Name: Trasfezione anticorpo in neuroni come strumento per studiare patogenesi della malattia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Impara la trasfezione di anticorpi in neuroni per studiare la patogenesi delle malattie neurologiche. Questo metodo rapido e riproducibile utilizza microscopia a immunofluorescenza per analizzare gli effetti degli autoanticorpi sulle funzioni cellulari.

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Questo lavoro è supportato dall&#39;Ufficio di Ricerca e Sviluppo, Ricerca medica Service, Department of Veterans Affairs. Questo studio è stato finanziato da un premio VA recensione Merit (per MCL) e la University of Tennessee Health Science Fondo sclerosi multipla Research Center.

1. Anticorpo Labeling (Figura 1) <ol><li> Fai 0.1 M NaHCO 3 buffer: <ul type="circle"><li> 8,4 g NaHCO 3 </li><li> 29,2 g NaCl </li><li> 1 litro H 2 O </li></ul></li><li> Portare il buffer fino ad un pH di 8,4 con questa soluzione (10,6 g di Na 2 CO 3, 29,2 g di NaCl, 1 litro H 2 0). </li><li> Aggiungere 35 ul Atto550 NHS a 70 pl pl NaHCO anti-hnRNPA1 e 500 3 tampone e ruotarlo per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo un&#39;ora di rotazione, iniettare il composto in un dializzatore e dializza in 2 litri di PBS durante la notte. </li><li> Il giorno dopo, concentrare i dializzati Atto550 NHS anti-hnRNPA1 utilizzando una colonna di spin (Amicon Ultra 0.5). </li><li> Dopo le Atto550 NHS marcato anti-hnRNPA1 anticorpo è stato concentrato, nano-drop campione per determinare la concentrazione. </li></ol> 2. Anticorpo trasfezione (Figura 2) <ol><li> Seed 10 5 cellule / pozzetto in 500 pl di Dulbecco di Eagle modificato Medio (DMEM/F12 10% FBS 1% antibiotico) in un pozzetto 8 slitta 24 ore prima della trasfezione. Confluenza cellulare deve essere almeno il 70%. </li><li> Ventiquattro ore dopo la semina, aggiungere 2 ml di Ab-DeliverIN reagenti in una provetta Eppendorf. </li><li> Successivamente, aggiungere 2 ug di Atto550 NHS etichettati hnRNPA1 anticorpo anti-(0,5 pg / pl) allo stesso tubo Eppendorf e incubare 10-15 min a RT. </li><li> Durante l&#39;incubazione, aspirare media e aggiungere 394 ml di DMEM fresco supporto alle cellule. </li></ol> Nota: Aggiungere 500 microlitri DMEM ad una camera di cellule intatte per fungere da controllo. <ol start="5"><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 100 ml di DMEM alla miscela di anticorpi, mescolare pipettando su e giù, e aggiungere alle cellule in DMEM per un volume totale di 500 microlitri. </li><li> Modificare i media dopo 48 ore di consegna anticorpi. </li></ol> Nota: protocollo è stato ripetuto con FITC Rigg etichettato come controllo positivo. 3. Imaging Live e stabiliti per determinare l&#39;efficienza <ol><li> Celle di immagine, vivono a 48 ore utilizzando i Cy3 filtro su un microscopio a fluorescenza per l&#39;immagine del trasfettate Atto550 NHS anticorpi marcati. </li><li> Dopo l&#39;imaging dal vivo è stata completata, aspirare i media e le cellule fisse. </li><li> Dopo mezzi aspiranti, il trattamento di cellule con 0,4% paraformaldeide per 15 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule 4 x 5 min ciascuna con PBS. Poi, montare cellule con mezzi di montaggio contenenti reagenti DAPI e applicare il coprioggetto correzione. Misurare l&#39;efficienza di trasfezione delle cellule fisse con AxioVision software. Se AxioVision software non è a portata di mano, basta contare gli eventi dall&#39;immagine i risultati a mano e inserire nel calcolo in 3.7. In alternativa, il software ImageJ può essere utilizzato per questi calcoli. </li><li> In primo luogo, utilizzare la misurazione &quot;Eventi&quot; per contare il numero totale di celle nella vostra immagine di scelta un ingrandimento 20x. </li><li> Successivamente, utilizzare la misurazione &quot;Eventi&quot; per contare le cellule che non eranosuccesso trasfettate con anticorpi nella stessa 20x ingrandimenti. </li><li> Per accedere ai misurati &quot;Eventi&quot; in un formato stile Excel, fare clic su &quot;Proprietà&quot;, fare clic sulla scheda &quot;Misura&quot;, e fare clic per visualizzare &quot;come tabella.&quot; </li><li> Infine, utilizzare il seguente calcolo per determinare l&#39;efficienza di trasfezione confrontando i due eventi misurate in precedenza: ((Totale cellule - cellule non trasfettate) / cellule totali) x 100 = La trasfezione di efficienza. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Le immagini live non trasfettate (Figura 3A) rispetto al trasfettate (Figura 3B) neuroni rivelano che l&#39;etichettatura degli anticorpi (rosso o verde in ogni figura) è chiaramente osservata nelle cellule (Figura 3B, C, D). Seguendo aspirazione e lavaggio con mezzi per rimuovere gli anticorpi o tra aderenti alla superficie delle cellule, anticorpi marcati sono ancora presenti all&#39;interno dei neuroni (Figura 3C, D).<html> Per calcolare l&#39;efficienza di trasfezione, utilizzare il software AxioVision per calcolare cellule totali rispetto alle cellule che non sono state transfettate con successo. Questi valori sono stati inseriti in una formula efficienza di trasfezione di acquisire l&#39;efficienza di trasfezione come percentuale di cellule totali (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso delle procedure utilizzate per gli anticorpi etichette con la 550 Atto NHS estere seguita da passaggi necessari per concentrare gli anticorpi marcati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4154/4154fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig2.jpg" /> Figura 2. Diagramma di flusso delle procedure utilizzate per trasfettare anticorpi marcati nelle cellule vive in coltura.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini in diretta dei neuroni trasfettati trasfezione 48 ore di seguito. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4154/4154fig4.jpg" /> Figura 4. Fisso e risciacquati immagini con eventi contati per determinare l&#39;efficienza di trasfezione.

