Name: Reverse Genetics recupero mediato del Infettive Norovirus Murine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: Impara due strategie di reverse genetics per il recupero di norovirus murino infettivo in coltura cellulare. Questi metodi consentono la generazione di isolati MNV geneticamente definiti per studiare la replicazione virale e la patogenesi.

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Questa ricerca è stata finanziata da una borsa di studio Wellcome Trust senior assegnato a Ian Goodfellow, e Marie Curie Intra European Fellowship (7 ° PQ Consiglio europeo della ricerca) ha assegnato ad Armando Arias. Vorremmo ringraziare Io Hong Cheong, il dottor Rebecca Robey e il dottor Mike Skinner per averci dato il permesso di utilizzare il loro bioanalyser Agilent e contribuendo con l&#39;esecuzione campioni di RNA.

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<li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4%5BTitle%5D)+AND+%22E.+EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li>
<li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li>
<li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li>
<li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li>
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<li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735(2010).</li>
<li>Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li>
<li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li>
<li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3%27+extremity+of+the+murine+norovirus+genome%3A+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Qui abbiamo illustrato due differenti approcci inverse genetici che permettono il recupero di MNV infettiva in coltura cellulare. Sia avvicina efficacemente bypassare il requisito assoluto per il collegamento covalente del VPG alla estremità 5 &#39;del genoma di RNA virale attraverso la generazione del ridotte trascritti MNV che vengono poi riconosciuti dai ribosomi cellulari. Trascrizione in vitro seguita da enzimaticamente tappatura è più efficiente in il recupero di MNV virulenta della trascrizione di plasmidi infettive in cellule esprimenti T7 RNA polimerasi, in cui i trascritti può essere chiuso da gli enzimi FPV tappatura. Titoli virali recuperati con questi sistemi genetica inversa sono simili a quelle ottenute mediante trasfezione di virali VPG-linked RNA purificati da colture di cellule infette 17 (Figura 5). La transfezione di capped MNV RNA in cellule permissive Raw264.7 rende un titolo virus solo l&#39;1-log inferiore esperimenti di transfection di RNA totale da cellule infette contenenti virale VPG-linked RNA (Figura 5). Questo fatto incoraggia ulteriori indagini per determinare se l&#39;aggiunta di una molecola VPG alla estremità 5 &#39;di trascritti generati da questi sistemi può comportare un aumento rese virali che possono rivelare aspetti funzionali sottostanti infettività MNV in cellule associate a VPG. Tuttavia, consideriamo questo sistema genetica inversa come una altamente efficiente comparabile ad altri virus RNA genetica inversa sistemi attualmente utilizzati in cui l&#39;RNA trascritto in vitro permette il recupero dei titoli solo 10-100 inferiori nelle infezioni reali con virioni 19, 20. Nel complesso, le metodologie attuali costituiscono un significativo passo avanti nel campo della biologia molecolare e norovirus fornirci gli strumenti per indagare i ruoli funzionali di proteine ​​e RNA motivi conservati nei genomi di norovirus. Questi approcci sono già stati combinati con cmodello di topo ATTUALE a disposizione e hanno dimostrato che MNV recuperato da cDNA infettiva è in grado di causare l&#39;infezione letale di&gt; 80% STAT1-/ - topi in meno di 10 giorni 4, 21. Facendo uso di questo sistema abbiamo recuperato mutanti vitali norovirus murini della proteina del capside e di un tratto polypyrimidine coinvolto nel legame di fattori diversi host (PTB e PCBP) che mostrano un fenotipo alquanto attenuati in vivo 21, 22. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che i virus che mancano della capacità di esprimere la proteina da VF1 ORF4 efficiente replicarsi nelle cellule in coltura, ma ancora una volta hanno ridotto la virulenza nei topi rispetto al WT MNV 8. Questi studi ci incoraggiano a progettare versioni attenuate di norovirus umani sulla base di studi MNV che potrebbero essere indagati come potenziali candidati vaccini.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Soluzione di cloruro di litio precipitazioni </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA soluzione di storage </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 sceneggiatura </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Capping sistema </td><td> Epicentre Biotecnologie </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Trasfezione sistema Neon </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon trasfezione kit sistema </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 Transfection Reagent </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano kit </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA e Kit Banda Gel Purificazione </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX Large Scale Production System-T7 RNA </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics recupero mediato del infettive norovirus murine

