastre con un sollevatore di cella e gonfiato con l&#39;aggiunta di tampone ipotonico. Passo P2. Le cellule sono lisate usando un omogeneizzatore Dounce e centrifugato a pellet nuclei. Passo P3. I nuclei sono separati dal citoplasma e subiscono estrazione del sale. Passo P4. L&#39;estratto nucleare viene concentrata e dializzato. Passo P5. I risultati si ottengono che mostrano che gli estratti nucleari sono funzionali (vedi figura 2 per maggiori dettagli). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> Figura 2. Estratti nucleari di piccole dimensioni sono robuste in un RNAP accoppiato II trascrizione / splicing saggio. A. Schematica del CMV-DNA FTZ template utilizzato per accoppiamento RNAP II trascrizione / splicing. Il promotore CMV e le dimensioni degli esoni e introni sono indicati. Confronto B. accoppiato RNAPII trascrizione / splicing test utilizzando l&#39;estratto di massa nucleare o su piccola scala estratto nucleare. α-amanitina è stato aggiunto dopo 5 minuti di trascrizione e di splicing è stata lasciata avvenire per 30 e 60 min. RNA è stato estratto e frazionato su un gel di poliacrilammide denaturante al 5% e rilevato da phosphoimager. Gli intermedi di giunzione ed i prodotti sono indicati. Il endogeno U6 snRNA e tRNA presenti nell&#39;estratto e che sono 32 P-marcato durante l&#39;incubazione sono indicati. Vedere 3 per un protocollo dettagliato sul RNAP accoppiato II trascrizione / splicing del sistema. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> Figura 3. Estratti nucleari piccola scala preparati da cellule HeLa trattati con il farmaco inibitore E7107 splicing sono difettosi in splicing. Cellule sono state trattate con 3 Pladienolide pM o F E7107 comedescritto 6 e poi utilizzata per preparare estratti nucleari piccola scala. Un decorso di tempo è stata effettuata utilizzando la stessa trascrizione / splicing saggio come in Figura 2. Gli intermedi di giunzione e dei prodotti, e snRNA U6 e tRNA sono indicati.

<ol><li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li>
<li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li>
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<li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147(2006).</li>
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<li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li>
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<li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Anal.+Tech%22%5BJournal%5D)">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li>
</ol>

Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Abcam, Plc.

