Name: Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Impara un protocollo semplice per estrarre, visualizzare e quantificare emociti da bruchi selvaggi. Questo metodo consente di studiare le risposte immunitarie cellulari negli insetti in modo rapido ed efficace.

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TMS è stato sostenuto dalla fiducia Harlan Fellowship (GWU) nel corso di questo studio. I finanziamenti per la raccolta sul campo e allevamento L. Fasciola e E. delphinii sono state fornite dal NSF concedere DEB 0642438 al JTL.

1. Preparazione del materiale <ol><li> Preparare gli aghi (1-2 micron e punta conica 3-4 mm) con tubi in vetro borosilicato capillari nonché di un estrattore micropipetta. Le impostazioni dello strumento: a terra: 561, velocità: 20; calore: 560; ritardo: 1; tiro: 100; Pressione: 500. </li><li> Preparare la soluzione di raccolta: 60% del Medio Grace (GM) integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 20% di tampone di anticoagulante (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA e 41 mM di acido citrico, pH 4,5 ). La suddetta soluzione è preparato fresco in condizioni sterili e mantenuto in ghiaccio in ogni momento. </li><li> Preparare la soluzione tampone di incubazione: 90% di GM integrato con 10% di FBS. Questa soluzione è anche preparato fresco e mantenuto in ghiaccio in ogni momento. </li><li> Preparare un totale di almeno 15 microlitri × il numero di insetti sia per la raccolta e le soluzioni di incubazione. </li></ol> 2. Iniezione di bruchi con Collection Solution <ol><li> Anestetizzare ins penultimelarve tar da raffreddamento in ghiaccio per 20 minuti prima dell&#39;estrazione hemocyte. </li><li> Montare la punta di un ago capillare (calibro 16) nel tubo che è collegato ad una siringa da 20 ml di vetro (Figura 2). Lasciare il tubo contenente la soluzione di raccolta aperto sul banco di laboratorio e riempire lentamente il capillare con il buffer. Il capillare è generalmente riempito con circa 10-15 ml di soluzione di raccolta, a seconda delle dimensioni del bruco (circa 1 ul di soluzione per 10 mg di massa corporea caterpillar totale = 0,01% della massa totale del corpo). Appoggiare l&#39;ago su una palla di argilla che si trova accanto al microscopio da dissezione. </li><li> Posizionare il bruco in una capsula di Petri. L&#39;insetto deve essere posizionato su un lato in modo che gli spiracoli sono chiaramente visibili (Figura 3). </li><li> Durante la visualizzazione sotto un microscopio da dissezione, tenere il bruco in posizione con una pinza e posizionare il ago vicino ad una delle spiracoli, in cui lacuticola setta è generalmente più dolce. Premere delicatamente l&#39;ago capillare contro il corpo dell&#39;insetto. Una volta che l&#39;ago è penetrato nella cuticola, iniettare il volume totale della soluzione nel bruco (Figura 3). E &#39;importante evitare l&#39;iniezione di bolle d&#39;aria nel bruco. Il corpo del bruco si gonfiano (ad esempio, aumento del volume del 20%) in seguito a iniezione, ma non dovrebbe scoppiare o trasudano. </li><li> Tornare il bruco al ghiaccio, posizionando l&#39;insetto dorsalmente per impedire tampone di fuoriuscire dalla ferita (Figura 3). </li><li> Ripetere i passaggi 2,1-2,4 per ogni caterpillar usato per l&#39;estrazione emolinfa. In questa fase, tutti gli insetti consentono di raffreddare in ghiaccio per 30 minuti prima di procedere. </li></ol> 3. Estrazione di emociti <ol><li> Posizionare il bruco in una capsula Petri sotto il microscopio da dissezione. </li><li> Fai un poco profondo (2-3 mm di lunghezza) incisione nella regione posteriore del bruco con un Scalpe sterile<html> l (Figura 3). Fare attenzione a non danneggiare l&#39;intestino o di altri organi interni, l&#39;obiettivo è quello di perforare la cuticola con attenzione e raccogliere il buffer / emolinfa mix contenente emociti dagli insetti individuali. </li><li> Premere il bruco delicatamente con pinze flessibili in plastica, mentre la raccolta del mix emolinfa (circa il 10-20 pl), con una punta di 10 microlitri pipetta, ancora una volta facendo attenzione a non danneggiare i tessuti interni (Figura 3). Emolinfa è raccolto dalla gocciolina spremuto dal corpo del bruco. Eliminare il caterpillar i resti. </li><li> Raccogliere emolinfa da ogni singolo bruco in distinte provette etichettate siliconato 0,5 ml microcentrifuga. </li><li> Aggiungere uguale volume della soluzione di incubazione (circa 10-20 microlitri) di ciascun campione emolinfa raccolti da un individuo bruco. Tenere campioni emolinfa su ghiaccio in ogni momento. </li><li> Ripetere i passaggi 3,1-3,5 per ogni caterpillar utilizzato per l&#39;esperimento. </li></ol>Le &quot;&gt; 4. Quantificazione di emociti <ol><li> Mescolare il campione e la soluzione emolinfa incubazione immediatamente prima emociti conteggio. Questo trattamento consente un&#39;adeguata separazione delle emociti e previene formazione di grumi. </li><li> Utilizzare una pipetta pulita per trasferire 10 microlitri di campione emolinfa miscelata con la soluzione di incubazione su un emocitometro. </li><li> Utilizzando un microscopio composto, contare e registrare il numero di emociti in almeno 15 dei quadrati grandi (area del quadrato uno: 0,04 mm 2, profondità: 0,1 mm) della griglia centrale del emocitometro (Figura 3). Aggiungere questi valori per ottenere una somma totale del numero di emociti nei 15 quadrati. </li><li> Sciacquare il emocitometro e la sua slitta coperchio a fondo utilizzando una bottiglia di lavaggio con acqua distillata e deionizzata e asciugare con Kimwipes (Kimberly-Clark) tra ogni campione. </li><li> Ripetere i passaggi 4,1-4,4 per ogni campione emolinfa. </li><li> Calcolare il numero medio di emociti per ml di emolinfa volume per ogni caterpillar, come segue: </li></ol> Il volume totale di ciascun quadrato della griglia emocitometro: (0,04 mm 2 zona) × (0,1 mm di profondità) = 0,004 mm 3 × 15 caselle = 0,06 mm 3 = il volume totale di tutti i 15 quadrati contati. (Somma del numero totale di emociti nei 15 quadrati contati / il volume totale di tutti i 15 quadrati contati) x 2 = fattore di diluizione del numero di emociti / mm 3 x 1.000 = il numero di emociti / ml di emolinfa.