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Norovirus umani sono responsabili della maggior parte dei casi di gastroenterite umana (GE) a livello mondiale e sono problema ricorrente in ambienti dove vicino da persona a persona di contatto non possono essere evitati 1, 2. Negli ultimi anni un aumento nell&#39;incidenza di focolai negli ospedali è stata riportata, causando interruzioni significative per la loro capacità operativa nonché grandi perdite economiche. L&#39;identificazione di nuovi approcci antivirali è stato limitato a causa dell&#39;incapacità di norovirus umani per completare una infezione produttiva in coltura cellulare 3. L&#39;isolamento recente di un norovirus murino (MNV), strettamente legato al norovirus umana 4, ma che può essere propagato in cellule 5 ha aperto nuove strade per lo studio di questi patogeni 6, 7. Risultati replica MNV nella sintesi di nuovo genomico senso positivo e subgenomici molecole di RNA, l&#39;ultimo dei quali corrisponde all&#39;ultimo THIRd del genoma virale (Figura 1). MNV contiene quattro diversi telai di lettura aperti (ORF), di cui ORF1 occupa la maggior parte del genoma e codifica sette proteine ​​non strutturali (NS1-7) rilasciati da un precursore poliproteina. ORF2 e ORF3 sono contenuti all&#39;interno della regione subgenomico RNA e codificano le proteine ​​del capside (VP1 e VP2, rispettivamente) (Figura 1). Recentemente, abbiamo identificato che ORF4 ulteriore sovrapposizione ORF2, ma in una cornice diversa lettura è funzionale e codifica per un fattore di virulenza mitocondriale localizzata (VF1) 8. Replica di virus RNA senso positivi, compresi norovirus, avviene nel citoplasma risultante nella sintesi di nuovi livellate genomi di RNA. Per promuovere traduzione virale, i virus sfruttano diverse strategie volte al reclutamento del macchinario cellulare sintesi proteica 9-11. È interessante notare, traduzione norovirus è guidato dalla proteina virale multifunzionale-primer VPGlegata covalentemente al 5 &#39;di entrambi RNA genomici e subgenomico 12-14. Questo sofisticato meccanismo di traduzione è probabile che sia un fattore importante nella scarsa efficienza di recupero virale tradizionali approcci di genetica inversa. Riportiamo due diverse strategie basate sulla generazione di norovirus murino-1 (indicato come MNV qui allegata) trascritti limitato al 5 &#39;. Uno dei metodi coinvolge sia sintesi in vitro e tappatura di RNA virale, mentre il secondo approccio implica la trascrizione di MNV cDNA in cellule esprimenti T7 RNA polimerasi. La disponibilità di questi sistemi genetica inversa per lo studio di MNV e un modello animale piccolo ha fornito una capacità senza precedenti per sezionare il ruolo di sequenze virali di replicazione e patogenesi 15-17.

I Norovirus sono una delle principali cause di gastroenterite ancora tecniche molecolari per la loro caratterizzazione sono ancora relativamente nuovi. Riportiamo due diversi approcci di genetica inversa per il recupero efficiente dei norovirus murino (MNV), l&#39;unico membro di questo genere che possono essere propagate in coltura cellulare.

Reverse Genetics recupero mediato del Infettive Norovirus Murine

I norovirus umani sono responsabili della maggior parte dei casi di gastroenterite (GE) umana in tutto il mondo e rappresentano un problema ricorrente in ambienti caratterizzati da stretti...