Abbiamo stabilito un metodo rapido e riproducibile per la preparazione di estratti nucleari di piccole quantità di cellule HeLa come monostrati coltivate. Abbiamo dimostrato che questi estratti sono robusti, mostrando che la cinetica e l&#39;efficienza delle RNAP II trascrizione / saggi di splicing sono simili negli estratti di piccole dimensioni e massa nucleari. Abbiamo mostrato l&#39;utilità degli estratti dimostrando che estratti preparati da cellule trattate con un farmaco inibitore della giunzione sono attivi per la trascrizione ma difettoso in splicing. Il metodo per preparare estratti nucleari piccola scala è stata stabilita mediante la combinazione e l&#39;ottimizzazione dei metodi precedentemente stabiliti per rendere estratti di cellule HeLa coltivate in sospensione in larga scala 1,8 e un metodo per la piccola preparazione di estratti 9. Abbiamo stabilito il protocollo perché i precedenti piccola scala estratti non erano funzionali per alcuni saggi, come la trascrizione accoppiata / splicing saggio. Una differenza importante tra la precedente piccola scala protocollo 9 e la nostra è che abbiamo ottimizzato le condizioni per la lisi delle cellule utilizzando un mini-Dounce mentre il precedente protocollo lisate le cellule spingendo attraverso un piccolo ago di calibro 9. L&#39;ago-lisi risultati in bolle, che possono spiegare perché gli estratti sono stati inattivi e / o difficili da riprodurre per alcuni saggi. Abbiamo anche aggiunto una fase di concentrazione al nostro protocollo. Questo passaggio aumenta l&#39;attività degli estratti, che sono estremamente sensibili alla concentrazione, e limita anche la variabilità tra estratti che è inerente ai piccoli preparazioni. Infine, la preparazione viene usualmente effettuata con solo tre piastre da 150 mm di cellule monostrato, senza alcun effetto significativo sull&#39;attività rispetto al estratti rinfusa. Pertanto, la procedura è facilmente recuperabili per i piccoli preparazioni che richiedono reagenti costosi o la disponibilità cellulare limitata. Per esempio, abbiamo preparato small scala estratti da cellule atterramento RNAi e da leucemia linfocitica cronica (CLL), le cellule del paziente, questi estratti e utilizzati per le prove funzionali e / o biochimici (EGF, JLH, TY e RR, inedito). Abbiamo scoperto che gli estratti sono preziose per RNAi seguita da specifici saggi biochimici quali immunopreciptations, western e la colorazione d&#39;argento. Dopo aver stabilito l&#39;efficacia di abbattere una proteina particolare, uno studio più dettagliata può essere effettuata facendo un atterramento linea cellulare stabile, che può essere utilizzato per preparare estratti supplementari a costi inferiori. La spettrometria di massa di proteine ​​presenti in immunoprecipitati ottenuti da queste linee cellulari smontabili sarà anche una utile applicazione del metodo. Oltre al accoppiato trascrizione / splicing saggio che abbiamo usato come esempio per la descrizione di protocollo qui, i piccoli estratti dovrebbe essere generalmente applicabile a numerosi saggi funzionali e biochimici, come quelli utilizzati per la st diversieps di espressione genica (es. capping, splicing, trascrizione, poliadenilazione, elaborazione microRNA). Il protocollo può anche essere adattato per tipi di cellule di pazienti che possono essere ottenuti sia in sospensione (come le cellule CLL) o in coltura (quali fibroblasti paziente). Infine, la frazione citoplasmatica ottenuta durante la procedura sia utile per i saggi funzionali e biochimiche che richiedono il citoplasma.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Nome e cognome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2-idrossietil) piperazin-1-etansolfonico </td><td> Sigma </td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Di cloruro di magnesio esaidrato </td><td> Sigma </td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Cloruro di potassio </td><td> Pescatore </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluoruro Phenylmethanesulfonyl </td><td> Sigma </td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Ditiotreitolo </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Etilendiamminotetracetato, sodio, diidrato </td><td> Americano Bioanalytical </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td></td><td> MP Biomedicals </td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Media Minimal Essential Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Siero fetale bovino </td><td> Gibco </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Soluzione tampone fosfato </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Trypan Blue Stain 0,4% </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15250 </td></tr><tr><td> Sollevatori cellulari </td><td></td><td> Corning </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> Piatti 150mm </td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td> Estesa Micropipetta Tip </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> Dounce omogeneizzatore, 1 ml, con pestello stretta </td><td></td><td> Wheaton </td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers, MWCO 10kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td> Mini-Centricons, MWCO 3kDa </td><td></td><td> Millipore (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche. <table border="1"><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> Finale </td><td> Stock </td><td> Dispensare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ipotonica </td><td> HEPES 10 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td> &lt;td&gt; 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 750 microlitri </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 1,67 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 pl </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 microlitri </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Portate fino a 500 ml con acqua </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Salt Basso </td><td> HEPES 20 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td></td><td> 20 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 667 microlitri </td></tr><tr><td> &amp; Nbsp; </td><td> 0,2 mM EDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 40 microlitri </td></tr><tr><td></td><td> 25% Glicerina </td><td> Glicerina </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 pl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Portare a 100 ml con acqua </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sale alta </td><td> HEPES 20 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td></td><td> 1.4M KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 48 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM EDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 40 microlitri </td></tr><tr><td></td><td> 25% Glicerina </td><td> Glicerina </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 25 pl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Portare a 100 ml con acqua </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dialisi </td><td> HEPES 20 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 16,625 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM EDTA </td><td> 0.5M EDTA </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td></td><td> 20% Glicerina </td><td> Glicerina </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM PMSF </td><td> 200 mM PMSF </td><td> 500 pl </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM DTT </td><td> 2M DTT </td><td> 125 microlitri </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Portate fino a 500 ml con acqua </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Soluzioni per la preparazione di estratto nucleare.

estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica macchinari

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Una grande quantità di progressi nella comprensione dell&#39;espressione genica è stato realizzato utilizzando sistemi in vitro. Per la maggior parte degli studi, saggi funzionali vengono effettuate utilizzando estratti che sono preparati in massa da 10-50 o più litri di cellule coltivate in sospensione. Tuttavia, queste grandi preparazioni non sono suscettibili di rapido test in vitro effetti derivanti da una varietà di trattamenti cellulari in vivo o condizioni. Questo articolo video di giornale mostra un metodo per preparare funzionali estratti nucleari piccola scala, utilizzando le cellule HeLa come esempio. Questo metodo viene effettuata utilizzando sole tre piastre da 150 mm di cellule cresciute in monostrati aderenti. Per illustrare l&#39;efficienza dei piccoli estratti, si dimostra che essi sono attivi come bulk estratti nucleari per accoppiati RNA polimerasi II trascrizione / splicing reazioni. Per dimostrare l&#39;utilità del protocollo estratto, si dimostra che splicing è abolito in estratti preparati da cellule HeLas trattati con il farmaco inibitore E7107 splicing. La piccola scala protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile a qualsiasi processo o tipo di cellula che può essere studiato in vitro con estratti cellulari. Questi includono le cellule dei pazienti che sono disponibili solo in quantità limitate o cellule esposte a numerosi agenti come la droga, gli agenti che danneggiano il DNA, RNAi, o di trasfezione, che richiedono l&#39;uso di popolazioni cellulari di piccole dimensioni. Inoltre, piccole quantità di cellule appena coltivate sono convenienti e / o richiesto per alcune applicazioni.