<ol><li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li>
<li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambert-Eaton+syndrome+antibodies%3A+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li>
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<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li>
<li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+cause+of+disease+or+caused+by+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li>
<li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li>
<li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li>
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<li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer%2C+Axl%2C+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li>
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<li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff%2C+twitchy+or+wobbly%3A+are+GAD+antibodies+pathogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li>
<li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li>
<li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Al fine di verificare ipotesi circa molecole specifiche e la loro espressione, altri geni e vettori sono comunemente trasfettati in cellule. L&#39;aspetto unico di questo procedimento è la possibilità di trasfettare facilmente anticorpi nelle cellule bersaglio. Abbiamo eseguito questo metodo in cinque esperimenti separati ciascuno in duplicati. Risultati di efficienza di trasfezione erano simili in tutti gli esperimenti. Soprattutto, il metodo permette l&#39;inserimento di anticorpi nella cellula senza alterare la strut...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Fluorescente Microscopio AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> AxioVision versione 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> Marcato con FITC anti-Rigg </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS estere </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-DeliverIN </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10% FBS antibiotici +1% </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lisina 8 pozzetti Cultura Slides </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Scientifico Industries Inc </td><td> Modello 151 </td></tr><tr><td> DAPI Montaggio supporti </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dializzatore </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldeide (4% soluzione) </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

trasfezione anticorpo in neuroni come strumento per studiare patogenesi della malattia