L'obiettivo generale di questa procedura è recuperare il mu neurovirus infettivo utilizzando due sistemi di genetica inversa. Ciao, sono Armando Arias della sezione di Virologia dell'Imperial College di Londra. Nel nostro gruppo siamo interessati a chiarire i meccanismi molecolari alla base della replicazione del neurovirus.I norovirus sono una delle principali cause di gastroenterite. A livello mondiale, le tecniche molecolari avanzate per la loro caratterizzazione sono ancora relativamente recenti. L'identificazione di nuovi approcci antivirali e la comprensione del ciclo vitale del norovirus sono state limitate a causa della loro incapacità di completare un'infezione produttiva in coltura cellulare.L'isolamento recente di un antivirale in grado di infettare i topi e di propagarsi in colture cellulari, noto come neurovirus mirror, ha aperto nuove prospettive per lo studio di questi importanti patogeni. In questo rapporto, illustreremo due strategie che consentono la generazione di isolati di neurovirus geneticamente definiti in colture cellulari. Entrambe le strategie si basano sulla produzione di trascritti virali con cap al terminale cinque prime.Il primo prevede la sintesi in vitro della cappatura dell'RNA virale prima della trasfezione nelle cellule. Il secondo approccio comporta la trascrizione del virus neuro MI, del cDNA all'interno di cellule che esprimono la polimerasi RNA T7. Panoramica della procedura. Il protocollo per il recupero del virus neuro norovirus da trascritti di RNA cappato inizia con una linearizzazione.Il plasmide contenente MV CD NA per mmv uno. Questo viene eseguito con l'enzima di restrizione NHE uno. Il DNA viene successivamente trascritto in vitro in RNA utilizzando la RNA polimerasi T sette.Successivamente, l'M-M-V-R-N-A viene cappato in vitro e trasfettato nelle cellule per consentire il recupero di MMV infettivo, ovvero il recupero diretto di MNV infettivo mediante il virus FAL PX che esprime la RNA polimerasi T seven per il recupero di MMV da cloni cDNA direttamente trasfettati. Le cellule vengono innanzitutto infettate con un virus FAL PX ricombinante che esprime la RNA polimerasi T seven. L'infezione da FAL PX determinerà l'espressione della RNA polimerasi T seven nonché di enzimi di capping dell'RNA virale, che potrebbero cappare parte dell'RNA sintetizzato. L'M-M-V-C-D-N-A viene quindi trasfettato nelle cellule infettate da FPV mediante trasfezione mediata da lipidi. La RNA polimerasi T seven produce quindi l'M-M-V-R-N-A, una parte della quale potrebbe essere cappata dal sistema di capping dell'RNA di FPV.Una sequenza ribozima garantisce che ogni trascritto di RNA contenga un'estremità tre prime definita. I trascritti di MMV con cap verranno quindi tradotti in proteina prima della replicazione, portando alla produzione di nuove particelle infettive. Protocollo per la trascrizione dell'RNA e l'aggiunta del cap per il recupero di trascritti di MMV infettivi e con cap.Per prima cosa, mescolare i seguenti reagenti: trascrizione, tampone, nucleotidi, acqua e plasmide lineare contenente il M-M-V-C-D-N-A. Quindi aggiungere all'insieme reazionale l'RNA e la RNA polimerasi T7. Sono disponibili numerose kit commerciali per questo scopo, che forniscono un metodo riproducibile per la sintesi dell'RNA.La reazione di trascrizione viene eseguita incubando il mix a 37 gradi Celsius per almeno due ore. Analizzare una piccola aliquota di questa reazione di trascrizione su un gel di agarosio non denaturante. Innanzitutto, pulire l'apparecchiatura per gel con il detergente e risciacquare con acqua priva di RNAsi prima dell'uso.Assicurarsi che i gel di agarosio siano preparati utilizzando reagenti privi di RNasi. M-V-R-N-A migrerà a circa tre basi chilometro su un gel di agarosio non denaturante. Inoltre, un bioanalizzatore