Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi
15 novembre 2012
Emociti insetti svolgere molte funzioni importanti, sia immunitarie e non immunitarie, durante tutte le fasi di sviluppo degli insetti. La nostra attuale conoscenza dei tipi di hemocyte e la funzione viene da studi su insetti modelli genetici. Qui vi presentiamo un metodo per l'estrazione, la quantificazione e la visualizzazione di emociti da bruchi selvatici.
L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre, visualizzare e contare i citi he dai bruchi selvatici. Ciò si ottiene anestetizzando prima il bruco posizionandolo sul ghiaccio, iniettandolo con una soluzione tampone contenente un anticoagulante e rimettendo il bruco nel ghiaccio per consentire ai cititi di rientrare in circolo prima dell'estrazione. Il secondo passo consiste nel praticare un'incisione poco profonda all'estremità posteriore del bruco utilizzando un bisturi pulito.
Successivamente, il bruco viene schiacciato delicatamente utilizzando una pinza morbida. Quindi la soluzione tampone emo-linfa viene aspirata utilizzando una micropipetta e raccolta in una provetta da microcentrifuga. Il passaggio finale consiste nel mescolare delicatamente la soluzione di emolinfa con un volume uguale di soluzione tampone e trasferire 10 microlitri di soluzione su un emocitometro per visualizzare e contare il numero di citi.
In definitiva, questo metodo di estrazione degli emociti può essere utilizzato come metodo rapido ed efficace per contare i citi di varie specie di bruchi e conservarlo come strumento per esaminare gli aspetti fisiologici della risposta immunitaria cellulare degli insetti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per estrarre emosots da bruchi con prossimità molto ridotta. Altri modelli di bruchi vengono dissanguati tagliando uno dei pro, unex estraendo i citi dal liquido che fuoriesce.
Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata per estrarre l'emotipo da altre specie di insetti. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo dell'ecoimmunologia, come ad esempio il modo in cui la risposta immunitaria cellulare degli insetti varia con la qualità della dieta, lo stadio di sviluppo o l'esposizione a diversi agenti patogeni. Per iniziare questa procedura, anestetizzare le larve del penultimo stadio raffreddandole su ghiaccio per 20 minuti prima dell'estrazione degli emociti.
Successivamente, inserire l'estremità smussata di un ago capillare pulito da 16 gauge nel tubo collegato a una siringa di vetro da 20 millilitri. Lasciare aperta la provetta contenente la soluzione di raccolta sul banco del laboratorio. Riempire lentamente il capillare con circa 10-15 microlitri di tampone.
Quindi appoggia l'ago su una palla di argilla che viene posta accanto al microscopio da dissezione. Metti il bruco in una capsula di Petri. L'insetto deve essere posizionato su un fianco in modo che le sferiche siano chiaramente visibili.
Durante l'osservazione al microscopio da dissezione, tenere il bruco in posizione con un paio di pinze e posizionare l'ago vicino a una delle sferiche dove la cuticola dell'insetto è generalmente più morbida. Quindi premere delicatamente l'ago capillare contro il corpo dell'insetto. Una volta che l'ago è penetrato nella cuticola, iniettare il volume totale di soluzione nel bruco.
Il corpo del bruco si gonfierà dopo l'iniezione, ma non dovrebbe scoppiare o trasudare. Rimetti il bruco nella capsula di Petri ghiacciata. Posizionare l'insetto dorsalmente per evitare che il tampone fuoriesca dalla ferita.
Ripetere le iniezioni per ogni bruco utilizzato per l'estrazione emofloscia. Quindi lasciare raffreddare tutti gli insetti sul ghiaccio per 30 minuti. Ora, metti il bruco in una capsula di Petri sotto il microscopio da dissezione.
Praticare con cura un'incisione poco profonda lunga circa due o tre millimetri nella regione posteriore del bruco, utilizzando un bisturi sterile senza danneggiare l'intestino o altri organi interni. Quindi, spremere delicatamente il bruco usando un paio di pinze di plastica flessibili mentre si raccolgono circa 10-20 microlitri di miscela emo floscia con un puntale per pipetta da 10 microlitri. Ancora una volta, fai attenzione a non ferire i tessuti interni.
Dopodiché, scartare i resti dei bruchi. Raccogli l'emo zoppicante da ogni bruco in provette da microcentrifuga siliconate e da 0,5 millilitri etichettate separatamente. Quindi aggiungere circa 10-20 microlitri della soluzione di incubazione a ciascun campione di emo floscio raccolto da un singolo bruco.
Tenere sempre i campioni di emolinfa sul ghiaccio in questo passaggio. Mescolare il campione di emolinfa e la soluzione di incubazione immediatamente prima del conteggio. Lui cita.
Questo trattamento consente una corretta separazione dei citi e previene la formazione di grumi. Utilizzare un puntale di pipetta pulito per trasferire 10 microlitri di campione di emolinfa mescolato con la soluzione di incubazione su un emocitometro. Quindi, utilizzando un microscopio composto, contare e registrare il numero di cita in almeno 15 dei grandi quadrati della griglia centrale dell'emocitometro.
Sommando questi valori si ottiene la somma totale del numero di emociti nei 15 quadrati. Successivamente, sciacquare accuratamente l'emocitometro e il relativo vetrino di copertura utilizzando un flacone di lavaggio con acqua distillata e deionizzata. Quindi asciugalo con le salviette Kim.