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<li>Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hemocyte+counts+with+different+developmental+parameters+during+the+last+larval+instar+of+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63(2008).</li>
<li>Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects%2C+nematodes+and+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695(2010).</li>
<li>Qayum, A. A., Telang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+Collecting+and+Staining+Hemocytes+from+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti.</a> J. Vis. Exp. (51), e2772(2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Metodi per l&#39;estrazione di emociti da insetti clinicamente importanti lepidotteri e insetti modello sono stati precedentemente segnalati 9, 14. Metodi di estrazione Hemocyte sono adattati a seconda delle specie di insetti, lo stadio di sviluppo dell&#39;insetto e le sue caratteristiche morfologiche. Per esempio, l&#39;isolamento emolinfa da larve Manduca può essere facilmente eseguita tagliandoli corno curvo vicino all&#39;estremità dell&#39;addome 15. Perché bruchi slug (Limacodidae) ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Micropipetta estrattore </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi di vetro borosilicato </td><td> Sutter Instruments </td><td> B100-50-10 </td><td> OD: 1.0, ID: 0.50 mm </td></tr><tr><td> Media di Grace </td><td> Sigma </td><td> G8142 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3007102 </td><td> Inattivato al calore </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinze </td><td> Strumenti per le scienze Belle </td><td> 11252-40 </td><td></td></tr><tr><td> Neubauer emocitometro </td><td> Hausser scientifico </td><td> 3200 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi di plasticang </td><td> Tri-Tech </td><td> TT-3-32OD </td><td> OD: 3/32&#39;&#39;, ID: 1/32 &#39; </td></tr><tr><td> Vetro medico siringa </td><td> Fortuna Optima </td><td> D-97.877 </td><td> 50 ml di volume </td></tr><tr><td> &#39;Ago Blunt </td><td> Piccole parti </td><td> NE-162PL-25 </td><td> Calibro 16 x 1 &quot;lunghezza </td></tr></tbody></table>