Agilent può essere utilizzato per fornire un metodo rapido di analisi dell'integrità dell'RNA.L'RNA deve quindi essere purificato per rimuovere i nucleotidi non incorporati. Sono disponibili molti metodi; tuttavia, in questo protocollo, l'RNA viene purificato mediante precipitazione con cloruro di litio, un'alternativa economica che forma un pellet dell'RNA tramite centrifugazione alla velocità massima per 15 minuti. Rimuovere il soprannatante, avendo cura di non disturbare il pellet traslucido, e lavare con etanolo al 70%.Risospendere il trascritto MMV in soluzione di conservazione dell'RNA ed assicurarsi che sia completamente disciolto. Riscaldare l'RNA a 65 gradi C può facilitare questo processo in seguito. Quantificare l'RNA mediante spettrometria.Analizzare l'integrità dell'RNA eseguendo una piccola aliquota su un gel di agarosio non denaturante all'1%. Come si può osservare, l'integrità dell'RNA dopo la precipitazione con cloruro di litio dovrebbe rimanere invariata per migliorare l'efficienza di cappuccio. Riscaldare un'aliquota dell'RNA a 65 gradi per 10 minuti.Posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio. Per evitare degradazione o ripiegamento, preparare una miscela di reazione per la cappatura seguendo le indicazioni del produttore. Di solito aggiungiamo circa 60 microgrammi di M-N-V-R-N-A a una reazione finale di 100 microlitri.Sebbene la reazione possa essere ridotta di scala, mescolare accuratamente e incubare a 37 gradi per un'ora, quindi purificare l'RNA mediante precipitazione con cloruro di litio come in precedenza. È essenziale verificare nuovamente l'integrità dell'RNA prima di procedere con la trasfezione. Protocollo passo dopo passo per il recupero di MMV mediante elettroporazione dell'RNA in cellule raw. Resus.Sospendere il flacone delle cellule grezze in DMEM. Assicurarsi di ottenere una sospensione di singole cellule. Determinare la concentrazione di cellule vitali mediante emocitometro utilizzando l'esclusione del blu di trian.Centrifugare le cellule e risospendere con attenzione in aliquote di mezzo fresco senza antibiotici, 8 milioni di cellule per trasfezione, quindi centrifugare nuovamente in una microcentrifuga. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule in 500 microlitri di PBS, centrifugare di nuovo, rimuovere il PBS e risospendere le cellule in 130 microlitri a temperatura ambiente.Soluzione sospensiva per la resuscitazione Neon. Aggiungere la quantità appropriata di RNA cappato, tipicamente 1,3 microgrammi per 130 microlitri di cellule, pari a un microgrammo di RNA per 6 milioni di cellule. Le cellule mescolate con i trascritti vengono raccolte nella punta di trasfezione Neon da 100 microlitri.È necessario prestare la massima attenzione per evitare di introdurre bolle in questa fase. Quindi, eseguire l'elettroporazione utilizzando un singolo impulso a 1700 volt per 25 millisecondi. Rilasciare le cellule in un tubo eppendorf contenente un millilitro di mezzo privo di antibiotici.Distribuire le cellule dal tubo in pozzetti indipendenti contenenti DMEM senza antibiotico con 10% di FCS e incubare le cellule a 37 gradi per 24-72 ore. Recupero di MMV mediante lipotransfezione di RNA in cellule BSR T sette come in precedenza. I trascritti di MMV sono generati mediante LINEARIZZAZIONE del plasmide MMV CD nna e trascrizione in vitro con polimerasi T sette e cappuccio in vitro; i trascritti vengono quindi lipotrasfettati in cellule BS RT sette. La tripsina agisce su un monostrato di cellule bsrt sette e si seminano 7,5 volte 10 alla cinque cellule vitali in piastre a sei pozzetti.Incubare le cellule a 37 gradi durante la notte. Rimuovere il terreno dalle cellule e sostituirlo con tre millilitri di terreno fresco privo di antibiotici. Per garantire la massima efficienza della trasfezione, mescolare