Ripetere le procedure per il resto dei campioni di emofloscio e calcolare il numero medio di he cytes per millilitro di volume emofloscio per ogni bruco. L'immagine al microscopio in campo chiaro mostra i citi di he estratti dai bruchi del nucleo hin ai con un ingrandimento di 20x. Seguendo questa procedura, gli emociti raccolti potrebbero essere utilizzati per studiare la risposta immunitaria cellulare e impostare saggi come la fagocitosi e il cap, l'incapsulamento selezionato e l'attività della pH ossidasi.
Inoltre, R-N-A-D-N-A e proteine possono essere raccolte inutilizzate per ulteriori saggi al fine di studiare la risposta immunitaria cellulare negli insetti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare i bruchi allo scopo di estrarre l'emolinfa e come raccogliere l'emolinfa contenente emociti vivi.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per estrarre, quantificare e visualizzare gli emociti da bruchi selvatici. Gli emociti svolgono ruoli fondamentali sia nelle funzioni immunitarie che in quelle non immunitarie durante lo sviluppo degli insetti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia degli insetti
- Funzione degli emociti
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Gli emociti sono fondamentali per le risposte immunitarie negli insetti.
- Comprendere i tipi di emociti aiuta nello studio della biologia degli insetti.
- Le conoscenze attuali si basano principalmente su modelli genetici.
- Questo studio si concentra su bruchi selvatici per ampliare le conoscenze esistenti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'estrazione degli emociti.
- Visualizzare gli emociti per comprendere meglio le loro funzioni.
- Quantificare gli emociti per valutarne il ruolo nella fisiologia degli insetti.
Metodi Utilizzati
- Anestetizzare i bruchi sul ghiaccio.
- Iniettare una soluzione tampone con anticoagulante.
- Eseguire un'incisione superficiale per facilitare l'estrazione degli emociti.
- Aspirare l'emolinfa e mescolarla con il tampone per l'analisi.
Risultati principali
- Estrazione e visualizzazione riuscita degli emociti.
- Quantificazione degli emociti mediante emocitometro.
- Dimostrata la fattibilità del metodo nei bruchi selvatici.
- Forniti approfondimenti sulla circolazione e la funzione degli emociti.
Conclusioni
- Il metodo consente uno studio efficace degli emociti nei bruchi selvatici.
- Migliora la comprensione delle risposte immunitarie negli insetti.
- Può essere applicato ad altre specie di insetti per studi comparativi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'estrazione e la quantificazione affidabili di emociti da bruchi selvatici permettono lo studio dei meccanismi immunitari innati in specie di insetti non modello, sostenendo la validazione precoce di bersagli nell'immunologia degli insetti. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro standardizzato per l'isolamento delle cellule immunitarie, facilitando studi comparativi e saggi funzionali rilevanti per la ricerca traslazionale e l'eco-immunologia. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nella caratterizzazione della risposta immunitaria, informando decisioni basate sulla valutazione del rischio nei percorsi di scoperta che coinvolgono modelli di insetti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della diversità e della funzione delle cellule immunitarie negli insetti di specie non modello.
- Supporta la riduzione dei rischi biologici fornendo accesso a cellule immunitarie primarie per studi meccanicistici.
- Facilita la validazione funzionale delle proteine bersaglio mediante saggi immunologici successivi.
- Migliora la fiducia predittiva delle ipotesi relative alle risposte immunitarie nella ricerca sugli insetti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara campioni validati di emociti per saggi immunitari quantitativi e funzionali.
- Standardizza l'estrazione e il conteggio cellulare, favorendo la riproducibilità tra esperimenti.
- Consente la preparazione scalabile di emociti per lo screening degli effetti di patogeni o composti.
- Fornisce un numero affidabile di cellule per la normalizzazione dei saggi e l'analisi comparativa.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea agli studi di eco-immunologia consentendo il profilo immunitario in popolazioni selvatiche.
- Supporta la continuità dal campionamento sul campo a saggi funzionali basati su laboratorio.
- Facilita l'avanzamento di modelli di insetti adeguati al rischio per la ricerca traslazionale.
- Fornisce una riduzione del rischio di tipo meccanicistico per gli studi sulla modulazione immunitaria e sull'interazione con patogeni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di estrazione degli emociti si colloca all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e lo sviluppo di saggi, consentendo studi ipotesi-guidati sulle cellule immunitarie in modelli di insetti selvatici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla diversità e funzione delle cellule immunitarie in insetti non modello.
- Screening: Fornisce preparazioni standardizzate e quantitative di emociti per saggi immunitari successivi.
- Analisi: Fornisce conteggi cellulari e dati morfologici per confrontare le risposte immunitarie in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il campionamento sul campo con il profilo immunitario in laboratorio per studi di eco-immunologia e studi comparativi.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo riutilizzabile adattabile a diverse specie di lepidotteri e insetti imparentati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi sulle cellule immunitarie e riduce l'ambiguità meccanicistica nell'immunologia degli insetti.
- Valore operativo: Standardizza l'estrazione e il conteggio degli emociti per flussi di lavoro riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di tipo go/no-go nella ricerca immunologica basata sugli insetti e nei flussi di lavoro di eco-immunologia.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio dei modelli di insetti per studi funzionali e traslazionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio degli insetti e nelle tecniche di microdissezione.
- Necessita dell'accesso a microscopi stereoscopici e ottici, emocitometri e strumenti sterili.
- Richiede una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per le procedure di raccolta dei campioni e di conteggio cellulare.
- È adattabile a diverse specie di lepidotteri e insetti imparentati con modifiche minori.
- La resa del campione e la vitalità cellulare possono variare in base alla specie e allo stadio di sviluppo.