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Anticorpi fornire la capacità di ottenere informazioni romanzo in vari eventi che si svolgono in sistemi viventi. La capacità di produrre anticorpi altamente specifici per le proteine ​​bersaglio ha consentito di questioni biologiche molto precise da affrontare. Soprattutto, gli anticorpi sono stati implicati nella patogenesi di numerose malattie umane comprendenti lupus eritematoso sistemico (SLE), artrite reumatoide (RA), sindromi paraneoplastiche, sclerosi multipla (SM) e umane T linfotropico virus di tipo 1 (HTLV-1) mielopatia associata / paraparesi spastica tropicale (HAM / TSP) 1-9. Come anticorpi causano la malattia è una zona di un&#39;indagine in corso, ed i dati suggeriscono che le interazioni tra gli anticorpi e molecole intracellulari vari risultati in infiammazione, alterazione cellulare di messaggistica, e l&#39;apoptosi 10. E &#39;stato dimostrato che i pazienti con SM e HAM / TSP produrre autoanticorpi al intracellulare di RNA binding protein proteine ​​eterogenee ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Dati recenti indicano che gli anticorpi per intra-neuronale e antigeni di superficie sono patogeni 3, 5-9, 11. Pertanto, un procedimento che consente lo studio di anticorpo intracellulare: proteina presterebbe grande intuizione patogenesi della malattia. I geni sono comunemente trasfettati in cellule primarie e linee cellulari in coltura, tuttavia trasfezione in cellule di anticorpi è stato ostacolato dalla alterazione della struttura anticorpo o scarsa efficienza di transfezione 12. Altri metodi di trasfezione includono trasfezione anticorpo basato su liposomi cationici (costituito DOTAP / DOPE) e polyethylenimines (PEI), entrambi i quali ha determinato un decremento di dieci volte nella trasfezione anticorpo rispetto ai controlli 12. Il metodo eseguito nel nostro studio è simile a lipidi cationici-mediate metodi e utilizza una base lipidica meccanismo per formare non covalenti complessi con gli anticorpi attraverso elettrostatica e hydrinterazioni ophobic 13. Abbiamo utilizzato Ab-DeliverIN reattivo, che è una formulazione lipidica in grado di catturare anticorpi attraverso interazioni elettrostatiche e idrofobi non-covalenti e depositarli all&#39;interno delle cellule. Così chimica e genetica accoppiamenti non sono necessari per la consegna di anticorpi funzionali nelle cellule viventi. Questo metodo ci ha permesso di eseguire l&#39;analisi degli anticorpi vari esperimenti e localizzazione della proteina, così come le analisi delle conseguenze molecolari di anticorpi intracellulari: interazioni delle proteine ​​9. In questo protocollo, si mostrerà come trasfettare anticorpi in neuroni rapida, riproducibile e con un elevato grado di efficienza di trasfezione. A titolo di esempio, useremo anticorpi anti-hnRNP A1 e anti-IgG. Per la quantificazione facile di efficienza di trasfezione abbiamo utilizzato anticorpi anti-A1 hnRNP etichettati con Atto-550-NHS e marcato con FITC IgG. Atto550 NHS è una nuova etichetta ad alto assorbimento molecolare e quantistica yiELD. Fonte di eccitazione e filtri fluorescenti per Atto550 sono simili a Cy3 (Es. 556 Em. 578). Inoltre, Atto550 ha fotostabilità alta. Marcato con FITC IgG sono stati utilizzati come controllo per dimostrare che questo metodo è versatile e non tingere dipendente. Questo approccio e i dati generati aiuterà nella comprensione del ruolo che gli anticorpi per antigeni bersaglio intracellulare potrebbe svolgere nella patogenesi delle malattie umane.

Un approccio rapido per investigare le interazioni e gli effetti sui meccanismi molecolari legati alla presenza di anticorpi in un ambiente intracellulare viene descritto. Il metodo comporta la transfezione di anticorpi nelle cellule vive utilizzando un non-covalente formazione del complesso basato su una formulazione lipidica. La tecnica è adattabile a linee cellulari immortalizzate e cellule primarie.

Trasfezione anticorpo in neuroni come strumento per studiare patogenesi della malattia

Gli anticorpi offrono la possibilità di acquisire nuove conoscenze su vari eventi che avvengono nei sistemi viventi. La capacità di produrre anticorpi altamente specifici...