da uno a due microgrammi di M-M-V-R-N-A con cappuccio con 100 microlitri di OptiMEM.Mescolare anche quattro microlitri di lipectomia 2000 con 100 microlitri di ottimale. Combinare i campioni contenenti RNA e lipectomia e mescolarli accuratamente aspirando e dispensando 15 volte con una pipetta. Lasciare la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti.Quindi aggiungere i complessi di transfezione contenenti trascritti MMV capped in modo goccia a goccia al monostrato cellulare. Agitare la piastra in direzioni perpendicolari. Incubare le cellule per 24 fino a settantadue ore.Protocollo per il recupero diretto di MMV infettivo da cDNA in cellule che esprimono la RNA polimerasi T7 come descritto in precedenza. Questo protocollo si basa sull'espressione della RNA polimerasi T7 e degli enzimi di cappuccio virali oxx in cellule infettate da un virus helper oxx. M-N-V-C-D-N-A sotto il controllo di un promotore T7 viene quindi trasfettato nelle cellule.Prima di tutto, rimuovere il terreno di coltura cellulare e aggiungere in ogni pozzetto 700 microlitri di virus F pox diluito in terreno senza antibiotici. Generalmente si utilizza una multiplicità di infezione di circa 0,5 PFU per cellula; agitare le piastre perpendicolarmente e incubare per un'ora a 37 gradi. Successivamente, aggiungere due porzioni di terreno senza antibiotici e incubare le cellule per un'ulteriore ora a 37 gradi per consentire l'espressione della RNA polimerasi T7. Dopo la transfezione con MNV CG NNA, rimuovere il terreno dai campioni infetti e aggiungere tre millilitri di terreno fresco senza antibiotici.Preparare una miscela di un microgrammo di M-M-V-C-D-N-A e lipectomia come spiegato nella sezione precedente. Mescolare accuratamente muovendo su e giù. Mantenere il tubo a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi mescolare nuovamente e aggiungere le gocce al monostrato cellulare.Agitare delicatamente la piastra in direzioni perpendicolari. Incubare le cellule a 37 gradi per 24-72 ore per confermare il recupero del MMV infettivo mediante le diverse strategie di genetica inversa illustrate nel corso di questo video, rilasciando la variante infettiva dalle cellule mediante cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Determinare in ogni campione mediante procedure standard come il saggio TCID 50 o il saggio della placca i risultati rappresentativi.La disponibilità di questi sistemi di genetica inversa per lo studio del mi Neurovirus ha fornito una capacità senza precedenti di analizzare il ruolo delle sequenze virali nella replicazione e nella patogenesi dei neurovirus nell'ospite naturale. Entrambi gli approcci di genetica inversa illustrati in questo video sono altamente efficienti per il recupero di neurovirus infettivi in coltura cellulare. Come mostrato in questa figura.MMV infettivo, il cui titolo supera 10 alla cinque TCID50 per ml, viene recuperato dopo la trasfezione di trascritti di MMV cappucciati in cellule RAW o in cellule BSRT7. La trasfezione di MMV-cDNA in cellule BSRT7 precedentemente infettate con l'aiuto del virus helper fowlpox determina titoli virali superiori a 10 alla quattro TCID50 per ml. I titoli virali ottenuti mediante approcci di genetica inversa sono simili a quelli recuperati mediante trasfezione con RNA isolato da virus infettivo, evidenziando l'elevata efficienza dei sistemi di genetica inversa qui descritti.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un One-Step RT-PCR per il rilevamento e l'identificazione genogruppo di isolati Norovirus da feci bambini, che utilizza primer e sonde TaqMan specifiche al telaio di lettura aperta 1 (ORF1)-ORF2 regione di giunzione, la regione più conservata del genoma Norovirus è descritto. Un non-commerciale e conveniente metodo di estrazione dell'RNA è dettagliato.

