Profiling completa del regolamento dopamina nel substantia nigra e ventrale tegmentale Area

L'obiettivo generale di questa procedura è massimizzare l'informazione delle letture molecolari associate alla regolazione della dopamina da una singola dissezione tissutale dalle regioni somatodendritiche della pioggia mesencefalica. Ciò si ottiene effettuando prima una dissezione precisa per segregare la nigra sostanziale dall'area segmentale ventrale. La seconda fase consiste nell'elaborare i tessuti per l'analisi della dopamina mediante HPLC e l'ulteriore elaborazione della proteina endogena precipitata per l'analisi.

Successivamente, l'elaborazione della proteina precipitata per il contenuto proteico totale consente di determinare quali proteine che regolano la dopamina o la fosforilazione delle proteine possono essere misurate insieme alla lettura del contenuto tissutale di dopamina nel campione. In definitiva, le analisi della dopamina e delle sue proteine regolatrici nel mesencefalo discreto. Le regioni dendritiche somatosi consentono di trarre conclusioni sui meccanismi molecolari associati alla regolazione della dopamina.

Le monoamine influenzano molti esiti comportamentali, e in effetti i ricercatori nel campo delle dipendenze, della biologia e della disfunzione locomotoria, come in particolare nel morbo di Parkinson, sono molto interessati a come i mezzi mono come la dopamina, che studiamo nel mio laboratorio, influenzino gli esiti comportamentali. Ma l'importanza di studiare i mezzi mono può essere ulteriormente abbellita se comprendiamo come sono regolati a livello molecolare. Il vantaggio della nostra tecnica è che possiamo prelevare da un singolo campione ottenuto dal tessuto del SNC, più letture da quel campione in modo da poter ottenere una lettura completa di come gli eventi molecolari influenzano la disregolazione dei mezzi mono.

Possiamo prendere quei dati e poi inserirli nel contesto di come il comportamento sarà influenzato. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la determinazione delle proteine e la fosforilazione richiedono la conoscenza della quantità di proteine totali necessarie per una lettura accurata a seconda degli anticorpi scelti dallo sperimentatore. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

Le tecniche di dissezione e la determinazione dei mono mezzi con le proteine regolatrici è un approccio relativamente nuovo all'analisi della regolazione in vivo. Per iniziare questa procedura, raffreddare la matrice cerebrale del roditore, una capsula di Petri contenente cinque rasoi e un bisturi numero 11 su un letto di ghiaccio bagnato. Inoltre, pre-raffreddare tutti i tubi necessari per la dissezione su ghiaccio secco.

Quindi, dopo aver sacrificato un topo, rimuovi il suo cervello e posiziona il cervello a testa in giù con il cervelletto laterale che si inserisce nelle tacche nella matrice ghiacciata. Dopo un minuto, inserire le lame di rasoio fredde nel cervello freddo, iniziando da circa due millimetri, rostrale al chiasma ottico per l'analisi dello striato e del nucleo accumbens. Quindi continuare a inserire le lame di rasoio fredde ad ogni sezione millimetrica fino a metà degli stagni successivi, scaglionare il posizionamento di ciascuna lama di rasoio per facilitare la rimozione dalla matrice.

Quando estrai i rasoi, cerca l'inizio dell'ippocampo in quanto è la migliore guida per garantire la presenza del SN e del VTA nella posizione in cui l'ippocampo avvolge completamente il mesencefalo. Prendi le sezioni con la lama del bisturi numero 11 per sezionare prima l'SN dal VTA. Rimuovere la corteccia sovrastante e l'ippocampo.

Quindi eseguire un taglio verticale separando l'area pigmentata del SN dal VTA, assicurandosi che il rasoio abbia un contatto costante con il ghiaccio umido durante la dissezione. Quindi, fai un taglio orizzontale in corrispondenza o vicino alla linea mediana, appena sopra la parte dorsale e laterale più grande del sn. Infine, allontana il SN dal resto del tronco encefalico.

Una volta rimosso il SN, allontanare il VTA dal resto del mesencefalo. Posizionare immediatamente i tessuti sezionati nelle provette per microfughe pre-raffreddate. Quindi conservare i fazzoletti a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per la lavorazione.