Lo scopo di questa procedura è fornire un approccio rapido e riproducibile per studiare come gli anticorpi, i meccanismi molecolari autoimmuni legati alla funzione neuronale e la patogenesi delle malattie neurologiche. In primo luogo, gli anticorpi vengono marcati con un'etichetta fluorescente ATO five 50 NHS. Successivamente, gli anticorpi vengono mescolati con il reagente di trasfezione e quindi trasfettati in cellule neuronali.In coltura, 48 ore dopo la trasfezione, i neuroni vengono fissati e montati con mezzo DPI e visualizzati mediante microscopia a immunofluorescenza. L'efficienza di trasfezione può essere calcolata utilizzando un software di analisi delle immagini. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nelle neuroscienze e nella neuroimmunologia, ad esempio in che modo gli autoanticorpi alterano i meccanismi molecolari legati alla funzione neuronale e alla patogenesi delle malattie neurologiche mediate dal sistema immunitario.L'idea di questo metodo è nata quando abbiamo voluto verificare l'ipotesi che gli anticorpi contro h e RPA uno e la proteina legante l'RNA, sovraespressa nei neuroni, contribuissero al meccanismo di neurodegenerazione. La procedura sarà illustrata da Josh Douglas, uno studente laureando. Prima di iniziare la procedura, assicurarsi che il giorno precedente l'esperimento siano disponibili cellule neuronali integre di alta qualità, seminate a 100.000 cellule per pozzetto e con una confluenza di almeno l'80%. Nel giorno del saggio, osservare le cellule per verificare che siano sane.Iniziare preparando 0,1 mil di tampone di bicarbonato di sodio mescolando 8,4 grammi di bicarbonato di sodio e 29,2 grammi di cloruro di sodio in un litro di acqua. Successivamente, regolare il pH del tampone a 8,4 aggiungendo 500 microlitri di tampone. Aggiungere 70 microlitri dell'anticorpo da trasfettare, in questo caso anti H-N-R-N-P-A uno, e 35 microlitri del reagente di marcatura qui a oh cinque 50 NHS.Ruotare la soluzione a temperatura ambiente per un'ora, quindi iniettarla in un dializzatore e dializzare in due litri di PBS a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare una colonna centrifuga per concentrare l'anticorpo marcato dializzato. Infine, determinare la concentrazione dell'anticorpo mediante uno spettrofotometro NanoDrop.In una piastra a otto pozzetti, seminare 10.000 cellule per pozzetto in un volume di 500 microlitri di DMEM completo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte o fino a quando la confluenza cellulare raggiunge almeno il 70%. Una volta che le cellule sono confluenti al 70%, iniziare la procedura mescolando due microlitri di anticorpo, aggiungendo i reagenti di trasfezione e due microgrammi di anticorpo marcato a 0,5 microgrammi per microlitro in un eppendorf e incubare la soluzione da 10 a 15 minuti a temperatura ambiente.Nel frattempo, rimuovere il mezzo SUP natum dalle pozzette della coltura cellulare e sostituirlo con esattamente 394 microlitri per pozzetta di mezzo fresco. Una volta pronto il complesso di trasfezione, aggiungere 100 microlitri di DMEM e mescolare aspirando e dispensando con una pipetta. Successivamente, aggiungere esattamente 106 microlitri di miscela di trasfezione in ogni pozzetta contenente cellule, ottenendo un volume finale di 500 microlitri per pozzetta.Assicurarsi di includere una pozzetta di controllo negativo NON TRASFEZIONATA in cui viene aggiunto DMEM invece dell'anticorpo. Incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius. Al termine di questa incubazione, sostituire il mezzo con DMEM fresco ed eseguire l'immagine in tempo reale utilizzando un microscopio a fluorescenza 48 ore dopo l'etichettatura.Per visualizzare l'ATO cinque anticorpi marcati NHS 50, utilizzare il filtro SI tre dopo l'acquisizione in tempo reale; aspirare il mezzo e fissare le cellule aggiungendo paraformaldeide al 4% e incubando il vetrino per 15 minuti a temperatura ambiente. Una volta fissate le cellule, lavarle quattro volte in PBS, prevedendo un periodo di incubazione di cinque minuti in PBS per ogni lavaggio. Successivamente, rimuovere il PBS e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio contenente DPI.Per ciascun campione, posizionare delicatamente un coprioggetto sopra le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza. Iniziare l'acquisizione delle immagini cellulari. In questo esperimento, abbiamo eseguito con successo l'acquisizione in tempo reale mediante microscopia a fluorescenza di neuroni transfettati con anticorpi anti H-N-R-N-P-A1 marcati con ATO cinque 50 NHS.Questa immagine mostra anticorpi all'interno delle cellule neuronali, inclusi i processi citoplasmatici neuronali, nonché la fissazione nucleare e la colorazione nucleare. L'uso del DPI, mostrato qui in blu, permette di determinare l'efficienza di trasfezione dividendo il numero di cellule trasfettate per il numero totale di cellule. In questo caso, l'efficienza è del 50% seguendo questa procedura.Altri metodi come immunoistochimica, estrazione di RNA, analisi con micromatrici e western blot possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come la codistribuzione di anticorpi all'interno degli organelli cellulari, nonché i cambiamenti nella funzione e integrità neuronale legati alla specificità dell'anticorpo per l'antigene bersaglio. In questo video, abbiamo mostrato come marcare gli anticorpi con un marcatore fluorescente, preparare un complesso tra il reagente di trasfezione e gli anticorpi marcati fluorescentemente, trasfettare i neuroni e calcolare l'efficienza di trasfezione. Questo metodo è utile per valutare in che modo gli autoanticorpi influenzano le funzioni cellulari come la vitalità, l'apoptosi, il trasporto neuronale, nonché i meccanismi molecolari legati alla funzione neuronale e alla patogenesi delle malattie neurologiche.