Rilevamento e Genogrouping di Norovirus dalle feci dei bambini By Taqman One-step RT-PCR

Il sistema di genetica inversa per la Valle del virus della febbre della Rift MP-12 ceppo vaccinale è un utile strumento per la creazione di ulteriori MP-12 mutanti con attenuazione aumentata e l'immunogenicità. Noi descriviamo il protocollo per generare e caratterizzare NSS ceppi mutanti.

Utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del NSS il virus della febbre della Rift Valley MP-12 Strain per migliorare la sicurezza e l&#39;efficacia del vaccino

Qui si descrive un metodo per quantificare particelle infettive di norovirus murino (MNV), che è l'unica norovirus che replica efficiente in coltura cellulare. Il saggio di placca sfrutta MNV tropismo per i macrofagi murini e può essere adattato all'uso con campioni biologici o ambientali contenenti MNV.

Saggio di placca per Norovirus Murine

Fonte: Leuthold, M. M., et al. Produzione di domini sporgenti di norovirus umano in E. coli per cristallografia a raggi X. J. Vis. Exp. (2016).Questo video dimostra la purificazione del dominio P del norovirus umano ricombinante utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale, evidenziando la separazione della proteina bersaglio dalle impurità a peso molecolare più alto e più basso in base all'accessibilità differenziale dei pori. Il processo è monitorato mediante assorbanza UV e...

Purificazione delle proteine del dominio P ricombinante derivate da batteri del norovirus umano

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Salvataggio di arenavirus ricombinanti da cDNA clonati, un approccio denominato invertire la genetica, permette ai ricercatori di indagare il ruolo di specifici prodotti genici virali, così come il contributo dei loro diversi domini e residui specifici, per diversi aspetti della biologia di arenavirus . Allo stesso modo, invertire tecniche di genetica in linee cellulari approvato dalla FDA (Vero) per lo sviluppo di vaccini fornisce nuove possibilità per la generazione di vaccini efficaci e...

Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero

Virus della malattia di Newcastle (NDV) è stata ampiamente studiata negli ultimi anni per sviluppare nuovi vettori per la vaccinazione e terapia, tra gli altri. Questi studi sono stati possibili a causa di tecniche di salvataggio virus ricombinante da cDNA, come quelle descritte.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Qui presentiamo una procedura per quantificare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili utilizzando la PCR quantitativa a trascrizione inversa. Il recupero medio del virus dalle acque sotterranee con questa procedura standardizzata del metodo EPA 1615 è stato del 20% per il poliovirus e del 30% per il norovirus murino.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

Metodi di rilevazione sistematica che utilizzano amplificazione del genoma virale sono limitati dalla loro incapacità di discriminare infettive da particelle non infettive. Lo scopo di questo articolo è di fornire protocolli dettagliati per metodi alternativi di aiuto nella discriminazione delle particelle infettive norovirus utilizzando l'associazione aptamer, diffusione dinamica della luce e microscopia elettronica di trasmissione.

Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

La generazione di rotavirus ricombinanti dal DNA plasmide fornisce uno strumento essenziale per lo studio della replicazione e della patogenesi del rotavirus e per lo sviluppo di vettori e vaccini di espressione del rotavirus. Qui, descriviamo un approccio semplificato di genetica inversa per la generazione di rotavirus ricombinanti, compresi ceppi che esprimono proteine reporter fluorescenti.

Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

L'obiettivo di questo protocollo è quantificare il legame del patogeno eucatotico norovirus umano ai batteri. Dopo aver eseguito un primo saggio di attaccamento virus-batterio, la citometria di flusso viene utilizzata per rilevare batteri viralmente legati all'interno della popolazione.

Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso

Impara due strategie di reverse genetics per il recupero di norovirus murino infettivo in coltura cellulare. Questi metodi consentono la generazione di isolati MNV geneticamente definiti per studiare la replicazione virale e la patogenesi.

Reverse Genetics recupero mediato del Infettive Norovirus Murine

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