In questa procedura, omogeneizzare delicatamente il tessuto subito dopo la rimozione dal ghiaccio secco utilizzando una soluzione di EDTA di acido clorico a 0,1 molari ghiacciati. Successivamente, tenere nuovamente il campione su ghiaccio secco. Quindi, centrifugare i campioni a 12.000 giri/min per sedimentare.

Il pellet proteico da utilizzare per la determinazione del lotto occidentale aspira successivamente i surnatanti nel flacone HPLC. Posizionare i pellet di proteine precipitate ancora congelate derivate dal trattamento tampone HPLC sul ghiaccio umido per scongelare e assicurarsi che tutto il tampone sia stato rimosso e archiviato. Per il trattamento bilaterale del SN aggiungere 300 microlitri di SDS all'1% contenente cinque triss millimolari e un EDTA millimolare al pellet e sonicare, mentre per il trattamento bilaterale del VTA sarebbero sufficienti 200 microlitri di SDS all'1%.

Quindi, immergere i campioni nell'acqua bollente per circa cinque minuti per completare la denaturazione delle proteine. Quindi lasciarli raffreddare a temperatura ambiente, assicurarsi che i tappi siano fissati in questo passaggio. Quindi utilizzare il test BCA con un intervallo di curve standard proteiche da due a 40 microgrammi di proteine.

Per determinare la concentrazione proteica nei campioni da cinque microlitri, utilizzare il valore mediano ottenuto da un'analisi triplicato per determinare la quantità di proteine rispetto alla curva standard. Dividi il risultato per il volume del campione per la concentrazione proteica. Successivamente, preparare i campioni con il tampone del campione contenente DIO tre etolo per ridurre l'elettroforesi SDS su gel di acrilammide al 10%, se necessario, come indicato da un colore del tampone del campione.

Passare al giallo, aggiungere al campione un tris base molare pH 8,2 con incrementi di 10 microlitri fino a quando il colore blu è evidente. Per garantire un pH corretto, eseguire la quantità appropriata di proteine totali utilizzando la pagina SDS su gel di acrilammide al 10%, quindi trasferire le proteine su pori di 0,45 micron. Nitrocellulosa, impostare il serbatoio hoffer ad almeno 27 volt e consentire il trasferimento durante la notte.

Il giorno successivo, asciugare la macchia per almeno 30 minuti. Quindi macchiarlo con la soluzione di poncho S per circa cinque minuti. Successivamente, trattenerlo energicamente con una soluzione di acido cloridrico allo 0,2% fino a quando le singole bande proteiche non sono chiaramente risolte e la colorazione di fondo viene rimossa.

Quindi ottenere un'immagine della colorazione S del poncho utilizzando l'immagine J al fine di quantificare ulteriormente i carichi proteici relativi in ciascuna corsia e normalizzare i risultati della tirosina idrossilasi, del trasportatore della dopamina o del trasportatore vescicolare delle monoammine due mostrati qui è il western blot della tirosina idrossilasi siriana 31 fosforilata nei campioni di nigra sostanziale di ratto. La curva standard della tirosina idrossilasi siriana 31 fosforilata siriana calibrata varia da 0,3 nanogrammi a 2,0 nanogrammi e rientra nell'intervallo lineare di rilevazione. Ecco il western blot della tirosina idrossilasi siriana 40 fosforilata nei campioni tegmentali ventrali di ratto.

La curva standard calibrata SN 40 fosforilata tirosinidrossilasi varia da 0,2 nanogrammi a 1,5 nanogrammi e rientra nell'intervallo lineare di rilevazione. Mantenere una temperatura adeguata è importante, così come etichettare i tubi. È anche importante normalizzare le proteine per ridurre la varianza dei risultati.

Questo protocollo, se seguito scrupolosamente, può fornire ai ricercatori nel campo della funzione locomotiva e del comportamento di dipendenza, ampie letture molecolari che influenzano la regolazione monomedia e il cervello, in particolare la dopamina, che è ciò che ci interessa. E di conseguenza, queste letture possono fornire un'analisi molto dettagliata e approfondita di ciò che significa per i risultati comportamentali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come massimizzare le letture della regolazione delle monoammine nell'area nigra sostanziale e tegmentale ventrale da una singola dissezione tissutale.