un protocollo semplice per estrazione emociti da bruchi selvaggi

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Emociti insetti (equivalente a mammiferi globuli bianchi) svolgono un ruolo importante in diversi processi fisiologici durante tutto il ciclo di vita di un insetto 1. Negli stadi larvali di insetti appartenenti agli ordini dei Lepidotteri (farfalle e falene) e Ditteri (mosche vere), emociti sono formate dalla ghiandola linfatica (un organo specializzato ematopoietiche) o cellule embrionali e possono essere trasportati fino alla fase adulta. Emociti embrionali sono coinvolti nella migrazione cellulare durante la regolazione dello sviluppo e chemiotassi durante l&#39;infiammazione. Hanno anche prendere parte a apoptosi delle cellule e sono essenziali per embriogenesi 2. Emociti mediare il braccio cellulare dell&#39;insetto risposta immunitaria innata che include diverse funzioni, come la cella di diffusione, aggregazione cellulare, formazione di noduli, la fagocitosi e l&#39;incapsulamento di invasori stranieri 3. Essi sono anche responsabili per orchestrare specifiche difese insetto umorali durante l&#39;infezione, come la produzione di peptidi antimicrobici e altre molecole effettrici 4, 5. Hemocyte morfologia e funzione sono principalmente stato studiato in modelli genetici insetti o fisiologico, compresa la mosca della frutta, Drosophila melanogaster 6, 7, le zanzare Aedes aegypti e Anopheles gambiae 8, 9 e il hornworm tabacco, Manduca sexta 10, 11. Tuttavia, esistono scarse informazioni attualmente circa la diversità, la classificazione, la morfologia e la funzione di emociti in non-modello di specie di insetti, in particolare quelli raccolti in natura 12. Qui si descrive un protocollo semplice ed efficiente per l&#39;estrazione di emociti da bruchi selvatici. Usiamo penultimo instar Lithacodes fasciola (giallo-spalle falena slug) (Figura 1) e Euclea delphinii (spinoso slug rovere) bruchi (Lepidoptera: Limacodidae) e mostrare che i volumi sufficienti di emolinfa (sangue degli insetti)può essere isolato e numeri hemocyte contati da larve individuale. Questo metodo può essere usato per studiare efficientemente tipi hemocyte in queste specie così come in altri bruchi di lepidotteri correlati raccolti dal campo, oppure può essere facilmente combinati con analisi immunologiche destinati a studiare la funzione hemocyte dopo infezione microbica o organismi parassitari 13.

Il protocollo qui descritto consente la raccolta di un volume minimo di 10-20 ml di emolinfa insetto da bruchi individuali. Emociti raccolti con questo metodo sono privi di aggregazione cellulare, difetti melanizzazione, frammenti di tessuto o altri contaminanti. Pertanto emociti possono essere facilmente osservati e contati al microscopio, e diversi insetti può essere osservato in un Hosur pochi. Abbiamo osservato che la maggior parte dei emociti nei nostri campioni erano plasmatocytes 3 ​​(emociti diffusion...

Emociti insetti svolgere molte funzioni importanti, sia immunitarie e non immunitarie, durante tutte le fasi di sviluppo degli insetti. La nostra attuale conoscenza dei tipi di hemocyte e la funzione viene da studi su insetti modelli genetici. Qui vi presentiamo un metodo per l&#39;estrazione, la quantificazione e la visualizzazione di emociti da bruchi selvatici.

Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi

Gli emociti degli insetti (equivalenti ai globuli bianchi dei mammiferi) svolgono un ruolo importante in diversi processi fisiologici durante l'intero ciclo vitale di un insetto...

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre, visualizzare e contare gli emiociti da bruchi selvatici. Questo viene ottenuto anestetizzando prima il bruco ponendolo sul ghiaccio, iniettandolo con una soluzione tampone contenente un anticoagulante e riportando il bruco sul ghiaccio per permettere agli emiociti di rientrare in circolazione prima dell'estrazione. Il secondo passaggio consiste nel praticare un'incisione superficiale all'estremità posteriore del bruco utilizzando un bisturi pulito.Successivamente, il bruco viene delicatamente compresso utilizzando pinzette morbide. Quindi, la miscela di linfa ematica e soluzione tampone viene aspirata mediante una micropipetta e raccolta in un tubo da microcentrifuga. L'ultimo passaggio consiste nel mescolare delicatamente la soluzione di linfa ematica con un volume uguale di soluzione tampone e trasferire 10 microlitri della soluzione su un emocitometro per visualizzare e contare il numero di ematociti.In definitiva, questo metodo di estrazione degli emo citi può essere utilizzato come un approccio rapido ed efficace per contare gli emoci da diverse specie di bruchi e conservarli come strumento per esaminare gli aspetti fisiolog

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Questo video dimostra come ottenere ematociti concentrati (cellule del sangue) dal hawaiano bobtail...