Un protocollo per la preparazione di robusti, piccoli estratti HeLa nucleari viene descritto. Questo protocollo è importante per i saggi che richiedono l&#39;uso di piccole popolazioni di cellule, come cellule trattate con farmaci o RNAi. Il metodo dovrebbe essere applicabile ad un&#39;ampia varietà di analisi di espressione genica e altri tipi cellulari, incluse cellule del paziente.

Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

È stata compiuta una notevole serie di progressi nella comprensione dell'espressione genica utilizzando sistemi in vitro. Per la maggior parte degli studi, i saggi funzionali vengono eseguiti utilizzando...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare l'espressione genica utilizzando macchinari nucleari funzionali estratti da cellule. Questo risultato si ottiene innanzitutto raccogliendo le cellule HeLa mediante gonfiamento. Successivamente, le cellule vengono lisate per rotture osmotica e quindi centrifugate per ottenere un pellet di nuclei al terzo passaggio.I nuclei vengono estratti con sale, concentrati e dializzati al fine di ottenere macchinari funzionali per l'espressione genica solubili. In definitiva, la funzionalità degli estratti nucleari può essere valutata in base alle loro attività di trascrizione e splicing, analizzate mediante un sistema accoppiato di RNA polimerasi per trascrizione e splicing. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la preparazione di estratti nucleari in massa, è che con questo metodo è possibile utilizzare una piccola quantità di cellule per preparare l'estratto nucleare.Iniziare piantando cellule HeLa su tre piastre da 150 millimetri con terreno DMEM integrato con FBS e antibiotici; coltivare le culture in un incubatore a 37 °C con 5% CO₂ fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza del 90%. A questo punto, aspirare il terreno dalle colture cellulari HeLa e lavarle una volta con 13 millilitri di PBS a temperatura ambiente per piastra, quindi aspirare il PBS. Lasciare ogni piastra in posizione verticale per alcuni secondi e aspirare il PBS rimanente.Successivamente, utilizzare un distaccatore cellulare per raschiare le cellule lungo il bordo inferiore di ogni piastra, quindi trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitri. Infine, formare il pellet cellulare in una microcentrifuga per cinque minuti a cento volte G e a quattro gradi Celsius. Aspirare ora il PBS dal pellet cellulare e stimare il volume cellulare compatto o PCV osservando la graduazione sulla provetta.Quindi aggiungere un volume di buffer ipotonico pari al doppio del VCM al pellet cellulare. Agitare delicatamente il tubo per risospendere le cellule. Rimuovere delicatamente gli aggregati cellulari, se necessario, pipettando su e giù la sospensione cellulare con una pipetta da 1000 microlitri.Quindi centrifugare le cellule nelle stesse condizioni di centrifugazione precedenti. Dopo la centrifugazione, aspirare con attenzione il livello di tampone ipotonico. Le cellule avranno iniziato a rigonfiarsi e il volume cellulare sarà aumentato a circa 750-1000 microlitri.Aggiungere nuovo buffer ipotonico fino a un volume finale di 1,5 millilitri e risospendere le cellule nel buffer. Infine, incubare le cellule risospese e rigonfie sul ghiaccio per 10 minuti mentre le cellule si raffreddano. Sciacquare un omogeneizzatore a pistone con buffer ipotonico e quindi posizionarlo sul ghiaccio insieme alle cellule.Quindi, utilizzando un fazzoletto morbido per compiti delicati, come un fazzoletto Kim, asciugare il pestello. Utilizzare una punta micro-pipetta da 1000 microlitri con estensione per rimuovere il tampone dai downs. Ora usare la pipetta per trasferire le cellule rigonfie fredde nei downs Down.La parte più delicata di questa procedura consiste nel verificare con successo il completamento della lisi. Dopo ogni passaggio al microscopio, muovere lentamente su e giù per cinque volte la pestella stretta del dispositivo per lisare le cellule, avendo cura di evitare la formazione di bolle. Successivamente, trasferire cinque microlitri di aliquota della sospensione cellulare lisata in un tubo eppendorf e aggiungere 10 