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Questo video mostra il processo di trasduzione di cellule neuronali umane con un lentivirus che codifica per una proteina tau umana mutante marcata con proteina fluorescente gialla (YFP) per studiare l'aggregazione proteica. Delinea i passaggi dall'ingresso virale all'espressione della tau mutante, culminando nella formazione di aggregati tau citoplasmatici visibili nei neuroni.

Trasduzione lentivirale-mediata di neuroni umani per l'analisi dell'aggregazione della proteina tau

Qui dimostriamo una tecnica per la trasduzione neuronale diffusa mediante iniezione intraventricolare di virus adeno-associato nel cervello del topo neonatale.  Questo metodo fornisce un modo rapido e semplice per ottenere l'espressione permanente dei transgeni veicolati viralmente.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

Il controllo dell'espressione proteica non è solo essenziale per ogni organismo vivente, ma anche un'importante strategia per studiare le funzioni proteiche nei modelli cellulari. Il protocollo presentato mostra l'applicazione dell'interferenza anticorpale nelle cellule di mammifero, compresi i neuroni primari dell'ippocampo, e dimostra l'uso di ricostruzioni tridimensionali nello studio della funzione delle proteine.

Studiando la funzione delle proteine ​​e il ruolo di Altered espressione della proteina da anticorpo interferenza e ricostruzioni tridimensionali

Questo manoscritto descrive come la consegna genica locale mediata da vettori virali fornisca un modo attraente per esprimere i transgeni nel sistema nervoso centrale.  Il protocollo delinea tutti i passaggi cruciali per eseguire un'iniezione di vettore virale nella substantia nigra del ratto per sviluppare un modello animale basato su vettore virale per la malattia di Parkinson.

Sviluppo di un Rat modello Alfa-sinucleina per la malattia di Parkinson mediante iniezione stereotassica di un ricombinante vettore virale adeno-associato

L'iniezione intraspinal di recombinase dipendente ricombinanti virus adeno-associato (rAAV) può essere utilizzato per manipolare qualsiasi tipo di cellula geneticamente etichettati nel midollo spinale. Qui descriviamo come trasduce neuroni nel corno dorsale del midollo spinale lombare. Questa tecnica consente funzionale interrogatorio del sottotipo del neurone manipolati.

Espressione del Transgene di mediata da Virus adeno-associato in neuroni geneticamente definiti del midollo spinale

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un sistema basato su cellule che replica la formazione dell'alfa-synuclein aggrega in vivo. Le inclusioni intracellulari dell'alfa-synuclein sono seminate in neuroni primari di interiorizzazione e propagazione di esogeno somministrato del microsomi nativo con alfa-synuclein aggregati isolati da topi transgenici malato dell'alfa-synuclein.

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

L'obiettivo di questa tecnica è quello di preparare una cultura altamente arricchita dei motoneuroni primari (MNs) da murino del midollo spinale. Per valutare le conseguenze delle mutazioni che causano malattie MN, descriviamo qui l'isolamento di questi isolati MNs e loro transfezione di magnetofection.

Malattia di Charcot-Marie-Tooth In Vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del Mouse

Questo protocollo descrive una procedura in cui le colture neuronali umane vengono trasmutate con costrutti lentivirali che codificano per i Tau umani. Le colture traslegate mostrano aggregati Tau e patologie associate.

Un modello in vitro per lo studio dell'aggregazione Tau utilizzando la trasduzione dei neuroni umani mediata da lentivirali

L'encefalite autoimmune è una nuova categoria di malattie mediate da anticorpi del sistema nervoso centrale. I neuroni ippocampali possono essere utilizzati per scoprire e caratterizzare questi anticorpi. Questo articolo fornisce un protocollo per la coltura cellulare primaria e l'immunocolorazione per determinare gli autoanticorpi nel siero e nel liquido cerebrospinale dei pazienti.

Colture neuronali ippocampali per rilevare e studiare nuovi anticorpi patogeni coinvolti nell'encefalite autoimmune

Qui, dimostriamo come combinare la trasfezione di neuroni primari di roditori ippocampali con l'imaging confocale su cellule vive per analizzare gli effetti patologici indotti dalle proteine sul trasporto assonale e identificare percorsi meccanicistici che mediano questi effetti.

Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

Impara la trasfezione di anticorpi in neuroni per studiare la patogenesi delle malattie neurologiche. Questo metodo rapido e riproducibile utilizza microscopia a immunofluorescenza per analizzare gli effetti degli autoanticorpi sulle funzioni cellulari.

Trasfezione anticorpo in neuroni come strumento per studiare patogenesi della malattia

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