Ottenere ematociti concentrati dal hawaiano Bobtail Squid Euprymna scolopes L&#39;osservazione e la loro aderenza ai batteri simbionti e non Symbiotic

Un semplice ma accurato metodo per raccogliere e macchia ematociti concentrati zanzara è descritto. Il nostro metodo combina la semplicità di perfusione con la precisione delle tecniche di iniezione ad alta isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati in Aedes zanzare. Questo metodo facilita la conoscenza di studi che richiedono i tipi di ematociti concentrati e la loro abbondanza.

Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti</em

Questo video descrive la ghiandola linfatica di Drosophila, il sito primario dell'emopoiesi nella larva di mosca, e mostra un esempio di protocollo per sezionare e montare l'organo per l'immunoistochimica e l'imaging fluorescente.

Dissezione della ghiandola linfatica larvale: isolamento dell'organo produttore di emociti della Drosophila

L'emolinfa di Drosophila funge sia da sangue che da liquido interstiziale, circolando in tutto il corpo durante gli stadi larvali e adulti. Questo video descrive un protocollo per raccogliere l'emolinfa larvale al fine di quantificare le cellule circolanti.

Rottura delle cuticole: un metodo per raccogliere l'emolinfa dalle larve di Drosophila

Questo video dimostra il test di disturbo dell'emocita, valutando la riadesione degli emociti nelle tasche ematopoietiche delle larve di Drosophila. Il disturbo meccanico rilascia gli emociti residenti, aumentando la conta degli emociti circolanti. Dopo il recupero, la riaderenza degli emociti residenti è confermata, illustrando la reversibilità.

Un test di disturbo degli emociti per valutare la riadesione degli emociti alle tasche ematopoietiche

Le cellule del sangue di Drosophila, o emociti, si alternano tra i siti residenti e la circolazione.  Nella larva, gli emociti residenti (sessili) si localizzano in microambienti induttivi, le tasche ematopoietiche, mentre gli emociti circolanti si muovono liberamente nell'emolinfa. L'obiettivo di questo protocollo è l'isolamento e la quantificazione standardizzati di queste due popolazioni di emociti, comportamentali distinte ma interscambianti.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Sistemi ematopoietiche mammiferi Drosophila e condividono molte caratteristiche comuni, rendendo Drosophila un modello genetico interessante per lo studio ematopoiesi. Qui mostriamo dissezione e montaggio del grande organo ematopoietico larvale per immunoistochimica. Descriviamo anche metodi per saggiare i vari compartimenti ematopoietici larvali tra emociti circolanti e le cellule di cristallo sessili.

I metodi per esaminare le ghiandole linfatiche e ematociti concentrati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

L'analisi di tick emolinfa rappresenta un'importante fonte di informazioni su come alcuni patogeni causano malattie e come le zecche rispondono immunologicamente a questa infezione. Il presente studio dimostra come inoculare propagule fungine e raccogliere emolinfa da Rhipicephalus MicroPlus femmine gonfio.

Rivelare la raccolta di hemolymph e l'inoculo di Metarhizium blastospores in Rhipicephalus MicroPlus zecche verso gli studi di patologia degli invertebrati

Qui, presentiamo protocolli per 1) la propagazione in cattività di laboratorio della farfalla blu di Miami in pericolo federale (Cyclargus thomasi bethunebakeri),e 2) valutando le informazioni di base sulla storia della vita come il tempo di sviluppo immaturo e il numero di stadi larvali. Entrambi i metodi possono essere adattati per l'uso con altri programmi di conservazione ex situ.

Programmi di propagazione captive farfalla a rischio per migliorare la conoscenza della storia della vita e le tecniche efficaci di conservazione ex Situ

Descriviamo un metodo per raccogliere in modo efficiente l'emolinfa quantificabile da piccoli artropodi per analisi successive.

Un metodo preciso e quantificabile per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi

Impara un protocollo semplice per estrarre, visualizzare e quantificare emociti da bruchi selvaggi. Questo metodo consente di studiare le risposte immunitarie cellulari negli insetti in modo rapido ed efficace.

Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi

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