microlitri di tripan blu e 15 microlitri di 1x PBS.Aggiungere la soluzione cellulare su un vetrino ed esaminare le cellule al microscopio ottico per osservare la lisi; i nuclei delle cellule lisate appariranno blu dopo tre once. La lisi non è sufficiente poiché sono visibili numerose cellule vive. Dopo cinque once, la lisi è adeguata.Infine, trasferire le cellule lisate nel tubo Eppendorf pre-raffreddato e centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti in una microcentrifuga a 1500 ×g e a 4 °C. Successivamente, trasferire con attenzione il soprannatante in un nuovo tubo senza disturbare il pellet. A questo punto, stimare il volume del pellet nucleare (PNV) osservando le graduazioni sul tubo.Riempire la punta di una micropipetta con tampone a basso contenuto salino fino a metà del volume nucleare (PNV). Inserire quindi la punta della micropipetta nei nuclei sul fondo del tubo einor. Espellere lentamente il tampone all'interno dei nuclei mescolando delicatamente.Battere leggermente il tubo per assicurarsi che il pellet sia completamente risospeso. Successivamente, aggiungere il buffer ad alto contenuto salino in quantità pari alla metà del volume del PNV e mescolare rapidamente una sola volta capovolgendo il tubo. Ruotare il tubo per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Infine, centrifugare i nuclei nel microcentrifuga per 15 minuti a 18.000 ×g e a quattro gradi Celsius. Iniziare trasferendo 500 microlitri del soprannatante in microprovette fredde. Centrifugare l'estratto nucleare ad alto contenuto salino per 15 minuti a 14.000 ×g e a quattro gradi Celsius; dopo la centrifugazione, capovolgere il minicolumn e posizionarlo in una nuova provetta EOR singola.Dopo aver centrifugato per due minuti a 1000 ×g e a quattro gradi Celsius, l'estratto nucleare ad alto contenuto salino verrà concentrato a circa 115 microlitri. Trasferire ora aliquote da 45 microlitri dell'estratto nucleare ad alto contenuto salino in dializzatori mini SLI. Assicurarsi che la parte inferiore del vetrino sia allineata con la parte inferiore del galleggiante.Quindi posizionare gli SLI in 500 millilitri di tampone di dialisi freddo. Infine, agitare gli aliquote per uno o due ore a quattro gradi Celsius; l'estratto nucleare apparirà torbido dopo la dialisi. Questa figura mostra dati rappresentativi che confrontano una reazione accoppiata di trascrizione da parte della RNA polimerasi due e rimozione degli introni in un estratto nucleare su piccola scala rispetto a un estratto nucleare in grande quantità.Quando il costrutto A-C-M-V-D-N-A è stato incubato in estratti su larga scala o su piccola scala, livelli simili di pre-mRNA nascente sono stati sintetizzati entro il punto temporale di cinque minuti successivo all'aggiunta di alfa e manin per bloccare ulteriori processi di trascrizione; nel frattempo, gli intermedi di splicing e i prodotti di splicing si sono accumulati nel tempo con cinetiche simili in entrambi i tipi di estratto. Questi risultati rappresentativi confermano che l'efficienza del sistema accoppiato di trascrizione da parte dell'RNA polimerasi II e splicing è simile negli estratti nucleari su larga e su piccola scala. Per dimostrare l'utilità dell'estratto su piccola scala, sono stati preparati estratti da cellule HeLa trattate con l'inibitore dello splicing E 7 1 0 7 o con il composto di controllo negativo Platy analy F, quindi è stato eseguito un saggio accoppiato di trascrizione da parte dell'RNA polimerasi II e splicing come mostrato in questa figura: la trascrizione mediata dall'RNA polimerasi II è avvenuta efficientemente sia negli estratti ottenuti da cellule trattate con plaid F che in quelli trattati con E 7 1 0 7.Al contrario, lo splicing è avvenuto normalmente nell'estratto preparato a partire dalle cellule trattate con analy F, ma è stato abolito nelle cellule trattate con E 7 1 0 7. Questi dati costituiscono una dimostrazione di principio per l'uso di estratti nucleari su piccola scala in seguito a trattamenti cellulari su piccola scala. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in meno di cinque ore.

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